紅菇多糖對小鼠肝臟衰老的抑制效果

魏 杰， 張 瀟， 張國坤， 萬冬梅， 林景峰， 孫淑華

(1.遼寧大學 生命科學院， 遼寧 沈陽 110036； 2.遼寧仙人洞國家級自然保護區管理局， 遼寧 大連 116407)

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紅菇多糖對小鼠肝臟衰老的抑制效果

魏 杰1， 張 瀟1， 張國坤1， 萬冬梅1， 林景峰2， 孫淑華2

(1.遼寧大學 生命科學院， 遼寧 沈陽 110036； 2.遼寧仙人洞國家級自然保護區管理局， 遼寧 大連 116407)

研究紅菇多糖對衰老昆明小鼠肝功能衰退的抑制作用。使用D -半乳糖建立衰老模型，并在此期間給予75 mg/L與150 mg/L紅菇多糖飲水。8周后斷頸處死，檢測肝指數、血清和肝組織的谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性及丙二醛含量，同時對肝組織Ca2+-ATPase活性及形態學進行分析。結果表明，8周內給予紅菇多糖150 mg/L飲水時，小鼠肝指數、谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性得到顯著提高，丙二醛含量顯著下降，小鼠肝功能衰退得到了顯著抑制(p<0.05)，肝臟的衰老及損傷也得到了有效抵制。

紅菇多糖； 肝臟； 抗衰老

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粉柄紅菇：采自遼寧仙人洞自然保護區，選擇菌柄、傘蓋完整的粉柄紅菇。

超微量ATP酶(Ca2+-ATPase)測試盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH -Px)檢測試劑盒、SOD檢測試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；D -半乳糖、體積分數4%多聚甲醛固定液，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；體積分數95%的乙醇(分析純)，購自天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

BSA223S型電子精密天平，德國賽多利斯公司；DS- 1型高速組織搗碎機，無錫沃信儀器有限公司；UV- 2700型紫外分光光度計，日本島津公司；BCD- 218(KK22F66TI)型冰箱，德國西門子公司； CR- 22型高速冷凍離心機，日本日立公司；SHZ- 82A型氣浴恒溫振蕩器，金壇市華城創威實驗儀器廠； FE20型酸度計，梅特勒- 托利多公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅菇多糖的制備

將干燥的粉柄紅菇子實體用研磨機粉碎，過60目篩，得到粉柄紅菇干粉，稱取紅菇干粉100 g，加入500 mL圓底燒瓶中，按照液料比(mL/g)3∶1，加入體積分數為80%的乙醇在80 ℃恒溫水浴鍋中提取90 min，再抽濾去除雜質，使用Sevage法去除蛋白，最后將濾渣放在干凈的不銹鋼托盤中，放入60 ℃烘箱中烘干備用，純度為81.3%。

1.3.2 紅菇多糖含量測定

使用硫酸- 苯酚法測定。首先制備標準曲線：制備葡萄糖0.1 mg/mL的標準溶液，精確吸取0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL的葡萄糖標準溶液于10 mL具塞刻度試管中，每管用蒸餾水補齊至2 mL，加入體積分數5%的苯酚1 mL，迅速混勻后再加入體積分數98%的濃硫酸 5 mL，搖勻后放置至室溫。待溶液冷卻后，以蒸餾水作為空白對照調零，使用紫外分光光度計在490 nm波長處測定其吸光度。以葡萄糖標準溶液質量濃度ρ(mg/mL)為橫坐標，以吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線，并計算標準曲線方程。將紅菇多糖樣品稀釋至合適倍數，吸取2.0 mL樣品稀釋液，按照上述步驟操作，在490 nm波長處測定其吸光度，以標準曲線方程計算紅菇多糖含量。

1.3.3 小鼠模型的建立與分組

參照文獻[13]，將52只昆明(KM)小鼠隨機均分為正常組(13只)和實驗組(模型組、紅菇多糖75 mg/L飲水組和150 mg/L飲水組，每組13只)。實驗組背部皮下注射D -半乳糖150 mg/(kg·d)建立衰老模型(連續8周)，每周稱量體重。其中正常組和模型組正常飲水。8周結束后，禁食12 h，稱取小鼠體重，眼球取血，處死小鼠后取肝臟稱重并分別于-80 ℃凍存，用體積分數4%的多聚甲醛固定。

1.3.4 小鼠肝指數的計算

肝指數即為小鼠肝臟質量(g)與其體重(g)的比值，將每只小鼠的肝臟質量與體重對應，按照公式(1)進行計算：

肝指數=小鼠肝臟質量/小鼠體重×100%。

(1)

