ERK5和MMP-9在骨肉瘤中的表達及其臨床意義*

王建澍移志剛蒲彥川宋建民耿彬康雅瓊馬淑萍安麗萍夏亞一

·臨床研究與應用·

ERK5和MMP-9在骨肉瘤中的表達及其臨床意義*

王建澍①②③移志剛①②蒲彥川①②宋建民③耿彬①②康雅瓊③馬淑萍③安麗萍②夏亞一①②

目的：探討細胞外信號調節激酶5（extracellular signal-regulated kinase 5，ERK5）蛋白和基質金屬蛋白酶-9（matrix metallo proteinase-9，MMP-9）在骨肉瘤組織中的表達及其臨床意義。方法：選取71例骨肉瘤組織和40例正常骨組織，采用免疫組織化學法檢測ERK5和MMP-9的表達，并分析ERK5和MMP-9的表達與骨肉瘤患者臨床病理特征及預后之間的關系。結果：骨肉瘤組織中ERK5和MMP-9陽性表達率分別為85.9%（61/71）、74.65%（53/71），均明顯高于正常骨組織中陽性表達率12.5%（5/40）、10.0%（4/40），差異均具有統計學意義（均P＜0.05）。ERK5和MMP-9的陽性表達與Enneking分期和轉移相關（均P＜0.05）。Ka?plan-Meier生存分析顯示在骨肉瘤組織中ERK5、MMP-9的陽性表達組患者生存時間均短于陰性表達組（均P＜0.05）。單因素Cox回歸分析發現，腫瘤大小、Enneking分期、轉移、ERK5和MMP-9陽性表達與患者總生存時間相關（均P＜0.05）；多因素分析證實Enneking分期、轉移、ERK5和MMP-9蛋白的陽性表達可作為骨肉瘤患者獨立的預后因子（均P＜0.05）。結論：ERK5和MMP-9在骨肉瘤組織中高表達，與骨肉瘤的病理特征及預后相關；二者可能在骨肉瘤發生發展的過程中起著重要作用。

骨肉瘤 細胞外信號調節激酶5 基質金屬蛋白酶-9 免疫組織化學 預后

骨肉瘤是最常見的原發性骨惡性腫瘤，大部分起源于長骨的干骺端，以兒童和青少年發病最多見［1］。其惡性程度高，早期易發生肺轉移，死亡率高，預后差。隨著外科技術的發展和輔助化療的廣泛應用，患者5年生存率提高到60%～80%［2］。但有部分患者局部仍易復發導致截肢，少部分患者因遠處轉移而死亡。因此，探討骨肉瘤發生侵襲及轉移的相關機制，尋找能夠早期診斷或評估骨肉瘤侵襲性及遠處轉移的標記物或治療靶點對骨肉瘤的綜合治療至關重要。作為廣泛存在于哺乳動物細胞內的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族是一類介導細胞反應的重要信號系統，通過將胞外的刺激信號傳遞至胞核內，參與細胞的增殖、分化等功能［3］。細胞外信號調節激酶5（extra?cellular signal-regulated kinase 5，ERK5）是MAPK家族發現較晚的轉導體，其可以被許多胞外刺激因素激活，包括氧化應激反應、高滲壓、流體切應力、表皮生長因子等，誘導細胞發生相應生物學特性變化，參與機體多種生理病理過程，如腦發育、腎病、癌癥及糖尿病等［4-5］。最近研究表明，ERK5可促進腫瘤血管的生成并對腫瘤細胞生長起重要作用［6-7］。目前已經證實ERK5在前列腺癌［8］、白血?。?］、乳腺癌［10］、惡性間皮瘤［11］等多種腫瘤中高表達，且參與腫瘤發生發展。然而關于ERK5在骨肉瘤中的表達及其與MMP-9的相互關系尚缺乏相關報道，本研究通過免疫組織化學法檢測ERK5和MMP-9在骨肉瘤組織中表達情況，分析其與骨肉瘤患者臨床病理特征及預后的相關性，以期為早期診斷及分子靶向治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料收集甘肅省腫瘤醫院2011年4月至2016年6月收治的術前穿刺活檢和切開活檢的71例骨肉瘤患者的組織標本，所有標本經病理學確診，活檢前均未行術前放化療。其中男性48例，女性23例，年齡為6～65歲，平均年齡18歲。分期按骨與軟組織腫瘤外科分期系統即Enneking分期，ⅡA期21例，ⅡB期14例，Ⅲ期36例；成骨細胞型34例，成軟骨細胞型13例，成纖維細胞型12例，混合型12例；遠處轉移43例。另取40例正常骨組織作為對照。所有病例、臨床資料完整，同時排除糖尿病、腎病等其他代謝性疾病的患者。對71例骨肉瘤患者以手術日期為隨訪起點，采用電話、門診的方式進行隨訪，截止時間為2016年12月30日，隨訪時間為6～69個月，平均隨訪時間為23個月。本研究獲得患者的知情同意及甘肅省腫瘤醫院倫理委員會的批準。

