胰島素、雌激素和培養時間對新生大鼠下頜骨成骨細胞增殖的影響*

鄂玲玲 徐文煥 喬朋艷 邢鶴琳 王 興 馮 琳 呂 燕 王東勝 劉洪臣

·論著·

胰島素、雌激素和培養時間對新生大鼠下頜骨成骨細胞增殖的影響*

鄂玲玲 徐文煥 喬朋艷 邢鶴琳 王 興 馮 琳 呂 燕 王東勝 劉洪臣

目的：探討胰島素、雌激素和培養時間對體外培養的新生大鼠下頜骨成骨細胞(new born ratmandibular osteoblasts，NRMOBs)增殖的影響。方法：取新生6-7天SD乳鼠下頜骨，原代培養下頜骨成骨細胞，選取生長狀態良好的第4代細胞，在糖生理濃度(5.5mM)下與6ug/m L胰島素(Insulin)和/或10-9mol/L雌激素(E2)共同孵育，于1，3，5，7，9d采用MTT(Methy lthiazol Tetrazolium，MTT)法檢測胰島素和雌激素對體外培養的NRMOBs增殖的影響。結果：所培養的NRMOBs陽性表達波形絲蛋白、骨鈣素，角蛋白表達陰性，分泌堿性磷酸酶，形成鈣結節。NRMOBs在5.5mM葡萄糖下培養，1d時，雌激素顯著抑制細胞增殖；7d，9d時，胰島素顯著促進細胞增殖，5.5mM+Insulin組細胞增殖顯著高于5.5mM+E2組；雌激素與胰島素聯合應用對細胞的增殖無影響。結論：在不同的培養時間，胰島素或雌激素單獨應用均影響NRMOBs增殖，胰島素與雌激素聯合應用能調節胰島素或雌激素單獨應用時對NRMOBs增殖的影響。

成骨細胞；胰島素；雌激素；下頜骨；大鼠

牙周病、糖尿病、骨質疏松癥以及衰老等均可以造成牙槽骨吸收、牙周膜與牙槽骨的附著喪失、牙骨質的厚度和結構發生改變[1-6]，這常常會影響患者行種植牙手術以及術后骨結合率。因此，牙槽骨再生以及提高牙種植骨結合率是目前牙科醫生研究的熱點之一。胰島素是由胰島β細胞受內源性或外源性物質如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質激素。雌激素是由卵巢分泌的雌性脊椎動物的性激素，具有促進第二性征出現的作用。以胰島素分泌絕對或相對不足為特征的糖尿病伴隨著絕經后雌激素分泌減少為特征的骨質疏松癥，影響了骨代謝的最終效應細胞之一的成骨細胞的增殖與分化。研究已證實胰島素除了調控糖、蛋白質和脂肪的合成代謝外還同時具有生長因子樣特性，是體內重要的生長因子之一，對成骨細胞的增值、分化有著重要影響[7]。雌激素屬類固醇激素，研究表明雌激素通過直接調節機制、旁分泌機制和細胞凋亡機制對成骨細胞和破骨細胞發揮重要作用[8]，這些成骨細胞胚成起源多是中胚層，而頜骨成骨細胞胚成起源是來自于神經嵴，胰島素以及雌激素又是怎樣影響頜骨成骨細胞的增殖呢？目前，胰島素和雌激素隨著培養時間的延長對頜骨成骨細胞增值的共同作用如何報道較少，為此本實驗針對這些體內重要的激素在牙槽骨喪失及頜骨的骨質疏松中的作用，分析胰島素及雌激素隨著培養時間的延長對新生大鼠下頜骨成骨細胞增殖的影響，為這些激素在臨床上如何更好的應用在牙槽骨再生、牙種植術骨結合中提供一定的實驗基礎。

1.材料和方法

1.1 材料與儀器 L-DMEM(GIBCO公司，美國)，胰蛋白酶(Am resco公司，美國)，胎牛血清(Fetal bone serum,FBS,GIBCO公司，美國)，噻唑藍(Methy lthiazol Tetrazolium MTT、牛血清白蛋白，Sigma公司，美國)，小鼠抗人波形絲蛋白、角蛋白抗體、大鼠抗兔骨鈣素抗體(中杉金橋公司，北京)， 4′,6-diam idino-2-pheny lindole(DAPI,Biotium，美國)，羅丹明(TRITC)標記的山羊抗小鼠/兔IgG，(Jackson，美國)，正常山羊血清(中杉金橋公司，北京)，其他相關試劑均為國產分析純試劑。

