JNK/FOXO3信號通路介導黃連素促人肺腺癌PC-9細胞凋亡的研究

劉紅崗 賴遠陽 朱以芳 同李平 董小平 許娟 張勇 郭海華 李小飛 閆小龍

JNK/FOXO3信號通路介導黃連素促人肺腺癌PC-9細胞凋亡的研究

劉紅崗 賴遠陽 朱以芳 同李平 董小平 許娟 張勇 郭海華 李小飛 閆小龍

目的：探討黃連素（berberine，Ber）誘導肺腺癌PC-9細胞凋亡及c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）/轉錄因子叉頭蛋白3（forkhead box protein O3，FOXO3）信號通路的作用機制。方法：實驗采用完全隨機化的分組方法，分為對照組、Ber組（30、60 μM），分別檢測各組PC-9細胞活力值、凋亡率、ROS含量、caspase 3活性、線粒體膜電位，以及JNK/FOXO3通路和凋亡相關蛋白含量的變化。SP600125特異性抑制JNK（磷酸化）激活后，Ber（0、60 μM）處理細胞24 h，重復上述檢測。結果：Ber有效抑制PC-9細胞活力，促進細胞凋亡（P＜0.05），顯著降低PC-9細胞線粒體膜電位，增加ROS含量和caspase 3活性（P＜0.05），并呈濃度依賴效應；Western blot檢測結果顯示Ber上調p-JNK、FOXO3和Bax的含量（P＜0.05），下調p-FOXO3和Bcl-2的含量（P＜0.05）；SP600125特異性抑制JNK激活后，拮抗Ber下調p-FOXO3含量及其促PC-9細胞凋亡作用（P＜0.05）。結論：Ber可有效抑制肺腺癌PC-9細胞活力、促進細胞凋亡和氧化應激損傷，作用機制可能與上調p-JNK、FOXO3含量和抑制FOXO3磷酸化有關。

黃連素 肺腺癌 PC-9 JNK FOXO3 凋亡

AbstractObjective:To investigate the pro-apoptotic effect of berberine(Ber)on human lung adenocarcinoma PC-9 cell line,and to detect the role of c-Jun N-terminal kinase(JNK)/forkhead box protein O3(FOXO3)signaling in this process.Methods:The PC-9 cells were randomly divided into the control group and the Ber group,which was treated with 30 and 60 μM Ber.The survival rate,apoptotic rate,ROS generation,caspase-3 activity,and mitochondrial membrane potential of cells were detected.Western blot was performed to detect the expression of JNK/FOXO3 signaling and apoptosis-related proteins.A JNK-specific activation inhibitor,SP600125,was used to block the phosphorylation of FOXO3 in PC-9 cells,and then treated with Ber(30 and 60 μM)for further detection after 24 h.Results:Ber treatment resulted in an obvious reduction in cell viability,promotion of cell apoptosis,downregulation of mitochondrial membrane potential,and an increase of ROS and caspase-3 in a dose-dependent manner.Western blot analysis demonstrated that Ber treatment resulted in a significant upregulation of p-JNK,FOXO3,and Bax expression,and a downregulation of p-FOXO3 and Bcl2 levels.Moreover,the inhibition of JNK activation by SP600125 antagonized the anti-FOXO3 phosphorylation role and the pro-apoptotic role of Ber on PC-9 cells.Conclusion:Ber treatment effectively inhibits the viability of PC-9 cells and enhances apoptosis and oxidative stress injury,which may be related to the upregulation of p-JNK and FOXO3 and the downregulation of p-FOXO3.

Keywords:berberine,lung adenocarcinoma,PC-9,JNK,FOXO3,apoptosis

黃連素又稱小檗堿（berberine，Ber），是從毛莨科植物黃連等中藥中提取的異喹啉類生物堿［1-2］，具有抗乳腺癌、肺癌及胃腸道腫瘤等作用，其機制與促進腫瘤細胞凋亡和抑制增殖等相關［2-4］。轉錄因子叉頭蛋白3（forkhead box protein O3，FOXO3）作為抑癌因子參與抑制乳腺癌、肺癌等多種腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡［5-6］。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員之一，持續活化（磷酸化）的JNK可以激活Bcl-2超家族（Bax、Bim、BAD），抑制FOXOs超家族磷酸化后出核降解，進而促進腫瘤細胞凋亡［7-8］。研究發現Ber可激活FOXO3促進肝癌HepG2細胞凋亡［9］，激活JNK促進乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞凋亡［10］。然而，Ber在肺腺癌中的作用機制尚未明確。本研究觀察Ber對肺腺癌PC-9細胞活力、凋亡及JNK/FOXO3通路的影響，研究JNK/FOXO3信號通路是否參與Ber誘導的PC-9細胞凋亡過程，為拓展Ber及靶向JNK/FOXO3信號通路抗肺腺癌提供理論基礎。