1.1.2 主要試劑兔抗人ERK5多克隆抗體（BS6705）購自美國Bioworld Technology公司，兔抗人MMP-9多克隆抗體（ab38898）購自英國Abcam公司。免疫組織化學SP試劑盒（SP-9001）及DAB顯色試劑盒、小鼠抗人βactin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或抗小鼠IgG（二抗）購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學檢測用自動組織切片機對常規石蠟包埋組織標本進行4 μm厚度的連續切片，嚴格按照試劑盒說明書進行免疫組織化學染色。具體為常規脫水、透明、水化切片；浸在pH為6.0的檸檬酸鈉溶液中微波抗原修復，于3%H2O2中消除內源性過氧化物酶活性；滴加兔抗人ERK5多克隆抗體（體積稀釋比例為1:200）、兔抗人MMP-9多克隆抗體（體積稀釋比例為1:150），放置在濕盒中4℃反應過夜；滴加生物素標記的二抗工作液，37℃反應15 min；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37℃反應15 min；加DAB顯色液顯色5 min；蘇木精對比染色，梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固。用已知陽性切片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。

1.2.2 ERK5蛋白陽性表達的結果判定主要定位于細胞質和（或）細胞核；MMP-9蛋白陽性表達主要定位于細胞質，二者均呈現棕黃色顆粒。每張切片高倍鏡下（×200）選取10個高倍視野，每個視野計數100個細胞，按染色強度及陽性細胞比例積分，結果判讀采用半定量積分分級，積分=染色強度×染色細胞比例。染色強度：無著色為0，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；染色細胞比例：陽性細胞＜5%為0，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。兩者相乘為總的分數，＞4分為陽性表達，≤4分陰性表達。以上結果均至少由兩位病理科醫生以盲法觀察確定。1.3統計學分析

應用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。組間比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman相關系數檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制患者的生存曲線，并進行Log rank檢驗；采用Cox回歸法進行單因素和多因素的生存分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 ERK5、MMP-9在骨肉瘤和正常骨組織中的表達

免疫組織化學法檢測結果顯示，ERK5蛋白表達主要定位于細胞質和（或）細胞核，MMP-9蛋白表達主要定位于細胞質（圖1）。71例骨肉瘤組織中ERK5、MMP-9的陽性表達率為85.9%（61/71）、74.65%（53/71），均明顯高于正常骨組織中陽性表達率12.5%（5/40）、10.0%（4/40），差異均具有統計學意義（均P＜0.05）。釆用Spearman相關性分析發現，ERK5與MMP-9表達呈正相關（r=0.934，P＜0.01）。

