蛋白激酶PLK4對人腦膠質瘤增殖的影響*

張作鑫 周俊虎 韓磊

·基礎研究·

蛋白激酶PLK4對人腦膠質瘤增殖的影響*

張作鑫 周俊虎 韓磊

目的：分析蛋白激酶PLK4表達與膠質母細胞瘤患者預后相關性以及對人膠質瘤細胞增殖活性的影響。方法：基于CGGA數據庫評估PLK4表達與膠質瘤患者病理級別和預后的關系；構建靶向PLK4基因的小分子干擾RNA，運用qPCR和Western blot法檢測轉染效率；利用MTT和平板克隆形成實驗評價PLK4對腫瘤細胞增殖活性的影響。結果：PLK4的表達水平隨樣本病理級別的上升而增加，并且與膠質瘤患者總生存期和高級別膠質瘤患者的預后緊密相關；MTT和平板克隆形成實驗結果顯示敲低PLK4表達后腫瘤細胞增殖能力明顯減弱。結論：PLK4的表達與膠質瘤患者的預后緊密相關，并能夠影響腫瘤細胞的增殖活性。因此，PLK4可能是膠質瘤治療的潛在靶點。

膠質瘤 蛋白激酶 PLK4 增殖

PLK4是Polo樣蛋白激酶家族中的一員，與該家族其他蛋白激酶不同，其羧基端僅有1個Polo結合域，該蛋白是調節中心粒擴增以及有絲分裂的1個關鍵因子［1］。研究表明，在正常增殖的細胞中，PLK4是一種處于低水平表達的絲/蘇氨酸蛋白激酶，而在乳腺癌等許多腫瘤中，PLK4的活性明顯異常［2］。PLK4蛋白的異常表達可能導致中心粒數目及結構的異常，從而導致腫瘤細胞有絲分裂能力的改變。同時，PLK4還可能是預測腫瘤患者預后的一個因子［3］。然而，PLK4在人腦惡性膠質瘤中的表達情況以及與患者預后的相關性尚不清楚。本研究基于CGGA患者樣本數據庫分析PLK4表達與膠質瘤患者病理級別及預后的相關性和RNAi敲低膠質母細胞瘤細胞系PLK4表達后分析腫瘤細胞增殖能力的變化，從而探討PLK4與膠質瘤患者預后以及對腫瘤細胞增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 膠質瘤樣本數據庫使用CGGA mRNA表達譜數據庫（http：//www.cgcg.org.cn），其中患者標本Ⅱ級121例，Ⅲ級50例，Ⅳ級127例。分析不同級別患者組織樣本中PLK4的表達情況，并根據PLK4的表達水平分析患者生存期并繪制Kaplan-Meier曲線。

1.1.2 主要試劑靶向PLK4的siRNA由蘇州吉瑪基因股份有限公司代為構建。序列1：5'-ACTCCTTTCAGA CATATAAG3'；序列2：5'-AACTATCTTGGAGCTTTATA A-3'；NC序列：5'-TTCTCCGAACGTGTCACGC-3'。人腦惡性膠質瘤細胞系：U87、U251、LN229和人胚腎細胞均購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。U87Ⅷ細胞系為哈爾濱醫科大學任歡教授饋贈，由本實驗室常規培養；細胞培養所用的DMEM、MEM培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Thermo Fisher公司；Trizol RNA提取及轉染試劑Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司；RT-qPCR系統試劑盒購自美國Promega公司；PLK4抗體購自美國Abcam公司；GAPDH抗體及辣根酶標記二抗均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；ECL檢測系統及PVDF膜購自美國Milipore公司；MTT粉末、4%多聚甲醛、結晶紫染液、DMSO均購自北京索萊寶生物科技公司；細胞培養板購自美國NEST公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養U87、LN229、U87Ⅷ、HEK293T采用含10%胎牛血清的DMEM培養基、U251采用含10%的MEM培養基于37℃，5%CO2溫箱培養。

