鋅離子對人臍靜脈內皮細胞的影響

張曉蕾，任巖春，趙永峰，胡喜田，徐雷，安少波，吳志宏

? 論著 ?

鋅離子對人臍靜脈內皮細胞的影響

張曉蕾1，任巖春1，趙永峰1，胡喜田1，徐雷1，安少波1，吳志宏1

目的 探究氯化鋅（ZnCl2）對人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）的影響。方法 體外培養HUVECs，氯化鋅濃度6～34 μM分別處理細胞，MTS檢測生長活性，篩選促細胞增殖的最佳濃度作為實驗組濃度。實驗組和對照組（未處理）流式細胞術檢測HUVECs凋亡情況；鬼筆環肽-異硫氰酸熒光素（FITC）染色檢測HUVECs骨架重構；Transwell小室檢測HUVECs遷移和侵襲；Real-time PCR檢測細胞遷移相關蛋白基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）mRNA相對表達水平；明膠酶譜法檢測MMP-2、MMP-9的活性；ELISA法檢測HUVECs上清液MMP-2、MMP-9水平。結果 與對照組相比，濃度范圍在10～22 μM內ZnCl2處理的細胞，其相對增殖率升高，差異具有統計學意義（P均＜0.05）。選取促進HUVECs增殖的最佳濃度14 μM作為實驗組濃度。實驗組的HUVECs凋亡率為（12.02 ±0.84）%，高于對照組的（4.05±0.52）%，差異有統計學意義（P＜0.01）。實驗組HUVECs細胞遷移個數為（112.20±10.83）個，高于對照組的（94.80±9.50）個，差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗組HUVECs細胞侵襲個數高于對照組，[（36.20±3.22）個 vs. （32.80±1.07）個]，差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗組HUVECs細胞遷移相關蛋白MMP-2和MMP-9的mRNA相對表達水平高于對照組，差異有統計學意義（P均＜0.05）。實驗組細胞遷移相關蛋白MMP-2的光密度值顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；實驗組細胞MMP-9的光密度值高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗組細胞上清液中MMP-2和MMP-9的吸光度值高于對照組，差異有統計學意義（P均＜0.05）。結論 14 μM氯化鋅處理HUVECs，使其處于增殖和凋亡平衡的生長活躍狀態，并且促進HUVECs骨架重塑和細胞遷移。

鋅離子；人臍靜脈內皮細胞；增殖；凋亡；遷移

1 材料與方法

1.1 MTS檢測細胞生長活性 本研究所用細胞為人臍靜脈內皮細胞（HUVECs），購自中科院上海生命科學研究院細胞資源中心，將HUVECs細胞株復蘇，在37℃、5%CO2培養箱中培養，當細胞融合80%時，傳代。HUVECs用DMEM培養基培養（10%胎牛血清和1%青鏈霉素）（Gibco，美國），生長密度為90%左右時，進行細胞計數，按實驗分組接種于96孔板中，每孔細胞數為5× 103個（n=5），接種后置于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h，加氯化鋅（Sigma-Aldrich 公司，德國）處理，分別加入6 μM、10 μM、14 μM、18 μM、22 μM、26 μM、30 μM、34 μM，對照組未加入氯化鋅。將培養板置于培養箱中培養48 h，每孔加入20 μl MTS（Promega，美國），37℃孵育4 h。利用酶標儀（Thermo Scientific，美國）測定波長在490 nm處的OD值，再計算細胞相對增殖率（實驗組OD值/對照組OD值×100%）。

1.2 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集生長密度為90%左右的HUVECs，進行細胞計數，按實驗組（14 μM）和對照組將細胞接種于6孔板內，接種密度為4×105個/孔，于37℃、5%CO2培養箱內培養48 h。細胞1500 rpm離心5 min，棄上清，PBS洗滌細胞2次，離心收集細胞，留取約100 μl PBS，每管細胞樣品中加入500 μl Binding Buffer使細胞重新懸浮。加入5 μl AnnexinV-FITC和5 μl Propidium Iodide（Cytoskeleton，美國）混勻。在室溫下，避光孵育15 min。進行FACS Calibur流式細胞術（BD，美國）檢測細胞凋亡。