作者單位：空軍軍醫大學唐都醫院胸外科（西安市710038）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 肺腺癌PC-9細胞系購自中國科學院上海細胞研究所細胞庫。黃連素（Ber），2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA），二甲基亞砜（DMSO），噻唑藍（MTT）均購自美國Sigma公司。DMEM高糖培養基購自美國Gibco公司。JNK，p-JNK（Thr183/Tyr185），FOXO3，p-FOXO3；B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2），Bcl-2相關X蛋白（Bax）和β-肌動蛋白（βactin）抗體均購自美國Abcam公司。辣根過氧化物酶標記的二抗購自北京中杉金橋生物技術公司。JNK抑制劑SP600125購自美國Sigma公司。線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）購自江蘇南京碧云天試劑公司。TUNEL檢測試劑盒購自德國Roche公司。ROS檢測試劑盒及Caspase-Glo?3/7定量試劑盒購自美國Promega公司。

1.1.2 細胞培養 PC-9細胞使用含10%胎牛血清、0.1 mg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM高糖培養基培養于37℃、5%CO2濕化孵箱中。細胞融合后，使用0.25%胰蛋白酶消化，根據實驗將細胞接種于不同的培養板中。

1.2 方法

1.2.1 噻唑藍（MTT）法檢測細胞活力值 實驗分為對照組、Ber（30、60 μM）組、處理24 h組。Ber先以DMSO溶解，使用時以無血清DMEM高糖培養基稀釋，使DMSO濃度低于0.1%，濾菌后4℃保存備用。以每孔7×103個細胞接種于96孔板，每組設6個復孔，各處理24 h后，棄去培養液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次。加入100 μL無血清的高糖DMEM和10 μL的MTT試劑，37℃孵育4 h后，棄去培養液，加入100 μL的DMSO原液，振蕩15 min，使結晶完全溶解，用酶標儀（波長為490 nm）測定其吸光值（OD值），該實驗重復3次。

1.2.2 TUNEL法檢測細胞凋亡率 細胞培養于共聚焦皿中，于4℃用4%的多聚甲醛固定15 min。PBS洗滌3次，0.1%的Triton X-100打孔15 min，PBS洗滌1次。嚴格按照TUNEL法試劑盒的說明進行操作。在共聚焦顯微鏡下觀察，其中凋亡細胞為綠色熒光，細胞核為藍色熒光，隨機選取10個視野計數，計算凋亡率。

1.2.3 JC-1染色檢測細胞線粒體膜電位 細胞培養3×105個/L種于共聚焦皿中，進行相應處理后，加入JC-1染色工作液，細胞培養箱中37℃孵育20 min，配置適量JC-1染色緩沖液（1×）放置冰浴，染色結束后采用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次，加入細胞培養液在共聚焦顯微鏡下觀察，其中低線粒體膜電位細胞為綠色熒光，正常線粒體膜電位細胞為紅色熒光，隨機選取10個視野計數，計算低線粒體膜電位細胞數目比值。

1.2.4 caspase 3活性測定 以每孔3×106個細胞接種于6孔板，各組細胞處理結束后，收集細胞并裂解提取細胞蛋白。之后每孔加入100 μL Caspase-Glo⑧3/7工作液和一定量的細胞裂解液，室溫下避光孵育1 h，酶標儀檢測熒光強度（波長為400～405 nm）。

1.2.5 ROS含量測定 熒光探針DCFH-DA檢測ROS水平：根據實驗分組處理后將細胞消化并懸浮于DCFH-DA濃度為20 mol/L的PBS中，CO2培養箱孵育細胞2 h，用酶標儀檢測其熒光強度（激發光波長設為485 nm，發射光波長設為530 nm）。酶活性=實驗組吸光度/對照組吸光度×100%。