2.2 ERK5、MMP-9在骨肉瘤組織中的表達與臨床病理參數的相關性分析

在71例骨肉瘤組織中ERK5和MMP-9陽性表達與Enneking分期、轉移期相關（均P＜0.05）。在En?neking分期為ⅡB/Ⅲ期的骨肉瘤組織中二者的陽性表達高于ⅡA期，差異具有統計學意義（P＜0.05）。43例發生轉移的骨肉瘤患者中，42例（97.7%）ERK5呈陽性表達，40例（93.0%）MMP-9呈陽性表達；而在28例未發生遠處轉移的骨肉瘤標本中，19例（67.9%）ERK5呈陽性表達，13例（46.4%）MMP-9呈陽性表達，差異均具有統計學意義（均P＜0.05）。而與其他臨床病理特征如年齡、性別、腫瘤部位、腫塊大小、組織學分型均無關（均P＞0.05，表1）。

2.3 ERK5和MMP-9陽性表達與骨肉瘤患者預后關系

71例骨肉瘤患者中，36例患者死亡，總生存率為49.3%。ERK5陽性表達患者的中位生存時間為15個月，陰性表達患者的中位生存時間為30個月。Ka?plan-Meier生存分析結果顯示，在骨肉瘤組織中陽性ERK5表達的患者組生存時間明顯短于陰性表達ERKS的患者組，差異具有統計學意義（χ2=8.102，P＜0.01）。MMP-9陽性表達患者的中位生存時間為18個月，陰性表達患者的中位生存時間為36個月。Ka?plan-Meier生存分析結果顯示，在骨肉瘤組織中陽性表達MMP-9的患者生存時間明顯短于陰性表達ERK5的患者，差異有統計學意義（χ2=7.954，P＜0.01，圖2）。單因素分析顯示，腫瘤大小、Enneking分期、轉移、ERK5和MMP-9陽性表達與患者總生存時間相關（均P＜0.05）。多因素Cox生存分析發現Enneking分期、轉移、ERK5蛋白和MMP-9蛋白的陽性表達可作為骨肉瘤患者獨立的預后因子（均P＜0.05，表2）。

圖1 免疫組織化學法檢測骨肉瘤和正常骨組織中ERK5、MMP-9的表達（DAB×200）Figure1Immunohistochemical analysis of ERK5 and MMP‐9 protein expression levels(DAB staining,×200)in osteosarcoma and normal bone tis‐sues.ERK5 expression is localized within the cytoplasm and nucleus

表1 ERK5和MMP-9在骨肉瘤組織中的表達與臨床病理參數的相關性分析Table 1Relationship between ERK5 and MMP‐9 expression levels in osteosarcoma tissues and clinicopathologic characteristics

表1 ERK5和MMP-9在骨肉瘤組織中的表達與臨床病理參數的相關性分析（續表1）Table 1Relationship between ERK5 and MMP‐9 expression levels in osteosarcoma tissues and clinicopathologic characteristics

圖2 骨肉瘤患者的Kaplan-Merier生存曲線Figure 2Kaplan‐Meier curves of patients with osteosarcoma(n=71)

表271 例骨肉瘤患者總體生存率相關因素的單因素及多因素分析Table 2Univariate and multivariate analysis of factors related to overall survival(OS)in 71 patients with osteosarcoma

3 討論

骨肉瘤是高度惡性的間葉組織腫瘤，年發病率約為3/100萬［12］。由于骨肉瘤局部侵襲性生長并易發生遠處轉移，二十世紀七十年代以前，采用截肢為主的治療手段并未改善患者的生存率，大部分患者于2年內死于肺轉移［13］。雖然此后輔助化療的廣泛應用使患者肺轉移率有所降低，但仍有20%患者在初次就診時已發生肺轉移；同時約80%患者在病程發展中也會出現肺轉移［14-15］。近年來，國內外多中心研究機構進行了大量的努力，但全球骨肉瘤患者總體5年生存率仍無較大變化［16］。因此，尋找能夠早期診斷發生轉移的標記物對評估和改善患者預后顯得尤為重要。