1.2.2 實驗分組陰性對照處理組（negative con?trol），siRNA序列1處理組（PLK4 RNAi 1#），siRNA序列2處理組（PLK4 RNAi 2#）。轉染前1 d，取6孔板，每孔種植細胞2×105個/mL，過夜培養。待第2天細胞密度為70%～90%時，吸棄培養基，加入無血清培養基1 mL/孔，按照產品說明加入相應量轉染試劑Lipo?fectamine 3000及siRNA，6 h后換新鮮含10%血清培養基繼續培養，24～48 h后分析轉染細胞。

1.2.3 qPCR法分析PLK4 mRNA表達水平采用Trizol法提取細胞總RNA，加入逆轉錄酶在42℃，60 min條件下進行逆轉錄形成cDNA，加入特異性PLK4基因引物，進行PLK4基因擴增實驗，以GAPDH基因作為內參照。PLK4上游引物序列：5'-GACACCTCAGA CTGAAACCGTAC-3'；下游引物序列：5'-GTCCTTCT GCAAATCTGGATGGC-3'；GAPDH上游引物序列：5'-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3'；下游序列：5'-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3'。

1.2.4 Westernblot法測定PLK4蛋白水平的變化轉染后細胞繼續培養48 h后，用RIPA裂解液提取總蛋白，加熱煮沸使蛋白變性，80 V下電泳90 min，冰浴中80 V轉膜90 min。37℃封閉1 h，一抗4℃孵育過夜（1∶1 000），二抗室溫孵育1 h（1∶2 000）。ECL檢測系統根據產品說明書進行。

1.2.5 MTT法檢測細胞增殖將膠質瘤細胞以3×103/mL的密度接種于96孔板，每組細胞設8個復孔。根據Lipofectamine 3000產品說明書進行轉染實驗。37℃，5%CO2溫箱孵育。從轉染后第1天開始，以后每天固定時間取出96孔板，于相應孔中加入MTT溶液20 μL（5 mg/mL），共計5 d。37℃條件下再培養4 h，棄上清，加DMSO 150 μL/孔，搖床震蕩20 min，酶標儀測490 nm波長各孔吸光值。

1.2.6 平板克隆形成實驗轉染后48 h，收集細胞、計數，以2×102/mL接種于6孔板，每組細胞設3個復孔，加入含血清培養基2 mL。37℃、5%CO2溫箱孵育2～3周，每周固定換液。鏡下觀測到每個單克隆含有50個以上細胞時終止培養，以4%多聚甲醛固定30 min，加入結晶紫染液染色30 min，計數平板上各組細胞形成的肉眼可見的克隆數。

1.3 統計學分析

采用SPSS 11.0軟件進行統計學分析。圖像分析應用Bandscan軟件、采用方差分析、χ2檢驗進行分析。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 膠質瘤患者中PLK4的表達水平與患者病理級別和預后的相關性分析

通過對CGGA數據庫中298例不同級別國人膠質瘤樣本mRNA表達譜分析發現，PLK4 mRNA的表達水平與膠質瘤病理級別呈正相關；總體生存期分析發現，低表達PLK4的患者總生存期較高表達PLK4的患者明顯延長（P＜0.000 1），并且在高級別膠質瘤患者中PLK4表達與患者預后明顯相關（P＜0.000 1），但是在低級別膠質瘤患者中，PLK4表達與患者預后無顯著性相關（P＞0.05，圖1）。

2.2 不同膠質瘤細胞系PLK4 mRNA表達水平

應用qPCR方法對4種膠質母細胞瘤（glioblasto?ma，GBM）細胞系PLK4 mRNA表達水平進行了定量分析（圖2）。與對照組（HEK293細胞系）相比，PLK4在U87細胞系中的相對表達量約為對照組細胞的4.42倍，在LN229、U251和U87Ⅷ細胞系中PLK4的相對表達量分別為對照組細胞的3.76、2.84和1.53倍。2.3qPCR檢測RNAi后目的基因mRNA水平的表達