1.2.6 Western blot檢測 肺腺癌PC-9細胞在裂解緩沖液中勻漿裂解，以12 000 r/min，離心15 min。收集上清液，根據蛋白定量試劑盒說明測定蛋白含量，并調各組蛋白濃度一致。高溫水煮變性冷卻后，蛋白行SDS-聚丙烯凝膠電泳（PAGE）并轉移至硝酸纖維素膜上，將膜浸入含20%脫脂奶粉的TBST緩沖液，室溫封閉2 h，分別用對應的一抗4℃孵育12 h。洗膜后用對應的辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h，洗滌3次，最后用電化學發光試劑顯影，并用軟件分析蛋白的相對表達量（Bio-Rad，West Berkeley，Cal?ifornia，USA），重復3次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 細胞活性檢測

不同濃度Ber（30、60 μM）處理 PC-9細胞 24 h后，相差顯微鏡下觀察細胞形態（圖1A）?？梢夿er可使PC-9細胞變圓、收縮甚至脫落，且Ber濃度越高，變化越明顯。MMT法檢測各組細胞活力值的統計學分析，相較于對照組，可見Ber呈濃度依賴有效抑制PC-9細胞的活力（P＜0.05，圖1B）。

2.2 細胞凋亡率檢測

與對照組相比，不同濃度Ber（24 h）可以有效誘導PC-9細胞凋亡（P＜0.05），且呈濃度依賴性（圖2）。

圖1 不同濃度Ber處理24 h抑制PC-9細胞活力Figure 1 Ber treatment inhibited PC-9 cell viability(24h)

圖2 不同濃度Ber處理24 h對各組細胞凋亡率的影響Figure 2 Effect of Ber treatment on the apoptosis of PC9 cells(24 h)

2.3 線粒體膜電位JC-1染色、ROS含量及caspase3活性測定

與對照組相比，不同濃度Ber（24 h）可以使PC-9細胞線粒體膜電位降低，ROS含量增加，caspase 3活性升高（P＜0.05），并呈濃度依賴性（圖3）。

2.4 Western blot檢測

不同濃度Ber處理PC-9細胞24 h后，提取總蛋白并行Western blot檢測JNK/FOXO3通路和凋亡相關蛋白表達的變化。結果表明，與對照組比較，Ber處理組細胞p-JNK、FOXO3和Bax的表達量上升，而p-FOXO3和Bcl-2的表達下降，且Ber濃度越高變化越明顯（P＜0.05），說明Ber處理可以激活JNK信號通路、促進FOXO3表達且抑制FOXO3磷酸化進而促進PC-9細胞凋亡（圖4）。

2.5 20 μM SP600125抑制PC-9細胞JNK磷酸化后各項檢測

不同處理組（20 μM SP600125，Control，60 μM Ber，20 μM SP600125+60 μM Ber）處理PC-9細胞24 h后，相比于Control組，PC-9細胞細胞活力結果為（97.651±4.130%，100.000±0.000%，53.654±7.825%，75.611±8.625%，P＜0.05）、caspase3活性檢測結果為（98.214±10.690% ，100.000±0.000% ，288.514±27.381%，180.403±24.560%，P＜0.05）。結果表明與對照組相比，20 μM SP600125單獨處理對PC-9細胞活力和caspase3活性無顯著影響（P＞0.05）；然而，應用20 μM SP600125處理抑制JNK激活后，Ber降低PC-9細胞活力及增強細胞內caspase3活性的能力受到明顯抑制。JNK/FOXO3通路和凋亡相關蛋白表達的變化，相比于60 μM Ber組，20 μM SP600125+60 μM Ber組p-JNK、Bax的表達明顯減少，p-FOXO3和Bcl-2表達顯著提高（P＜0.05）；而JNK和FOXO3表達無顯著差異（P＞0.05），說明SP600125抑制JNK磷酸化可上調FOXO3的磷酸化水平，進而拮抗Ber的促凋亡作用（圖5）。

圖3 不同濃度Ber處理24 h對各組細胞JC-1線粒體膜電位、ROS含量及caspase3活性的影響Figure 3 Effect of Ber treatment on JC-1 mitochondrial membrane potential,ROS content,and caspase-3 activity of PC9 cells(24 h)

