UC患者PBMC中TLR4、NF-κB水平的變化及其臨床意義

馬永剛，高芙蓉，卞 巍

(1.武警浙江省總隊醫院嘉興醫院消化內科，浙江嘉興 314000；2.武警浙江省總隊醫院嘉興醫院放射科，浙江嘉興 314000；3.浙江省嘉興市婦幼保健醫院放射科 314000)

UC患者PBMC中TLR4、NF-κB水平的變化及其臨床意義

馬永剛1，高芙蓉2，卞 巍3

(1.武警浙江省總隊醫院嘉興醫院消化內科，浙江嘉興 314000；2.武警浙江省總隊醫院嘉興醫院放射科，浙江嘉興 314000；3.浙江省嘉興市婦幼保健醫院放射科 314000)

目的 探討潰瘍性結腸炎(UC)患者外周血單核細胞(PBMC)中TOLL樣受體(TLR)4、NF-κB水平的變化及在UC發病中的可能機制。方法 選取武警浙江省總隊醫院嘉興醫院消化科2014年1月至2015年1月收治的UC患者30例作為觀察組，另選取該院體檢科健康體檢者10例作為對照組。采用流式細胞儀檢測外周血 CD14+單核細胞表面 TLR4陽性表達率，RT-PCR檢測TLR4、髓樣分化因子88(MyD88)、NF-κB(P65) mRNA 表達水平，Western blot檢測TLR4、MyD88、NF-κB(P65) 蛋白水平。結果 觀察組外周血 CD14+單核細胞表面 TLR4 陽性表達率明顯高于對照組(P<0.05)；對照組TLR4、MyD88、NF-κB(P65) mRNA及蛋白水平明顯低于觀察組(P<0.01)；TLR4、MyD88、NF-κB(P65) 蛋白水平與UC嚴重程度呈正相關。結論 UC患者PBMC中TLR4、NF-κB明顯增高，臨床可通過檢測TLR4、NF-κB水平判斷UC的發展程度。

結腸炎，潰瘍性；單核細胞；TOLL樣受體4；NF-κB

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的一種，臨床主要表現為反復的腹痛、腹瀉、黏液血便、里急后重等，嚴重者可導致失血性休克[1]。UC 的發病機制與遺傳、感染、免疫異常、心理及環境等因素有關。目前的研究認為人體免疫功能的紊亂可能是UC病情發生、發展的主要影響因素，而TOLL樣受體(toll-like receptors，TLRs)可能與UC密切相關[2-3]。TLRs可啟動由髓樣分子因子88(MyD88)介導的NF-κB下游炎癥反應信號通路[4-6]。本研究比較健康者和UC患者TLR4、NF-κB表達水平的差異，探討TLR4、NF-κB在UC發病中的可能機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇武警浙江省總隊醫院嘉興醫院消化內科2014年1月至2015年1月收治的UC患者30例作為觀察組，其中男16例，女14例，年齡29～63歲，平均(40.82±8.32)歲，病程3個月至12年，平均(4.35±0.83)年。30例UC患者依據病情嚴重程度分為輕度組(n=8)、中度組(n=12)、重度組(n=10)。另選取該院體檢科正常體檢者10例作為對照組，其中男5例，女5例，年齡30～64歲，平均(35.02±11.22)歲，兩組對象性別、年齡比較，差異無統計學差異(P>0.05)。所有對象均簽署了知情同意書，對試驗內容了解。本研究獲得該院倫理委員會批準。30例UC患者均符合2007年5月濟南全國IBD研討會修訂的《對我國IBD診斷治療規范的共識意見》中的診斷標準?；颊吲懦哂衅渌陨砻庖咝约膊?，排除結核、肝炎、腫瘤等疾病，排除細菌性痢疾、阿米巴痢疾、慢性血吸蟲病、腸結核等感染性結腸炎。UC的分級標準參考《對我國IBD診斷治療規范的共識意見》，輕度：腹瀉低于4次/天，便血輕或無，無發熱、脈搏加快或貧血，紅細胞沉降率(ESR)正常。中度：腹瀉次數4～6次/天，便血輕中度。重度：腹瀉每天 6 次以上，伴明顯黏液血便，體溫高于 37.5 ℃，脈搏每分鐘90次以上，血紅蛋白(Hb)<100 g/L，ESR>30 mm/ h[7]。