應用qPCR方法對U87、LN229細胞系PLK4 mRNA表達水平進行定量分析（圖3）。U87細胞系中，與NC組相比，2個siRNA序列敲低PLK4表達后，PLK4 mRNA的相對表達量分別為對照組的0.54倍（RNAi 1#）和0.26倍（RNAi 2#）；LN229細胞系中，與NC組相比，2個siRNA序列敲低PLK4表達后，PLK4 mRNA的相對表達量分別為對照組的0.41倍（RNAi1#）和0.17倍（RNAi 2#）。

2.4 Western blot檢測RNAi后目的基因蛋白水平的表達

Western blot實驗結果顯示，U87細胞系中，RNAi 1#處理組PLK4蛋白條帶灰度值為NC組的0.35倍；RNAi 2#處理組PLK4蛋白條帶灰度值為NC組的0.14倍；LN229細胞系中，RNAi 1#處理組PLK4蛋白條帶灰度值為NC組的0.58倍；RNAi 2#處理組PLK4蛋白條帶灰度值為NC組的0.35倍（圖4）。表明與NC組細胞相比，兩個RNAi處理組細胞中PLK4蛋白的表達量顯著降低。

2.5 MTT實驗

MTT分析結果發現，U87和LN229細胞系中，與NC組細胞相比，RNAi 1#和2#處理組細胞自第2天起增殖能力顯著減弱（圖5），且各組之間增殖速率的差異具有統計學意義（P＜0.05），表明敲低PLK4后腫瘤細胞增殖能力明顯減弱。

2.6 平板克隆形成實驗

平板克隆形成實驗分析結果發現，U87細胞系中，NC組細胞形成集落51個，RNAi 1#處理組細胞形成集落30個，RNAi 2#處理組細胞形成集落17個；LN229細胞系中，NC組細胞形成集落70個，RNAi 1#處理組細胞形成集落30個，RNAi 2#處理組細胞形成集落24個，兩種細胞形成集落能力明顯低于NC組，差異具有統計學意義（P＜0.001），表明敲低PLK4后腫瘤細胞增殖能力明顯減弱（圖6）。

圖1 CGGA數據庫分析PLK4表達與膠質瘤患者病理級別和生存期的關系Figure 1Correlation of PLK4 expression with the survival of patients with glioma of different pathological grades was analyzed using the CGGA dataset

圖2 利用qPCR檢測不同膠質瘤細胞系中PLK4 mRNA的表達水平Figure 2PLK4 expression levels in different glio‐ma cell lines were measured by qPCR analysis

圖3 qPCR法檢測各處理組細胞PLK4基因mRNA水平的變化Figure 3PLK4 mRNA levels in several treated groups were determined by qPCR analysis af‐ter silencing PLK4 with siRNAs

圖4 Western blot檢測各處理組細胞PLK4基因蛋白水平的變化Figure 4PLK4 protein levels in treated groups were detect‐ed by Western blot analysis

圖5 MTT法分析各處理組細胞的增殖活力Figure 5Proliferation of cells in treated groups was analyzed by MTT assay

圖6 平板克隆實驗檢測各處理組細胞的增殖活力Figure 6Glioma cells were transfected with PLK4‐targeted siRNAs and subjected to colony formation assay to assess proliferation ability