1.3.5 小鼠血清GSH -Px、SOD活性及MDA含量的測定

參照文獻[14-15]，從小鼠眼球取出的血液，在4 ℃靜置1 h后，以3 500 r/min于4 ℃離心10 min，上清液即為血清。按照試劑盒操作方法測定血清中GSH -Px與SOD活性及MDA含量。

1.3.6 小鼠肝組織GSH -Px、SOD、Ca2+-ATPase活性及MDA含量的測定

取肝組織1 g，加入9 mL的生理鹽水，制成0.1 g/mL勻漿。按照試劑盒操作方法分別測定GSH -Px、SOD、Ca2+-ATPase[16]活性及MDA含量。

1.3.7 小鼠肝臟的HE染色

參照文獻[17]，取小鼠肝臟用體積分數4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋切片，切片常規用二甲苯脫蠟，經各級乙醇至水洗，蘇木素染色5 min，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min，置伊紅液2 min，常規脫水、透明、封片。用顯微鏡觀察并拍照。

1.4 數據處理

采用Graphpad Prism 5繪圖并進行實驗數據分析，采用多因素方差分析和多重比較分析，當p<0.05時為顯著性差異，p>0.05時差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 紅菇多糖對小鼠肝指數的影響

肝指數可以反映肝的病變情況，若外物使肝臟受損，肝指數將會發生明顯下降[12]。正常組肝指數為正常值，表明肝臟未受損(見圖1)。模型組與正常組相比，其肝指數下降了39.24%，差異顯著(p<0.05)，說明模型組建模成功。紅菇多糖高劑量組肝指數與模型組肝指數相比，其肝指數比模型組高出37.93%，具有顯著性差異(p<0.05)，說明400 mL 150 mg/L紅菇多糖飲水能顯著地抑制小鼠肝臟衰老。而紅菇多糖低劑量組與模型組相比差異不顯著(p>0.05)。

*表示與正常組對比，#表示與模型組對比，** 和##表示p<0.05。圖1 8周后各組小鼠的肝指數Fig.1 Liver index of mice

2.2 紅菇多糖對血清和肝組織中GSH -Px活性的影響

GSH -Px是廣泛存在于機體內的、一種重要的催化過氧化物分解的酶。在機體中，清除自由基和體內抗氧化物質與酶活性呈正相關[14]。模型組小鼠血清和肝組織中GSH -Px活性明顯低于正常組，差異達到顯著水平(p<0.05)，說明D -半乳糖致使模型組小鼠清除自由基能力降低，從而使小鼠體內GSH -Px活性降低(見圖2)。與模型組相比，紅菇多糖高劑量組小鼠血清和肝組織中GSH -Px活性分別提高了48.66%，40.39%，效果顯著(p<0.05)，說明高劑量紅菇多糖可有效地激活GSH -Px，以清除體內的自由基等氧化性物質。而紅菇多糖低劑量組的GSH -Px活性與模型組沒有顯著性差異。

*表示與正常組對比，#表示與模型組對比，**和##表示p<0.05。圖2 紅菇多糖對小鼠血清和肝臟GSH -Px活性的影響Fig.2 Effects of Russula polysaccharide on hepatic and serum GSH -Px contents

2.3 紅菇多糖對血清和肝組織中SOD活性的影響

*表示與正常組對比，#表示與模型組對比，**和##表示p<0.05。圖3 紅菇多糖對小鼠血清和肝臟SOD活性的影響Fig.3 Effects of Russula polysaccharide on hepatic and serum SOD contents

2.4 紅菇多糖對血清和肝組織中MDA含量的影響

機體中的氧自由基通過攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化作用，形成MDA等脂質過氧化物。MDA含量的高低間接地反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度，MDA含量越高，說明機體受到自由基的攻擊越嚴重[14]。模型組小鼠血清MDA含量顯著高于正常組(p<0.05)，如圖4。說明經D -半乳糖誘導，小鼠體內脂質過氧化物明顯增多。與模型組相比，紅菇多糖高劑量組小鼠血清和肝中MDA含量分別降低了33.86%，37.63%，效果顯著(p<0.05)。表明紅菇多糖高劑量組能有效抑制D -半乳糖導致的衰老小鼠體內脂質過氧化。

*表示與正常組對比，#表示與模型組對比，** 和##表示p<0.05。圖4 紅菇多糖對小鼠血清和肝臟MDA含量的影響Fig.4 Effects of Russula polysaccharide on hepatic and serum MDA contents

