乳腺浸潤性微乳頭狀癌組織β1 integrin及Rac1和RhoA表達的研究*

鄭霞 劉冰冰 孟凡凡 李帥 谷峰 付麗

·臨床研究與應用·

乳腺浸潤性微乳頭狀癌組織β1 integrin及Rac1和RhoA表達的研究*

鄭霞 劉冰冰 孟凡凡 李帥 谷峰 付麗

目的：探討極性蛋白β1 integrin及Rac1和RhoA在乳腺浸潤性微乳頭狀癌（invasive micropapillary carcinoma，IMPC）組織中的表達及其意義。方法：采用免疫組織化學法檢測天津醫科大學腫瘤醫院自2007年1月至2008年12月89例乳腺IMPC患者組織中β1 integrin、Rac1及RhoA的表達，并選取該院同期診斷的90例乳腺浸潤性導管癌非特殊型（invasive ductal carcinoma-not other?wise specified，IDC-NOS）病例作為對照，分析3種蛋白間及其與臨床病理學特征之間的關系。結果：IMPC組織中β1 integrin及Rac1蛋白高表達率分別為78.7%（70/89）和76.4%（68/89），顯著高于IDC-NOS組織的63.3%（57/90）和54.4%（49/90），差異均具有統計學意義（P＜0.05）；IMPC組織中RhoA陽性表達率為68.5%（61/89），顯著高于IDC-NOS組織的44.4%（40/90），差異亦具有統計學意義（P=0.001）。IMPC組織中β1 integrin與Rac1表達均與淋巴結轉移呈正相關（P＜0.05），且二者之間呈正相關（P=0.006）；RhoA表達與淋巴結轉移、ER及PR呈正相關（P＜0.05），但與β1 integrin及Rac1的表達無顯著相關性（P＞0.05）。結論：極性蛋白β1 integrin、Rac1及RhoA在乳腺IMPC組織中過表達，提示其可能均在IMPC的高轉移中發揮重要作用，且可能成為靶向治療研究的新靶點。

乳腺浸潤性微乳頭狀癌 轉移 β1 integrin Rac1 RhoA

乳腺浸潤性微乳頭狀癌（invasive micropapillary carcinoma，IMPC）是一種具有高轉移性的特殊類型乳腺癌，其形態學表現為IMPC細胞呈集團性、極性倒轉的微乳頭和（或）微腺管狀結構排列。研究發現IMPC細胞的極性倒轉可能與其高轉移特性密切相關［1］，從極性方面入手進行研究及探討導致IMPC高轉移的原因是解析IMPC高侵襲、高轉移的關鍵，具有極其重要的意義。β1 integrin、Rac1和RhoA均是與極性相關的蛋白分子［2-3］，且三者均在惡性腫瘤的侵襲和轉移過程中發揮重要作用［4-6］。本研究旨在探討β1 integrin、Rac1和RhoA與IMPC高轉移的關系，并結合IMPC患者的臨床病理學特征分析其相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

收集天津醫科大學腫瘤醫院2007年1月至2008年12月89例乳腺IMPC患者的組織為研究組，隨機選取同期90例乳腺IDC-NOS患者的組織作為對照組。所有患者均為女性，均行改良根治術治療，術前均未行放療或化療。IMPC組患者年齡為28～80歲，中位年齡為51歲；IDC-NOS組患者年齡為30～89歲，中位年齡為55歲。本研究獲得天津醫科大學腫瘤醫院倫理委員會認可，且患者均簽署知情同意書。1.2方法

1.2.1 免疫組織化學方法標本均經10%中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，4 μm切片處理，檸檬酸鹽緩沖液抗原修復，常規免疫組織化學SP法檢測極性蛋白β1 integrin、Rac1和RhoA。SP-9000、DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物科技有限公司；所有一抗包括兔抗人β1 integrin單抗、鼠抗人Rac1單抗、鼠抗人RhoA單抗均購自美國Abcam公司。實驗過程嚴格按照試劑盒的說明書進行操作，DAB顯色，蘇木精復染，透明封固。已知陽性乳腺癌切片為陽性對照，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.2.2 IMPC的組織學分級標準根據改良后的Bloom-Richardson分級系統［7］分為以下三級：Ⅰ級：癌細胞胞核大小、形狀及染色質基本一致或輕度異型，無或偶見核分裂像1個/10HPF；Ⅱ級：癌細胞核大小、形狀及染色質中度異型，可見核分裂像2～3個/10HPF；Ⅲ級：癌細胞核大小、形狀及染色質重度異型，核分裂像＞3個/10HPF。