ERK5是MAPK家族成員之一，由816個氨基酸構成，其N末端包含有蛋白激酶區，C末端擁有獨特的COOH；由于其C末端包含有400個氨基酸的擴展，長度幾乎是其他MAPK家族成員的2倍。Buschbeck等［17］研究認為，ERK5幾乎在所有的細胞中都有表達。ERK5可接受細胞外傳來的信號并由其上游激酶MEK5激活，然后可轉位于細胞核，對轉錄因子肌細胞增強子2（myocyte enhancer factor 2，MEF2）磷酸化而調節其轉錄活性。ERK5還可以入核調節其他轉錄因子的表達，如c-Jun、c-Fos等，參與細胞周期的調控、介導抗凋亡作用［18］。近年來研究發現，ERK5在腫瘤侵襲和轉移等生物學過程中起傳遞和放大信號的作用。Mehta等［19］研究提出前列腺癌細胞中ERK5上游激酶MEK5的表達可增加MMP-9表達，導致前列腺細胞侵襲能力增強。Ramsay等［20］最新研究證實，在轉移性前列腺癌細胞核中ERK5的表達較良性前列腺增生、原發性前列腺癌顯著增高。Castro等［21］研究發現，在乳腺癌中ERK5可介導乳腺腫瘤激酶（breast tumor kinase，BRK）激活，從而導致腫瘤細胞發生侵襲和遷移。Sticht等［22］研究發現，磷酸化ERK5的陽性表達與口腔鱗狀細胞癌的進展以及淋巴結的轉移密切相關。以上研究提示ERK5蛋白可能和腫瘤的侵襲、轉移有關。

本研究通過免疫組織化學方法檢測71例骨肉瘤組織和40例正常骨組織中ERK5的表達，結果發現ERK5和MMP-9在骨肉瘤組織中表達明顯高于正常骨組織。此外，ERK5和MMP-9的陽性表達均與骨肉瘤患者Enneking分期、轉移相關。隨著Enneking分期的增高，二者的陽性表達率逐步增高，與未發生遠處轉移患者相比，發生遠處轉移患者ERK5和MMP-9陽性表達率較高。提示ERK5可能介導骨肉瘤細胞侵襲臨近組織，導致惡性程度增高，進而促進MMP-9的表達，最終發生腫瘤細胞的局部侵襲和遠處轉移。Yue等［23］研究發現，沉默ERK5基因，骨肉瘤中MMP-9明顯減少，侵襲性降低?；|金屬蛋白酶系（MMPs）可通過對細胞外基質（ECM）和基底膜中不同成分的降解、破壞，使腫瘤細胞進入到循環系統并逃避宿主免疫系統，最終向肺等靶器官侵襲轉移，形成轉移病灶。Huang等［24］實驗證實，高表達MAPK7和ERK5能促進骨肉瘤細胞的增殖、侵襲及遷移。本研究Kaplan-Meier生存分析顯示，ERK5和MMP-9陽性表達組患者生存時間明顯低于陰性表達組；單因素和多因素Cox回歸分析顯示，ERK5和MMP-9蛋白的陽性表達可作為骨肉瘤患者獨立預后的危險因素。以上結果表明，ERK5和MMP-9可能在骨肉瘤的發生發展過程中扮演了重要的角色，二者可能起協調作用，且與患者的預后密切相關。這些與前列腺癌、乳腺癌、口腔鱗癌等腫瘤的研究結果一致。

在骨肉瘤的早期診治過程中，如何有效地降低和控制肺轉移率，提高患者的長期生存率，是目前骨肉瘤治療中瓶頸所在。除了規范的臨床分期外，如何在早期就能夠判斷骨肉瘤患者的預后，找到監測骨肉瘤患者術后復發及轉移的敏感標記物是臨床上亟需解決的問題。在骨肉瘤患者中，陽性表達ERK5的患者可能需要更多的輔助性治療和更加緊密的隨訪。EKR5作為MAPK家族中的新成員，在骨肉瘤形成、發展、轉移等機制方面具有重要的意義和潛在的研究價值。本研究中，71例骨肉瘤患者病例資料收集時間跨度較長，可能因治療水平的進展及患者治療的依從性產生生存偏倚，帶來相應統計學上的誤差。因此，有必要在今后開展多中心、大樣本、長時間隨訪來進行深入的研究，以期為骨肉瘤診治、評估預后提供新的靶點。