1.3 Phalloidin-FITC 熒光染色檢測細胞骨架重構 氯化鋅處理后的實驗組和對照組制備細胞爬片，首先用PBS（Hyclone，美國）清洗，再用4%多聚甲醛室溫固定5 min，PBS清洗細胞3次，使用Acti-stainTM 488 Fluorescent Phalloidin（Cytoskeleton，美國）孵育玻片1 h，DAPI染核。OLYMPUS BX53熒光共聚焦顯微鏡（奧林巴斯，日本）在數碼相機圖像系統（PIXERA PRO600CL，USA）下拍照（×400），并且測量胞外體的長軸、短軸參數，測得長軸/短軸值。

1.4 Transwell小室檢測細胞遷移 取生長密度為90%左右的HUVECs，將培養基換為無血清培養基（Gibco，美國），并加入濃度為10 μg/ml的絲裂霉素C處理2 h。PBS清洗3次，0.25%胰蛋白酶消化細胞后，制成單細胞懸液。細胞計數后，加入培養液把細胞稀釋成4×104個/ml的細胞懸液以備用。將Transwell小室放到24孔板中，下室加入含20%胎牛血清的培養液800 μl。按實驗組和對照組分別取細胞懸液200 μl加入到上室，細胞數均為8000個/孔。將培養板于37℃、5%CO2培養箱中培養48 h。將Transwell小室用PBS清洗1次，在室溫下，利用多聚甲醛固定20 min，0.5%結晶紫染色5 min，之后用蒸餾水沖洗干凈。對遷移至微孔膜下層的細胞利用OLYMPUS IX51倒置顯微鏡（奧林巴斯，日本）在CellSens Standard系統下（200×）進行計數。每個樣本選取5個視野，取均數。

1.5 Transwell小室檢測細胞侵襲 取生長密度為90%左右的HUVECs，將培養基換為無血清培養基（Gibco，美國），并加入濃度為10 μg/ml的絲裂霉素C處理2 h。Matrigel 膠4℃過夜解凍，將Matrigel膠置冰上放入超凈臺，用無血清培養基將膠按照1：2稀釋。取出 Transwell小室放入到24孔板中，用45 μl預先稀釋好的Matrigel膠包被小室膜，于培養箱放置2 h使膠凝固。將HUVECs制成單細胞懸液，細胞計數后，加入培養液把細胞稀釋成1×105個/ml的細胞懸液備用。將已包被好的Transwell小室放入24孔板中，下室加入含20%的胎牛血清培養液800 μl。按實驗組和對照組細胞懸液200 μl分別加入上室，細胞數均為2×104個/孔。37℃、5%CO2細胞培養箱中培養48 h。將Transwell小室用PBS清洗1次，在室溫下，利用多聚甲醛固定20 min，0.5%結晶紫染色5 min，之后用蒸餾水沖洗干凈。對遷移至微孔膜下層的細胞在OLYMPUS IX51倒置顯微鏡（奧林巴斯，日本）CellSens Standard系統下（200×）進行計數。每個樣本選取5個視野，取均數。

1.6 Real-time PCR檢測mRNA水平的表達 按照Trizol試劑說明書提取各組細胞的總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，進行熒光定量PCR?；|金屬蛋白酶-2（MMP-2）上游引物序列：5′-TGA TCT TGA CCA GAA TAC CAT CGA- 3′，下游引物序列：5′-GGC TTG CGA GGG AAG AAG TT-3′；基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）上游引物序列：5′-CCT GGA GAC CTG AGA ACC AAT C-3′，下游引物序列：5′-GGC TTG CGA GGG AAG AAG TT-3′；β-actin上游引物序列：5′- CTT AGT TGC GTT ACA CCC TTT CTT G-3′，下游引物序列：5′- CTG TCA CCT TCA CCG TTC CAG TTT-3′。反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火20 s，72℃延伸60 s。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成。所有數據均采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。實驗重復3次。