1.2.3 結果判定β1 integrin主要定位于細胞膜和（或）細胞質中，Rac1主要定位于細胞核和（或）細胞質中，二者切片中陽性細胞百分比≤1分為低表達，陽性細胞百分比≥2分為高表達［8-9］。RhoA主要定位于細胞質中，判定標準參照Allred評分系統［10］；ER、PR及HER-2的判定標準參照美國臨床腫瘤學會與美國病理醫師學會指南［11］。

1.3 統計學分析

所有數據均采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。分類資料組間比較采用χ2檢驗，兩變量相關性采用Spearman等級相關分析。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 IMPC的形態特征

IMPC形態學表現為癌細胞排列呈不含纖維脈管束的微小乳頭狀或小腺管狀結構，鏡下可見微乳頭或腺管狀結構呈現一種主、間質分離的現象（圖1A）；上皮膜抗原（EMA）免疫組織化學染色時發現微乳頭狀結構的外表面呈現陽性（圖1B）。

圖1 IMPC及IDC-NOS的形態特征（邊角×200）Figure 1Histological features of IMPC and IDC‐NOS(inset×200)

2.2 臨床病理學特征

乳腺IMPC及IDC-NOS組患者的臨床病理學特征分析結果表明，相較IDC-NOS組乳腺IMPC組患者具有更高的淋巴結轉移率（P＜0.001），而兩組患者的年齡、腫瘤大小、組織學分級、ER、PR及HER-2比較均差異無統計學意義（P＞0.05，表1）。

2.3 β1 integrin、Rac1、RhoA的表達及與IMPC患者臨床病理學特征的相關性

2.3.1 β1 integrin、Rac1及RhoA在IMPC組及IDCNOS對照組中的表達β1 integrin、Rac1及RhoA蛋白在IMPC組及IDC-NOS對照組中的表達特點見圖2。IMPC組中β1 integrin及Rac1蛋白高表達率分別為78.7%（70/89）及76.4%（68/89），顯著高于IDC-NOS組中的63.3%（57/90）及54.4%（49/90），差異均具有統計學意義（P＜0.05）；IMPC組RhoA陽性表達率為68.5%（61/89），顯著高于IDC-NOS組的44.4%（40/90），差異亦具有統計學意義（P=0.001，表2）。

表1 IMPC與IDC-NOS組患者的臨床病理學特征比較Table 1Clinicopathological parameters of patients with IMPC or IDC‐NOS

圖2 β1 integrin、Rac1及RhoA在IMPC組與IDC-NOS組中的表達（SP×100，邊角×200）Figure 2Expression of β1 integrin,Rac1,and RhoA in patients with IMPC and IDC‐NOS(SP×100,inset×200)

表2 β1 integrin、Rac1及RhoA在IMPC組及IDC-NOS組中的表達Table 2Expression of β1 integrin,Rac1,and RhoA in patients with IM‐PC and IDC‐NOS

2.3.2 β1 integrin、Rac1、RhoA的表達與IMPC臨床病理學特征的相關性Spearman等級相關分析顯示，IMPC組織中β1 integrin與Rac1表達均與淋巴結轉移呈正相關（P＜0.05），且二者之間呈正相關（P=0.006，表3）；而RhoA表達除與淋巴結轉移呈正相關（P＜0.001），也與ER及PR呈正相關（P＜0.05），但與β1 integrin及Rac1的表達無顯著相關性（P＞0.05）。β1 integrin、Rac1及RhoA的表達與患者年齡、腫瘤大小、組織學分級、HER-2的表達均無顯著相關性（表4）。

表389 例IMPC患者中β1 integrin及Rac1蛋白表達的相關性Table3Correlationbetweenβ1integrinandRac1in89patientswithIMPC

表489 例IMPC患者中β1 integrin，Rac1及RhoA的表達與臨床病理學特征的相關性Table 4Expression of β1 integrin,Rac1,and RhoA and its correlation with clinicopathologic factors in 89 patients with IMPC