表1 引物序列(5′-3′)

1.2 方法

1.2.1 主要儀器和試劑 T Gradient型PCR 儀(Biometra公司)；GIS 凝膠成像分析系統(上海天能科技有限公司)；冷凍高速離心機(德國Eppendor公司)；瓊脂糖水平電泳槽(北京六一儀器廠)；超低溫冰箱(日本三洋公司)；PCR 擴增試劑盒(Fermentas公司)；PCR 引物(上海生物工程有限公司)；Trizol(Invitrogen公司)；流式細胞儀(美國Becton dickinson公司);CD14-FITC(Miltenyi公司)。

1.2.2 標本采集及檢測方法 兩組對象均于清晨空腹采集靜脈血液，肝素抗凝，3 000 r/min分離獲得血漿，-80 ℃保存待測。利用密度梯度離心法分離外周血單核細胞(PBMC)，調整細胞濃度為1×106個/mL，接種于24孔板，細胞培養4 h后，洗脫未貼壁的細胞，獲得貼壁的PBMC。置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h后收獲細胞。采用雙色熒光法進行 CD14+單核細胞上 TLR4 陽性率的檢測，用 Cell Quest 軟件進行獲取和分析數據[8]。100 μL細胞懸液(5×105個/mL)，加入CD14-FITC，CD284-APC抗體各 10 μL，4 ℃避光孵育 30 min，PBS清洗2次，加入 300 μL PBS上機檢測。RT-PCR檢測：提取單核細胞RNA，依次加入RNA、Oligo(dT18)、雙蒸水，總體積為12.50 μL,65 ℃ 5 min，冰浴5 min，加入RNase 抑制劑、Buffer、d NTPs、M-Mu LV，42 ℃ 1 h，70 ℃ 10 min，冰浴 5 min，RT-PCR以 GAPDH 為作為內參基因，實時熒光試驗結果采用 2-ΔΔCT的數據統計方法分析基因的相對表達。引物序列見表1[9]。Western blot檢測：胰酶消化離心獲得細胞，加入冰預冷裂解緩沖液，高速冷凍離心機離心獲得蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濕法轉膜，封閉處理，加入抗體孵育，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫下孵育 2 h，將顯影液置于NC 膜上，凝膠成像儀成像。

2 結 果

2.1 兩組對象外周血CD14+單核細胞表面TLR4陽性表達比較 對照組外周血CD14+單核細胞表面TLR4陽性表達率為(0.09±0.02)%，觀察組外周血CD14+單核細胞表面TLR4陽性表達率為(1.80±0.06)%，觀察組外周血CD14+單核細胞表面TLR4陽性表達率明顯高于對照組(P<0.05)。

2.2 兩組對象PBMC表面TLR4、MyD88、NF-κB(P65) mRNA表達水平比較 對照組TLR4、MyD88、NF-κB(P65) mRNA水平明顯低于觀察組(P<0.01)，見表2。

表2 兩組對象PBMC表面TLR4、MyD88、NF-κB(P65) mRNA表達水平比較

a：P<0.01，與對照組比較。

2.3 兩組對象PBMC表面TLR4、MyD88、NF-κB(P65) 蛋白水平比較 對照組TLR4、MyD88、NF-κB(P65)蛋白水平明顯低于觀察組(P<0.01)，見表3。

表3 兩組對象PBMC表面TLR4、MyD88、NF-κB(P65) 蛋白水平比較

a：P<0.01，與對照組比較。

2.4 UC不同組別PBMC表面TLR4、MyD88、NF-κB(P65)蛋白表達水平比較 TLR4、MyD88、NF-κB(P65)蛋白表達水平與UC嚴重程度呈正相關，UC重度組TLR4、MyD88、NF-κB(P65)蛋白表達明顯高于UC輕、中度組(P<0.01)；UC中度組TLR4、MyD88、NF-κB(P65)蛋白表達明顯高于UC輕度組(P<0.01)，見表4。

表4 UC不同組別PBMC表面TLR4、MyD88、NF-κB(P65)蛋白表達水平比較

a：P<0.01，與UC重度組比較；b：P<0.01，與UC中度組比較。

3 討 論

UC是IBD的一種，是病因未明的、以侵犯結腸為主的慢性炎癥，該病病程長、易復發、與直結腸癌的發病有著重要聯系。西方國家，UC發病率為7/10萬人[10]；亞洲，UC發病率為1～2/10萬人。UC的發病機制尚未明確，環境、遺傳、感染和免疫因素相結合導致腸道黏膜炎癥，然后黏膜病變，黏膜修復。盡管發病機制尚未明確，機體免疫系統對腸道正常菌群的免疫反應異常是其發病的重要因素[11]。