1.7 明膠酶譜法檢測MMP-2、MMP-9活性 首先進行蛋白質抽提，將含有1% PMSF的預冷PBS緩沖液加入實驗組和對照組的細胞中，并置于冰上，連續吹打細胞。在4℃下進行離心，12 000 rpm離心10 min，收集上清。利用BCA蛋白質定量試劑盒測定濃度。配置分離膠，本次研究所使用的分離膠濃度為10%（含1.0 mg/ml明膠），配置5%濃縮膠，上樣量為30 μg。70V恒壓冰浴電泳2.5 h。電泳結束后，利用洗脫液將凝膠洗脫 40 min×2次，再利用漂洗液漂洗20 min×2次，在37℃下，將膠放入孵育液中孵育40 h。孵育結束后，用染色液將凝膠染色3 h，再利用脫色液A、B、C分別脫色0.5 h、1 h、2 h。天能Tanon 5500全自動成像分析系統拍照并分析。

1.8 ELISA法檢測細胞上清液MMP-2、MMP-9水平 取實驗組和對照組培養48 h后的細胞上清液，將上清液稀釋20倍，利用ELISA試劑盒（北京達科為生物技術有限公司）檢測MMP-2、MMP-9水平。加樣、溫育、加酶、顯色等步驟后，每孔加入5 μl終止液終止反應。使用酶標儀（賽默飛，美國）讀取450 nm波長處的OD值。用空白孔調零，繪制標準曲線，橫坐標為標準品的濃度，縱坐標為調零后的OD值。

1.9 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTS檢測細胞生長活性結果 氯化鋅濃度6 ～34 μM分別處理HUVECs，與對照組相比，濃度范圍在10～22 μM內的細胞，其相對增殖率升高，差異具有統計學意義（P均＜0.05），高于22 μM出現細胞死亡（圖1）。選取促進HUVECs增殖的最佳濃度14 μM，作為后續研究相關指標的實驗組濃度。

2.2 流式細胞術檢測細胞凋亡結果 實驗組的HUVECs凋亡率為（12.02±0.84）%，高于對照組的（4.05±0.52）%，差異有統計學意義（P＜0.01）（圖2）。14 μM氯化鋅處理的實驗組雖然細胞凋亡率高于對照組，但綜合MTS實驗結果，說明實驗組HUVECs處于生長活躍狀態。

2.3 HUVECs細胞骨架重構檢測 通過熒光顯微鏡檢測HUVECs在對照組和實驗組的骨架重構情況，結果顯示，實驗組的HUVECs長短/短軸比值高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖3）。

2.4 Transwell小室細胞遷移檢測結果 實驗組HUVECs細胞遷移個數為（112.20±10.83）個，高于對照組的（94.80±9.50）個，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖4）。

圖1 不同濃度鋅離子處理組的增殖情況（與對照組比較，aP＜0.05，n=5）

圖2 對照組和實驗組細胞凋亡情況（與對照組比較，bP＜0.01，n=3）

圖3 對照組和實驗組細胞骨架成像以及長軸/短軸比值（400×，與對照組比較，aP＜0.05，n=3）

圖4 Transwell小室檢測HUVECs細胞遷移結果（200×）

2.5 Transwell小室細胞侵襲檢測結果 實驗組HUVECs細胞侵襲個數為（36.20±3.22）個，對照組為（32.80±1.07）個，實驗組高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖5）。

2.6 Real-time PCR檢測細胞遷移相關基因的相對表達量 實驗組細胞遷移相關基因MMP-2和MMP-9的mRNA 相對表達水平高于對照組，差異有統計學意義（P均＜0.05）（圖6）。

2.7 細胞遷移相關蛋白活性檢測結果 實驗組細胞遷移相關蛋白MMP-2的光密度值顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；實驗組細胞 MMP-9的光密度值高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖7）。