水浴振蕩器(HZS-HA，哈爾濱東明醫療儀器廠)，溫控超速離心機(Eppendorf,德國)，超凈工作臺(長城空氣凈化，北京)，ELx800uv酶聯免疫檢測儀(Bio-Tek，美國)，3111型CO2恒溫孵箱(ThermoForma，美國)，細胞培養瓶、細胞培養板(Corning，美國)，DM IL倒置相差顯微鏡及MPS30曝光系統(Leica，德國)，FV 500全反射激光共聚焦顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 NRMOBs的原代培養 用酶消組織塊培養法[9]培養新生大鼠下頜骨成骨細胞。將SD新生6-7d的乳鼠(解放軍總醫院動物中心購買，SPF級)置于75%酒精中浸泡5m in，取出下頜骨，剝離肌肉和筋膜，將下頜骨剪成1mm×1mm×1mm的骨片，加0.125%胰酶，在水浴振蕩器中37℃、140rpm消化8m in，消化6次后終止，離心收集經酶消化后的組織塊，再次剪碎，鋪于培養瓶中加含20%胎牛血清L-DMEM在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下放置于恒溫孵箱倒置培養，4小時后翻瓶。待細胞爬出長至匯合單層時傳代，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態，取第4代細胞用于實驗。

1.3 NRMOBs的鑒定 將第4代新生大鼠下頜骨成骨細胞以1×105個細胞/m L接種在蓋玻片上，細胞培養3d時棄去培養液，95%酒精固定15m in后，用免疫熒光染色[10]檢測波形絲蛋白、角蛋白、骨鈣素。方法簡述如下：取出細胞爬片，PBS漂洗3×5m in。室溫下用0.5%TritonX-100作用10m in，PBS漂洗3×5m in。封閉血清室溫孵育20m in后，加一抗波形絲蛋白、角蛋白、骨鈣素(1∶100)，PBS代替一抗為空白對照，4℃下過夜，PBS漂洗3×5m in，然后用TRITC標記的二抗(1∶50)室溫下作用45m in，PBS漂洗3×5m in，DAPI染核15m in，PBS漂洗3×5m in。用90%的甘油PBS溶液封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察、照相。

將第4代NRMOBs以1×105個細胞/m L接種在蓋玻片上，細胞培養7d時棄去培養液，95%酒精固定15m in后，用Gomori鈣-鈷法[9]進行堿性磷酸酶染色。

將第4代NRMOBs以1×105個細胞/m L接種在蓋玻片上，細胞培養28d后用95%乙醇固定15m in后，蒸餾水漂洗，加入2%茜素紅溶液(用2%酒精配制，PH 8.3)染色5m in，自來水沖洗5次后，封片，顯微鏡下觀察、照相。

1.4 實驗分組 為了探討胰島素及雌激素對體外培養NRMOBs增殖的影響，本實驗共分為4組：5.5mM葡萄糖、5.5mM葡萄糖+6ug/m L胰島素、5.5mM葡萄糖+10-9mol/L雌激素、5.5mM葡萄糖+6ug/m L胰島素+10-9mol/L雌激素。

1.5 胰島素和雌激素對體外培養的NRMOBs增殖實驗 取第4代對數生長期細胞，胰蛋白酶消化、離心、重懸后，接種細胞于96孔板中，接種密度為5×104/m L，每孔接種0.2m L。細胞貼壁24h后，換用含0.2%牛血清白蛋白無血清L-DMEM培養液饑餓24h，然后按實驗分組加含5%胎牛血清、5.5mM葡萄糖、和/或6ug/m L胰島素及10-9mol/L雌激素的L-DMEM繼續培養，每3d換一次液，第1、3、5、7、9d采用MTT比色法于490nm處測定細胞吸光值，每組設8個樣本。

1.6 統計學分析 結果以均值表示，采用SPSS13.0統計軟件的三因素方差分析以及單因素方差分析對數據進行統計學分析，當方差齊時采用Bonefrroni法，當方差不齊時采用Talnhane法，P＜0.05為差異具有顯著性。

2.結果

2.1 原代細胞及傳代細胞的形態學觀察 在倒置顯微鏡下觀察，原代培養24h后，經酶消化后的下頜骨組織塊已貼壁。3d后，細胞從貼壁的下頜骨碎片爬出，呈三角形或梭形(圖1A)。數天后爬出的細胞明顯增加，以骨塊為中心，向周圍呈鱗片樣生長，瓶底長滿至90%即可傳代。傳代后的細胞核明顯增大，形態多樣化，胞漿豐富，向外伸展出生長突，生長突逐漸增多，細胞借突起相互連接，呈重疊生長(圖1B)。