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（2017‐02‐10收稿）

（2017‐06‐10修回）

（編輯：楊紅欣校對：武斌）

王建澍專業方向為骨與軟組織腫瘤的臨床診治。

E-mail：455841831@qq.com

·讀者·作者·編者·

《中國腫瘤臨床》文章薦讀：乳腺癌新輔助化療再認識

近年來隨著乳腺癌新輔助化療研究的深入，該治療手段已在臨床廣泛應用。新輔助化療使不可手術的局部晚期乳腺癌患者獲得手術治療的機會，并且提高具有較大腫瘤體積患者的保乳率，從而明顯改善患者的生存質量，但仍有許多問題存在爭議?！吨袊[瘤臨床》2016年第15期“特約綜述”欄目中，特邀軍事醫學科學院附屬醫院乳腺外科主任黃焰教授對乳腺癌新輔助化療相關臨床研究進行綜述，并分享其經驗與觀點。

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——本刊編輯部

ERK5 and MMP-9 expression levels in osteosarcoma and their clinical significance

Jianshu WANG1,2,3,Zhigang YI1,2,Yanchuan PU1,2,Jianmin SONG3,Bin GENG1,2,Yaqiong KANG3,Shuping MA3,Liping WANG2,Yayi XIA1,2

Yayi XIA;E‐mail:xiayayi@126.com
1Department of Orthopaedics,Second Hospital of Lanzhou University,Lanzhou 730030,China;2Orthopaedics Key Laboratory of Gansu Province,Lanzhou 730030,China;3Cancer Hospital of Gansu,Lanzhou 730050,China

Objective:To investigate the extracellular signal‐regulated kinase 5(ERK5)and matrix metallo proteinase‐9(MMP‐9)expres‐sion levels in osteosarcoma tissues and their clinical significance.Methods:The ERK5 and MMP‐9 expression levels in 71 specimens of osteosarcoma tissue and 40 specimens of normal bone tissue were detected by immunohistochemistry.The relationship between ERK5 and MMP‐9 expression levels,their clinical characteristics,and prognosis of patients with osteosarcoma were analyzed.Results:The positive expression of ERK5 and MMP‐9 in osteosarcoma tissues was 85.9%(61/71)and 74.65%(53/71),respectively,which were significantly higher than those in normal bone tissues at 12.5%(5/40)and 10.0%(4/40)(all P＜0.05).The positive expression of ERK5 and MMP‐9 was associated with Enneking stage and metastasis(all P＜0.05).Kaplan‐Meier analysis showed that the survival duration of patients with positive ERK5 and MMP‐9 expression levels was shorter than those of the patients in the negative expression groups(all P＜0.05).Univariate analysis of COX proportional hazards regression model revealed that tumor size,Enneking stage,metastasis,and positive ERK5 and MMP‐9 expression levels are relevant to the overall survival of patients with osteosarcoma(all P＜0.05).Multi‐variate analysis of COX proportional hazards regression model confirmed that Enneking stage,metastasis,and positive ERK5 and MMP‐9 expression levels can act as independent prognostic factors for osteosarcoma patients(all P＜0.05).Conclusion:The ERK5 and MMP‐9 expression levels are high in osteosarcoma tissues and are related to the clinical characteristics and prognosis of patients with osteo‐sarcoma.Thus,ERK5 and MMP‐9 expression levels may play important roles in osteosarcoma development and progression.

osteosarcoma,ERK5,MMP‐9,immunohistochemistry,prognosis

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.14.146

①蘭州大學第二醫院骨科（蘭州市730030）；②甘肅省骨關節疾病研究重點實驗室；③甘肅省腫瘤醫院骨軟組織腫瘤科

*本文課題受國家自然科學基金（編號：81672207）資助

夏亞一xiayayi@126.com

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81672207)