圖5 Transwell小室檢測細胞侵襲結果（200×）

圖6 對照組和實驗組MMP-2、MMP-9 mRNA的相對表達量（與對照組比較，aP＜0.05，n=3）

2.8 細胞上清液MMP-2、MMP-9水平比較 實驗組細胞上清液中細胞遷移相關蛋白MMP-2的吸光度值為（74.64±4.15），對照組為（39.99± 3.94），實驗組高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；實驗組MMP-9的吸光度值為（99.37 ±6.20），顯著高于對照組的（39.99±3.94），差異有統計學意義（P＜0.05）（圖8）。

圖7 對照組和實驗組細胞遷移相關蛋白活性比較（與對照組比較，aP＜0.05，n=3）

圖8 對照組和實驗組MMP-2、MMP-9水平比較（與對照組比較，aP＜0.05，n=3）

3 討論

對于冠心病患者，現在臨床上主要的治療方法是在球囊擴張術的基礎上，實施冠狀動脈支架置入手術。316L不銹鋼金屬支架材料、317L不銹鋼金屬支架材料和L605等[8]鈷基合金以及Ti6A14V等鈦合金是臨床上主要應用的心臟血管支架材料[9]，鎳元素作為不銹鋼金屬支架材料中的重要元素，有一定的致敏性[10]，支架材料中鎳離子的釋放可以引起血管內皮細胞的過度增殖，造成管壁的再狹窄，成為這種老型支架材料的瓶頸問題。

鋅合金是目前研究較多的合金材料，然而，鋅合金支架以及鎂合金支架材料中的鋅離子的確切濃度標準并沒有明確，對于人血管內皮細胞的影響也未見相關文獻報道。張震等[11]提出Mg-6%Zn合金浸提液能夠促進細胞增殖，但是不能排除浸提液中鋅離子的影響，本研究分析了鋅離子對細胞凋亡的影響。在外周血清中，通過原子吸收法測得正常離子濃度范圍11.6～23.0 μM，篩選最佳鋅離子濃度，發現14 μM鋅離子處理的HUVECs增殖和凋亡處于一個平衡的活躍狀態。細胞骨架不僅在維持細胞整體結構，承受外力、保持細胞內部結構方面起重要作用，而且在細胞鋪展、遷移和侵襲等方面都發揮了重要作用[12]。本研究結果顯示，實驗組的HUVECs發生了細胞骨架重構現象。支架置入后，如果表現良好則周圍組織的血管內皮細胞爬行到支架表面，因此又檢測了HUVECs的細胞遷移和侵襲能力，實驗組氯離子干預后能夠促進HUVECs的細胞遷移和侵襲。于敏等[13]指出Mg-6%Zn提取液稀釋成10%，50%，100%濃度培養L-929細胞，細胞形態學沒有差異，這可能是由于離子濃度不同或者是細胞不同所引起的。

MMP是由多種鋅離子依賴性酶組成的能降解細胞外基質的重要酶，幾乎能降解細胞基質的所有成分，像纖維黏連蛋白、蛋白多糖、黏性蛋白等[14]，細胞侵襲的主要物理屏障是細胞外基質及基底膜。MMPs在細胞侵襲過程中發揮關鍵的作用[15]。本研究發現實驗組能夠促進和誘導MMPs的表達并保持較高活性，據本課題組所了解的資料，國內外尚無此類報道。

本研究通過MTS、transwell小室等實驗方法，初步探究了鋅離子對人血管內皮細胞相關生物學功能的影響，為支架材料的降解和支架置入后再狹窄以及新型可降解鋅合金心血管支架材料的開發提供了理論依據。

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本文編輯：姚雪莉

Influence of zinc ion on human umbilical vein endothelial cells

ZHANG Xiao-lei*, REN Yan-chun, ZHAO Yong-feng, HU Xi-tian, XU Lei, AN Shao-bo, WU Zhi-hong.*Department of Cardiovascular Diseases, First Hospital of Shijiazhuang City, Shijiazhuang 050000, China.