圖4 Ber處理24 h對PC-9細胞JNK/FOXO3通路和凋亡相關蛋白表達的影響Figure 4 Effect of Ber treatment on JNK/FOXO3 signaling and apoptosis-related proteins of PC9 cells(24 h)

圖5 不同處理方法處理PC細胞24 h對JNK/FOXO3通路和凋亡相關蛋白表達的影響Figure 5 Effect of different treatments on JNK/FOXO3 signaling and apoptosis-related proteins of PC9 cells(24 h)

3 討論

Ber是一種國內臨床常用的中成藥，具有顯著的抑菌功效，多用于治療腸道細菌感染、細菌性痢疾等。此外，研究發現Ber對肝癌、乳腺癌、結腸癌等多種惡性腫瘤具有明確的抑制作用［1-2］，其機制與抑制腫瘤細胞周期，下調血管內皮生長因子抗腫瘤血管生成，減少基質金屬蛋白酶表達抗腫瘤轉移，誘導內質網應激和氧化應激反應促進細胞凋亡等作用有關［2-4，11-12］。本研究發現，Ber具有顯著的抗肺癌作用，可有效降低人肺腺癌PC-9細胞活力，提高氧化應激標志因子ROS含量，增強凋亡因子caspase3活性和降低細胞線粒體膜電位進而促進細胞凋亡，以上結果提示Ber誘導的PC-9細胞凋亡與激活氧化應激損傷有關。

FOXO3作為一種抑癌因子，其激活具有抗腫瘤作用，如抗乳腺癌、肝癌、肺癌等［5-6，13］。研究表明FOXO3進入細胞核后可調控p21、p27、FasL、TRAIL、Bim等多種抑癌因子表達，進而促進腫瘤細胞凋亡、抑制細胞周期、抑制腫瘤轉移［5，13］。FOXO3具有多種化學修飾作用，如磷酸化、乙?；?、甲基化和泛素化［5，14］。FOXO3 的磷酸化可抑制 FOXO3 的轉錄活性，促進其從細胞核向細胞質轉移并在細胞質中被降解，從而抑制FOXO3的抗腫瘤作用［5］。JNK是MAPK家族成員之一，持續活化（磷酸化）的JNK可以抑制PI3K、Akt及14-3-3蛋白的激活，抑制PI3K、Akt及14-3-3蛋白對FOXOs磷酸化作用，減少FOXOs磷酸化后出核降解，進而促進腫瘤細胞凋亡［7-8，15］。

既往研究表明Ber可激活JNK，轉錄后上調Bax含量、抑制Bcl-2表達，進而促進乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞凋亡［10］，激活 FOXO3促進肝癌HepG2細胞凋亡［9］。本研究發現，應用Ber可以顯著提高p-JNK和FOXO3在肺腺癌PC-9細胞中的表達，下調p-FOXO3的含量，抑制FOXO3磷酸化后的降解進而上調FOXO3含量。此外，應用JNK特異性抑制SP600125后可明顯抑制JNK的激活并上調p-FOXO3含量，抑制Ber對PC-9細胞的促凋亡作用，上調抗凋亡蛋白Bcl-2含量并抑制促凋亡蛋白Bax表達。以上研究結果表明，Ber誘導的肺腺癌細胞凋亡作用可能與上調p-JNK、FOXO3含量和抑制FOXO3磷酸化有關。然而，Ber在抗肺腺癌中的具體作用機制尚未完全明確，Ber是如何激活JNK和上調FOXO3表達，以及JNK是否通過抑制PI3K、Akt及14-3-3蛋白的激活降低FOXO3磷酸化仍需深入研究。

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（2017-03-19收稿）

（2017-06-09修回）

Berberine exerts pro-apoptotic effects on PC-9 cells via activation of JNK/FOXO3 signaling

Honggang LIU,Yuanyang LAI,Yifang ZHU,Liping TONG,Xiaoping DONG,Juan XU,Yong ZHANG,Haihua GUO,Xiaofei LI,Xiaolong YAN

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.17.316

Correspondence to:Xiaolong YAN;E-mail:yanxiaolong@fmmu.edu.cn

Department of Thoracic Surgery,Tangdu Hospital,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710038,China

閆小龍 yanxiaolong@fmmu.edu.cn

劉紅崗 專業方向為胸外科常見病多發病的診治。

E-mail：drliuhg@163.com