3 討論

細胞極性為多種不同類型細胞的共同特征，是指膜蛋白及細胞器沿頂點端-基底端軸的不對稱分布。細胞極性在多數細胞的分化和發揮功能方面起到關鍵性作用，如乳腺正常腺管細胞的極性，可維持頂點端位于管腔側，基底端位于基底側，這種極性的不對稱分布可以確保乳汁的正常分泌。在乳腺IMPC中，乳腺上皮的頂點端朝向基底側，基底端朝向管腔側，頂點端-基底端軸發生極性倒轉導致細胞無法發揮其正常功能。Chen等［1］發現即使在含有極少IMPC成分的IDC-NOS中，其淋巴結轉移也明顯高于未含有IMPC成分的IDC-NOS，并且轉移病灶的腫瘤成分大多為IMPC，提示IMPC的高轉移特性可能與其癌細胞的極性倒轉密切相關。

Has等［2］指出，整合素家族的亞單位β1 integrin能夠與其配體如kindlin-1、α-actin等結合并激活其下游的Rac1及RhoA，并通過眾多的效應物來建立以及維持上皮細胞的極性。并且研究發現β1 integrin、Rac1及RhoA均在促進乳腺癌的發生及發展過程中發揮重要作用［4，6］。本研究發現，乳腺IMPC組織中β1 integrin、Rac1及RhoA蛋白表達均明顯高于對照組IDC-NOS，差異具有統計學意義，提示極性蛋白β1 integrin、Rac1及RhoA過表達可能在IMPC的惡性進展中發揮一定的作用。同時在對β1 integrin、Rac1及RhoA蛋白表達及IMPC臨床病理學特征的相關性分析發現，3種蛋白的表達均與淋巴結轉移呈正相關，提示三者可能在IMPC高轉移過程中扮演了重要角色。

Wang等［12］在研究中發現，Oridonin蛋白可通過抑制β1 integrin/FAK通路阻斷MDA-MB-231細胞的遷移及侵襲。此外，研究還發現β1 integrin是Twist介導的EMT過程的主要調節蛋白，Twist-β1 integrin-FAK/ILK通路可以促進乳腺癌細胞的浸潤以及轉移［13］。本研究通過對β1 integrin表達水平與臨床病理學特征之間的相關性進行分析顯示，在IMPC組中β1 integrin表達水平與淋巴結轉移呈正相關，與Yen等［14］的研究結果相符。

癌細胞的浸潤和轉移是一個多步驟、多環節復雜的生物學過程，癌細胞的遷移性運動在此過程中發揮了重要作用。Rac1和RhoA可通過參與片狀偽足的形成及黏著斑的改變并以此介導癌細胞的遷移性運動，以進一步促進癌細胞的浸潤及遠處轉移。Huang等［5］在胃癌的研究中發現，高表達量的RhoA更易參與彌漫性胃癌的肝轉移過程。Rozenchan等［6］的研究也發現，在乳腺癌細胞以及轉移的淋巴結中同樣存在高表達量的Rac1以及RhoA。本研究結果同樣顯示，在IMPC組織中Rac1及RhoA蛋白的表達水平與淋巴結轉移呈正相關。因此，本研究結果提示，β1 integrin、Rac1及RhoA均可能在IMPC高轉移的惡性生物學行為中發揮重要作用。

Liu等［15］在體內以及體外研究中發現，β1 integrin表達量降低的成纖維細胞中均伴隨著Rac1的下降。在一項關于β1 integrin/kindlin-1通路的研究中，Has等［2］發現Rac1的激活受β1 integrin的下游分子kind?lin-1的控制。Bulanova等［16］在敲除G蛋白耦合受體C類5組（G protein coupled receptor class C group 5，GPRC5A）之后發現，β1 integrin蛋白表達量的降低同樣伴隨著Rac1蛋白激活量的減少。本研究結果同樣發現，在乳腺IMPC組織中β1 integrin的表達與Rac1的表達呈正相關，且二者均與淋巴結轉移呈正相關，提示二者的協同作用可能在IMPC極性倒轉結構的形成中發揮重要作用。