Objective To study the influence of zinc chloride (ZnCl2) on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Methods HUVECs were in vitro cultured and treated with ZnCl2respectively in doses from 6 μM to 34 μM. The growth activity was detected by using MTS test for screening the best dose of ZnCl2to promote HUVECs proliferation as test group dose. The apoptosis of HUVECs was detected by using flow cytometry in test group and control group (without ZnCl2treating). The cytoskeleton remodeling of HUVECs was detected after FITCPhalloidine staining. The migration and invasiveness of HUVECs were detected by using Transwell chamber test. The relative expressions of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) mRNA and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) mRNA were detected by using real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR). The activities of MMP-2 and MMP-9 were detected by using gelatin zymography. The levels of MMP-2 and MMP-9 in HUVECs supernatant were detected by using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results The relative growth rate (RGR) of HUVECs treated with ZnCl2in doses from 10 μM to 22 increased in test group compared with control group (all P<0.05). The best dose of ZnCl2(14 μM) to promote HUVECs proliferation was chosen as test group dose. The apoptosis rate of HUVECs was (12.02±0.84)% in test group and (4.05±0.52)% in control group (P<0.01). The migration numbers of HUVECs were (112.20±10.83) in test group and (94.80±9.50) in control group (P<0.05). The invasiveness numbers of HUVECs were higher in test group than those in control group [(36.20±3.22) vs. (32.80±1.07), P<0.05]. The expressions of MMP-2 mRNA and MMP-9 mRNA of HUVECs were higher in test group than those in control group (all P<0.05). The optical density (OD) value of MMP-2 was significantly higher in test group than that in control group (P<0.05). The OD value of MMP-9 was higher in test group than that in control group (P<0.05). The absorbance values of MMP-2 and MMP-9 in HUVECs supernatant were higher in test group than those in control group (all P<0.05). Conclusion HUVECs, treated with ZnCl2(14 μM), are in an active statement of growth with the balance of proliferation and apoptosis, and their cytoskeleton remodeling and migration are promoted.

Zinc ion; Human umbilical vein endothelial cells; Proliferation; Apoptosis; Migration冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┦怯捎诠跔顒用}血管血小板、炎癥因子聚集[1]，導致的粥樣硬化病變，管腔狹窄，造成心肌缺血、缺氧[2]。冠狀動脈介入治療已成為冠心病的主要治療手段[3]，但是目前應用最廣泛的是以316L和317L為主的不銹鋼金屬支架，在成功置入支架后部分患者會發生管腔再狹窄[4]。因此研發新型支架材料，對于治療冠心病具有重要的臨床意義。鋅合金為新型血管支架材料研發提供了新思路。鋅是人體必需元素，易被人體吸收，無毒副作用[5]。鋅還是蛋白質、核酸合成酶的成分，是上百種酶的活性中心，能促進細胞更新[6]。鋅元素可以添加到鎂合金中，對鎂合金有固溶強化和時效強化的雙重功效，能夠提高鎂合金的力學性能[7]。鋅鎂合金作為新型可降解金屬支架材料，能夠釋放鎂離子和鋅離子，與氯離子共存時，更易發生腐蝕，并在體內以緩慢腐蝕的方式完全降解，其產物對人體無毒、無害，且參與人體正常代謝。然而鋅離子對人血管內皮細胞生物學功能的影響尚不清楚。本研究通過MTS實驗、流式細胞術、Transwell小室、Real-time PCR、明膠酶譜、ELISA等方法，分析鋅離子對人血管內皮細胞增殖、凋亡等影響，旨在為臨床支架研發和置入提供依據。

R543.6

A

1674-4055(2017)06-0677-05

石家莊市科技計劃(141462823)

1050000 石家莊,石家莊市第一醫院心血管內科

10.3969/j.issn.1674-4055.2017.06.10