2.2 NRMOBs的鑒定 第4代的NRMOBs免疫熒光染色結果發現，培養的細胞胞漿角蛋白表達陰性(圖2A)，波形絲蛋白呈陽性反應，染成綠色(圖2B)，骨鈣素表達陽性(圖2C)，DAPI染核成藍色。ALP染色結果顯示，細胞質內有黑色顆粒狀物質，有少量分散在細胞周圍(圖1C)。第4代成骨細胞傳代后，細胞匯合時均呈多層重疊生長，細胞呈矮柱形或方形，可在局部聚集成灶，形成鈣結節，茜素紅染色鈣結節被染成橘紅色顆?；驂K狀沉淀(圖 1D)。

圖1 NRMOBs的培養及鑒定A.原代培養5d的NRMOBs(×100)B.P4 的 NRMOBs(×100)C.P4代NRMOBs組織學染色ALP陽性 (×100)D.P4代NRMOBs鈣結節茜素紅染色 (×100)

圖2 NRMOBs的鑒定A.P4代NRMOBs免疫熒光染色角蛋白表達陰性，DAPI染核成藍色 (×200)B.P4代NRMOBs免疫熒光染色波形絲蛋白表達陽性，染成紅色，DAPI染核成藍色 (×200)C.P4代NRMOBs免疫熒光染色骨鈣素表達陽性，染成紅色，DAPI染核成藍色 (×200)

2.3 胰島素、雌激素及培養時間對5.5mM葡萄糖培養下的NRMOBs增殖的影響 第四代NRMOBs在含5.5mM、5.5mM+insulin、5.5mM+E2、5.5mM+insulin+E2的完全培養基中培養，于1、3、5、7、9d時進行MTT實驗。數據進行三因素方差分析，統計結果發現，因素胰島素，P=0.003；因素雌激素，P=0.007；因素時間，P=0；因素胰島素*雌激素的交互作用，P=0.845；因素胰島素*時間的交互作用，P=0.394；因素雌激素*時間的交互作用，P=0.453；因素胰島素*雌激素*時間的交互作用，P=0.299。四組細胞隨著培養時間的延長，細胞不斷增殖，1d時，胰島素、雌激素、胰島素與雌激素聯合應用均抑制了細胞的增殖，但僅僅雌激素的抑制作用具有顯著的意義(P＜0.05)；3、5d時，胰島素、雌激素、胰島素與雌激素聯合應用開始促進細胞的增殖，與5.5mM組沒有了明顯的差異；到了7、9d時，與5.5mM組比，胰島素已顯著促進了細胞的增殖(P＜0.05)，同時，5.5mM+insulin組的細胞增殖也顯著高于5.5mM+E2組(P＜0.05)。胰島素和雌激素聯合在5個時間點中對細胞的增殖作用與5.5mM組沒有差別(圖3)。

圖3 胰島素及雌激素對5.5mM葡萄糖培養下的NRMOBs增殖的影響(x± s，n=8)。P＜0.05，*分別與相應時間點5.5mM葡萄糖組比較；分別與相應時間點5.5mM+insulin組比較。

3.討論

牙槽骨再生常常受到牙周病、系統性疾病以及衰老等的影響，從而影響牙種植體早期骨結合率。胰島素是由胰島β細胞受內源性或外源性物質如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質激素，除了調控糖、蛋白質和脂肪的合成代謝外還同時具有生長因子樣特性，是體內重要的生長因子之一，對成骨細胞的增值、分化有著重要影響[7]。雌激素是由卵巢分泌的雌性脊椎動物的性激素，具有促進第二性征出現的作用，屬類固醇激素，研究表明雌激素通過直接調節機制、旁分泌機制和細胞凋亡機制對成骨細胞和破骨細胞發揮重要作用[8]。下頜骨成骨細胞是來源于頜骨的一種成骨細胞，在牙槽骨再生和重建中起著重要作用，下頜骨成骨細胞表面存在著胰島素受體和雌激素受體[11,12]，胰島素和雌激素是如何影響其增值，倆者對其增值的共同作用如何？其確切的機制不清楚，并且缺乏來自細胞學的直接證據。