哺乳動物中已發現的TLRs有13種，其中，人類至少有10種。TLRs表達在各種免疫細胞上，其中TLR4主要表達于單核-巨噬細胞、樹突狀細胞表面，TLR4通過選擇性識別PAMPs[如脂多糖(LPS)、鞭毛蛋白和微生物核酸等],觸發MyD88依賴性和非依賴性途徑，最終活化NF-κB，導致腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β等炎性細胞因子及趨化因子的釋放，誘導炎癥的發生[12-13]。TLR4識別的外源性配體主要為脂多糖，內源性配體主要包括壞死細胞、熱休克蛋白等?；罨耐ㄟ^信號轉導介導腸道黏膜的免疫反應[14]。

本研究比較了健康者與UC患者之間PBMC的TLR4、MyD88和NF-κB(P65)表達差異，UC患者TLR4、MyD88和NF-κB(P65)無論在基因水平還是蛋白水平均明顯高于對照組，說明TLR4和NF-κB(P65)與UC的發病相關。TLR4表達異?？赡芘cLPS耐受有關，UC腸道菌群失調，宿主腸黏膜對LPS的耐受性降低，外周血TLR4大量表達，并與LPS結合，激活TLRS-MyD88-IRAK-NF-κB(P65)的轉導途徑，募集炎性細胞，釋放自由基，損傷黏膜[15]。在進一步的分析中，TLR4、MyD88、NF-κB(P65)蛋白表達水平與UC嚴重程度呈正相關，表明TLR4、MyD88和NF-κB(P65)表達水平可反映UC的活動情況，有助于判斷患者的病情發展情況。

綜上所述，TLR4、MyD88和NF-κB(P65)參與了UC的發生、發展，臨床可通過檢測TLR4、MyD88和NF-κB(P65)水平判斷UC患者的疾病發展情況，并將信號通路作為UC的潛在治療靶點。

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Changes and clinical significance of TLR4 and nuclear factor kappa B in peripheral blood mononuclear cells of patients with ulcerative colitis

MaYonggang1,GaoFurong2,BianWei3

(1.DepartmentofInternalMedicine;2.DepartmentofRadiology,JiaxingHospitalofZhengjiangProvincialArmedPoliceCorpsHospital,Jiaxing,Zhejiang314000,China;3.DepartmentofRadiology,JiaxingMaternalandChildHealthCareHospital,Jiaxing,Zhejiang314000,China)

Objective To investigate the changes of TLR4 and nuclear factor kappa B(NF-κB) levels in peripheral blood mononuclear cells(PBMC) of the patients with ulcerative colitis(UC) and its possible pathogenesis mechanism.Methods In our hospital from January 2014 to January 2015,30 cases of UC were selected as the observation group,and other 10 individuals undergoing healthy physical examination in this hospital were selected as the control group.Flow cytometry was used to detect the positive expression rate of TLR4 on surface of peripheral blood CD14+mononuclear cells.The levels of TLR4,MyD88,NF-κB(P65) mRNA expression were detected by RT-PCR.Western blot was adopted to detect the levels of TLR4,MyD88,NF-κB(P65) protein.Results The positive expression rate of TLR4 on the surface of peripheral blood CD14+mononuclear cells in the observation group was significantly higher than that in the control group(P<0.05);the levels of TLR4,MyD88 and NF-κB(P65) B mRNA and protein in the control group were significantly lower than those in the observation group(P<0.05);the levels of TLR4,MyD88 and NF-κB(P65) protein were positively correlated with the severity of UC.Conclusion The levels of TLR4 and NF-κB in PBMC of the patients with UC are significantly increased,clinic can judge the UC development degree by detecting TLR4 and NF-κB levels.

colitis,ulcerative;monocytes;toll-like receptor 4;NF-kappa B

馬永剛(1975-)，主治醫師，本科，從事消化內科疾病的診治研究。

0.3969/j.issn.1671-8348.2017.18.023

R574.1

A

1671-8348(2017)18-2515-03

2017-01-01

2017-03-16)