2.5 紅菇多糖對肝組織中Ca2+-ATPase活性的影響

Ca2+-ATPase是細胞膜上的重要轉運蛋白，其活性是反映細胞活力以及相關蛋白和機體氧化程度的重要標準之一，儲藏過程中細胞活性不斷下降、氧化程度不斷升高，這會導致Ca2+-ATPase 活性下降[16]。模型組的Ca2+-ATPase活性顯著低于正常組(p<0.05)，說明實驗在小鼠Ca2+-ATPase方面建模成功(見圖5)。與模型組相比，紅菇多糖高劑量組中的Ca2+-ATPase活性分別提高了48.23%，41.17%，效果較為顯著(p<0.05)。

*表示與正常組對比，#表示與模型組對比，**和##表示p<0.05。圖5 紅菇多糖對小鼠肝臟Ca2+ -ATPase活性的影響Fig.5 Effects of Russula polysaccharide on liver Ca2+ -ATPase activities

2.6 紅菇多糖對小鼠肝臟蘇木精- 伊紅染色的影響

小鼠肝臟的蘇木精- 伊紅染色(hematoxylin -eosin staining,HE)結果表明，電鏡下正常組肝小葉及肝細胞結構正常，肝索排列整齊、中央靜脈無異常；模型組肝細胞體積縮小、細胞核體積縮小，肝細胞之間連接松散，部分肝細胞可見輕度脂肪變性，肝竇輕度擴張；紅菇多糖高劑量組肝細胞及細胞核結構、大小及其染色未見明顯異常，個別肝細胞胞漿內可見脂滴顆粒，肝竇無擴張；紅菇多糖低劑量組肝細胞及細胞核體積增大，部分肝細胞可見脂肪變性，少量肝細胞胞漿嗜酸性增強，肝索結構未見明顯異常(見圖6)。

a、b、c、d分別為正常組、模型組、紅菇多糖高劑量組、紅菇多糖低劑量組。圖6 電鏡下小鼠肝臟的HE染色圖片Fig.6 Representative photography of hematoxylin -eosin staining of liver in mice

3 結 論

與模型組相比，150 mg/L濃度的紅菇多糖使昆明小鼠的體重明顯增加，血清和肝中的GSH -Px、SOD活性顯著增強，MDA含量顯著降低，Ca2+-ATPase活性顯著增強，表明紅菇多糖對小鼠肝功能衰退有顯著(p<0.05)抑制和推遲效果。

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(責任編輯：張逸群)

Inhibitory Effect ofRussulafarinipesRomell Polysaccharide on Mice Liver Senescence

WEI Jie1, ZHANG Xiao1, ZHANG Guokun1, WAN Dongmei1, LIU Jingfeng2, SUN Shuhua2

(1.SchoolofLifeScience,LiaoningUniversity,Shenyang110036,China; 2.LiaoningXianrendongNationalNatureReserveAdministrationBureau,Dalian116407,China)

Effects ofRussulapolysaccharide on mice hepatic insufficiency were investigated in this study. The senile model mice were established by D -galactose and mice were treated by 75 mg/L and 150 mg/LRussulapolysaccharide. After 8 weeks, liver index, serum and hepatic GSH -Px, SOD activity, MDA contents, Ca2+-ATPase activity and hematoxylin -eosin staining of mice were determined. The results showed that the treatment of 150 mg/LRussulapolysaccharide could increase liver index, GSH -Px and SOD activity, and decrease the MDA content, which could inhibit the aging of liver.

Russulapolysaccharide; liver; anti -aging

10.3969/j.issn.2095 -6002.2017.03.007

2095 -6002(2017)03 -0050 -05

魏杰，張瀟，張國坤，等. 紅菇多糖對小鼠肝臟衰老的抑制效果[J]. 食品科學技術學報，2017,35(3):50-54.

WEI Jie, ZHANG Xiao, ZHANG Guokun, et al. Inhibitory effect ofRussulafarinipesRomell polysaccharide on mice liver senescence[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(3):50-54.

2016 -09 -21

遼寧仙人洞國家級自然保護區大型真菌資源調查項目； 遼寧省教育廳教學研究項目(LYB201611)； 遼寧省社會科學規劃基金資助項目(L15BJY029)。

魏 杰， 女， 副教授， 博士， 主要從事生物活性物質及其功能方面的研究。

TS201.6； R151.3； S646

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