基于此，本實驗將新生大鼠下頜骨成骨細胞置于生理糖濃度5.5mM下培養，加入胰島素和/或雌激素，觀察體外培養的大鼠下頜骨成骨細胞的增殖情況。在5.5mM糖濃度培養下，細胞增殖的數據進行三因素方差分析，統計結果發現，因素胰島素P=0.003；因素雌激素P=0.007；因素時間P=0；因素胰島素*雌激素的交互作用P=0.845；因素胰島素*時間的交互作用P=0.394；因素雌激素*時間的交互作用P=0.453；因素胰島素*雌激素*時間的交互作用P=0.299。統計學結果可見，NRMOBs在生理糖濃度5.5mM培養下，胰島素或雌激素或培養時間單獨對NRMOBs的增殖均有顯著效應，但胰島素*雌激素、胰島素*時間、雌激素*時間、胰島素*雌激素*時間對NRMOBs的增殖均沒有交互效應；雌激素在1d時顯著抑制了NRMOBs的增殖(P＜0.05)，隨著培養時間的延長3-9d時，雌激素對NRMOBs增殖的抑制作用降低，與對照組沒有了差別；在1-5d時，胰島素對NRMOBs的增殖沒有影響，到7、9d時開始顯著促進細胞的增殖，但胰島素和雌激素聯合應用在5個時間點中對細胞的增殖均沒有影響。1d時，雌激素在生理糖濃度下抑制細胞的增殖，隨著培養時間的延長，雌激素對細胞增殖無影響，這或許是正常細胞早期時對雌激素的一個急性應激反應。胰島素早期時對生理糖濃度下NRMOBs的增殖無影響，隨著培養時間的延長開始顯著促進細胞的增殖，這種促進細胞增殖的能力顯著高于雌激素，可見，在生理糖濃度下，胰島素和雌激素對NRMOBs增殖的影響各不相同，胰島素隨著應用時間的延長促進細胞增殖，雌激素短期時抑制細胞增殖，且兩者沒有交互效應。

本研究結果證實在生理濃度的葡萄糖下胰島素促進下頜骨成骨細胞增值，雌激素抑制下頜骨成骨細胞的增值，為倆者在臨床上更好的應用于牙槽骨再生以及提高牙種植體骨結合率提供了一些實驗依據。在高糖情況下胰島素以及雌激素隨著培養時間的延長又是如何影響下頜骨成骨細胞的增值，倆者共同作用又如何，課題組將進行進一步的研究。

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Effectsof insulin,estrogen and culture time on the proliferation of newborn ratmandibular osteoblasts

E Ling-ling,XUWen-huan,QIAO Peng-yan,XING He-lin,WANG Xing,FENG Lin,LV Yan,WANG Dong-sheng,LIU Hong-chen
(Stomatologic institute,Chinese PLAGeneralHospital,Beijing 100853,China)

Objective:To investigate theeffectof insulin(In),estrogen(E2)and culture timeon the proliferation ofnewborn ratmandibular osteoblasts(NRMOBs).M ethods:The NRMOBs were cultured in vitro.The effect of insulin(6ug/m L)and/or estrogen(10-9mol/L)and/or culture time on NRMOBswas investigated.The NRMOBs proliferation was examined after1、3、5、7、9 daysof culture using Methylthiazol Tetrazolium(MTT).Results:The NRMOBs positively expressed vimentin and osteocalcin,negatively expressed keratin,secreted alkaline phosphatase(ALP),and produced calcium nodules.When NRMOBswere cultured in themediaw ith 5.5mM glucose,estrogen significantly decreased the cells proliferation at 1 day of culture,insulin significantly increased the cells proliferation at 7,9 day of culture.Compared to 5.5mM+E2,5.5mM+Insulin significantly increased NRMOBs proliferation at 7,9 day of culture.The combination of insulin and estrogen had no effecton the proliferation of NRMOBsatevery time point.Conclusion:This study suggests that insulin or estrogen alone affects NRMOBs proliferation in different culture time.The combination of insulin and estrogen can adjust the effectof insulin orestrogen alone on NRMOBs proliferation.

osteoblasts;insulin;estrogen;mandibular;rat

R783

A

1672-2973(2017)05-0257-05

國家自然科學基金(項目編號：81271180)解放軍總醫院臨床科研扶持基金(項目編號：2016FC-CXYY-2007；2015FC-CXYY-1003)

鄂玲玲 解放軍總醫院口腔醫學研究所 副研究員 北京 100853

徐文煥 共同第一作者 解放軍總醫院醫務部訓練(研究生)處 助理員 北京 100853

喬朋艷 解放軍總醫院口腔醫學研究所 博士后 北京 100853

邢鶴琳 解放軍總醫院口腔醫學研究所 博士后 北京 100853

王 興 解放軍總醫院口腔醫學研究所 博士后 北京 100853

馮 琳 解放軍總醫院口腔醫學研究所 博士后 北京 100853

呂 燕 解放軍總醫院口腔醫學研究所 實驗員 北京 100853

王東勝 解放軍總醫院口腔醫學研究所 副主任技師 北京 100853

劉洪臣 通訊作者 解放軍總醫院口腔醫學研究所 所長 主任醫師 教授 北京 100853

2017-06-10)