3 討論

蛋白激酶是一類能夠催化ATP上的γ-磷酸轉移到蛋白質分子中如絲氨酸、蘇氨酸殘基羥基、酪氨酸殘基酚羥基等氨基酸殘基上的磷酸轉移酶。蛋白質的磷酸化及去磷酸化可以導致細胞生物信號的啟動及傳遞，而細胞中信號異常通路轉導及改變則可能導致腫瘤的發生及發展［4］。研究發現激酶與惡性膠質瘤的發生密切相關［5］，激酶還可以調節DNA甲基化［6］，組蛋白修飾［7］，染色質重構［8］，在膠質瘤的惡性進展中也發揮著重要的作用。PLK4是繼PLK1-3發現之后又1個Polo樣蛋白激酶，其定位于中心粒上，與中心粒的擴增有著密切的聯系［9］。中心粒的穩定和正常復制在保持遺傳的穩定性和協調聯系細胞其他活動中起著關鍵作用［10］；細胞有絲分裂啟動后，位于母中心粒上的PLK4蛋白激活，促使下游調控因子Sas-6、γ-tubulin、CEP-135、CP110等蛋白募集到母中心粒上完成中心體的組裝，使中心體逐漸成熟［11］。通常情況下，在細胞周期G1/S轉變期，以母中心粒為模板進行中心粒復制，在G2/M轉變期，中心粒成熟，在有絲分裂前期，中心體逐漸移向細胞兩極，隨著細胞分裂，每個子代細胞獲得一個中心體，從而完成有絲分裂。腫瘤細胞中經常發生中心粒結構與數目的異常，常常伴隨著細胞分裂的缺陷與基因組的不穩定［12］。中心粒的異?？梢詫е氯旧w分裂紊亂，干擾細胞正?；顒?，導致腫瘤發生。Habedanck等［13］發現在骨肉瘤U2OS細胞中轉染野生型PLK4后，細胞內中心粒數目＞2個，而轉染催化失活型PLK4的細胞僅2個中心粒；用RNAi技術敲低人宮頸癌HeLa細胞中PLK4基因時，中心粒少于2個的細胞比例明顯增多，由此推測抑制PLK4的活性可能會使細胞的增殖能力減弱。

本研究對中國人膠質瘤CGGA mRNA數據庫分析發現，PLK4 mRNA的表達與膠質瘤級別呈正相關，并與膠質瘤患者和高級別膠質瘤患者的預后呈負相關。本研究還發現使用RNAi技術在膠質母細胞瘤細胞系中敲低PLK4表達后，通過MTT和克隆形成實驗發現腫瘤細胞的體外增殖能力明顯減弱，因此蛋白激酶PLK4可能是膠質瘤的潛在治療靶點。但是PLK4被敲低后，引起惡性膠質瘤細胞增殖能力的下降所涉及的分子機制目前還鮮有報道，其是否通過參與腫瘤細胞中心粒擴增進而影響細胞周期進展和有絲分裂，及其與其他腫瘤生物學惡性表型的關系有待于進一步研究。

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（2017‐03‐15收稿）

（2017‐05‐11修回）

Effect of kinase PLK4 on the proliferation of glioma cells in vitro

Zuoxin ZHANG,Junhu ZHOU,Lei HAN

Lei HAN;E‐mail:superhanlei@hotmail.com
Department of Neurosurgery,Tianjin Medical University General Hospital,Lab of Neuro‐Oncology,Tianjin Neurological Institute,Key Laboratory of Post‐Neuro‐Injury Neuro‐Repair and Regeneration in Central Nervous System,Ministry of Education and Tianjin City,Tianjin 300052,China

Objective:To analyze the correlation of protein kinase PLK4 with the prognosis of patients with malignant glioma and the proliferation of human glioblastoma cells.Methods:The relationship of PLK4 expression to the pathological grade and prognosis was evaluated using CGGA datasets.Designated siRNAs targeting PLK4 were constructed,and the silencing effect was identified by RT‐qP‐CR and Western blot analyses.The effect of PLK4 on the proliferation of tumor cells was evaluated by MTT and colony formation as‐says.Results:The expression of PLK4 increased with pathological grade and was significantly related to the overall survival in patients with glioma and the prognosis of patients with high‐grade glioma.MTT and colony formation assay results indicated that the prolifera‐tion activity was significantly reduced after depleting PLK4.Conclusion:The expression of PLK4 is related to the prognosis of patients with glioma and can affect the proliferation activity of tumor cells.Therefore,PLK4 could be a potential therapeutic target in glioma treatment.

glioma,kinase,PLK4,proliferation

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.14.300

天津醫科大學總醫院，天津市神經病學研究所，天津市神經損傷變異與再生重點實驗室，教育部中樞創傷修復與再生重點實驗室（天津市300052）

*本文課題受國家自然科學基金項目（編號：81572496）資助

韓磊superhanlei@hotmail.com

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81572496)

張作鑫專業方向為膠質瘤的基礎與臨床研究。

E-mail：823432117@qq.com