綜上所述，本研究結果證明高表達的極性蛋白β1 integrin及Rac1和RhoA，尤其是β1 integrin及Rac1可能是導致乳腺IMPC高轉移特性的重要原因。評估3種蛋白的表達情況可為臨床治療方案的選擇及預后評估提供重要依據，而對其機制的深入研究將會對IMPC高轉移機制有所解析，且將為其精準靶向治療研究提供重要的理論依據。

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（2017‐03‐31收稿）

（2017‐06‐19修回）

鄭霞專業方向為乳腺癌侵襲轉移相關機制的研究。

E-mail：13512946090@163.com

·讀者·作者·編者·

致謝審稿專家

《中國腫瘤臨床》秉承“引導創新、關注前沿、突出臨床、講求實用”的辦刊宗旨，以為讀者提供高質量的學術內容為己任，邀請腫瘤學學科帶頭人及優秀學者作為審稿專家對每篇稿件進行把關與指導。在此，《中國腫瘤臨床》編輯部全體人員對承擔本期文章審稿工作的專家致以誠摯感謝，其公平、客觀、準確、詳實的審稿意見使文章質量得到了有效提高。專家名單列示如下（按姓氏筆畫順序）：

巴一教授天津醫科大學附屬腫瘤醫院

申文江教授北京大學第一醫院

劉倫旭教授四川大學華西醫院

劉曉晴主任醫師軍事醫學科學院附屬醫院

勞向明副教授中山大學腫瘤防治中心

張春霆副教授浙江大學金華醫院

李忠武副教授北京大學腫瘤醫院

李秋教授四川大學華西醫院

楊吉龍教授天津醫科大學附屬腫瘤醫院

姜戰武主任醫師保定市第一中心醫院

柳劍英副教授北京大學醫學部

賀慧穎副教授北京大學醫學部

梅開勇教授廣州醫科大學附屬第二醫院

Expression of β1 integrin,Rac1,and RhoA in invasive micropapillary breast carcinoma

Xia ZHENG,Bingbing LIU,Fanfan MENG,Shuai LI,Feng GU,Li FU

Li FU;E‐mail:fulijyb@hotmail.com
Department of Breast Cancer Pathology and Research Laboratory,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital;National Clinical Research Center for Cancer;Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin;Tianjin's Clinical Research Center for Cancer,Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy,Tianjin Medical University,Ministry of Education,Tianjin 300060,China

Objective:To investigate the expression and significance of β1 integrin,Rac1,and RhoAin invasive micropapillary breast carcinoma(IMPC).Methods:Immunohistochemical staining was performed to detect the expression of β1 integrin,Rac1,and RhoA in 89 patients with IMPC and 90 patients with invasive ductal carcinoma‐not otherwise specified(IDC‐NOS)who were treated between January 2007 and December 2008 in Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital.The relationship among the three proteins and the expression of β1 integrin,Rac1,and RhoA with clinicopathological features were determined.Results:β1 integrin(78.7%)and Rac1(76.4%)were highly expressed in patients with IMPC.This expression was significantly higher than that in patients with IDC‐NOS(63.3%and 54.4%).Statistical difference was found between the two groups(P＜0.05).Positive rate of RhoA(68.5%)in patients with IMPC was also statistically higher than that in patients with IDC‐NOS(44.4%,P=0.001).In patients with IMPC,the expression of β1 integrin and Rac1 was positively associated withlymphnodemetastasis(P＜0.05),whiletheexpressionof β1integrinwas positively correlatedwithRac1expression(P=0.006).Expression of RhoA was positively correlated with lymph node involvement and ER and PR status(P＜0.05).However,no correlation was found between RhoA expression and the expression of β1 integrin and Rac1(P＞0.05).Conclusion:Thus,β1 integrin,Rac1,and RhoA were overexpressed and might play an important role in the high frequency of metastasis in patients with IMPC.These proteins could be considered as biomarkers for the prognosis and new targets for IMPC therapy.

invasive micropapillary carcinoma,metastasis,β1 integrin,Rac1,RhoA

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.14.356

天津醫科大學腫瘤醫院乳腺病理研究室，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心，乳腺癌防治教育部重點實驗室（天津市300060）

*本文課題受國家自然科學基金項目（編號：81672637）資助

付麗fulijyb@hotmail.com

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81672637)