博落回中芐基異喹啉類生物堿生物合成與代謝工程研究概況△

劉金鳳，黃鵬，唐昭山，曾建國*

(1.湖南農業大學 獸用中藥資源與中獸藥創制國家地方聯合工程研究中心，湖南 長沙 410128；2.湖南美可達生物資源股份有限公司，湖南 長沙 410005)

·綜述·

博落回中芐基異喹啉類生物堿生物合成與代謝工程研究概況△

劉金鳳1，黃鵬1，唐昭山2，曾建國1*

(1.湖南農業大學 獸用中藥資源與中獸藥創制國家地方聯合工程研究中心，湖南 長沙 410128；2.湖南美可達生物資源股份有限公司，湖南 長沙 410005)

植物生長產生多種多樣的次生代謝產物，其中許多還有非常重要的藥用價值。但是植物中具有藥用價值的次生代謝產物含量較低，而利用微生物代謝工程技術可以為次生代謝產物提供新的藥源途徑。本文對植物次生代謝產物特別是博落回屬植物中芐基異喹啉類生物堿的生物合成以及國內外研究中利用微生物代謝工程技術在酵母中異源表達生產芐基異喹啉類生物堿的研究進展進行綜述，同時結合博落回研究進展對未來博落回資源的綜合利用進行展望。

芐基異喹啉類生物堿；博落回；生物合成；微生物代謝工程

1 植物次生代謝產物

植物在次生代謝(Secondary metablism)過程中通常以一個特定的方式合成、運輸和儲存多種不同類型的次生代謝產物(Secondary metabolites)，這些次生代謝產物不參與植物的初級代謝或能量代謝，是植物生長非必需的小分子有機化合物。在植物的生物進化過程中，它們可以作為一種保護自己的內生物質用于防御病蟲害以及細菌、真菌、病毒等的侵襲[1-4]。

根據已經被鑒定出的次生代謝產物結構，可以將其分為含氮和不含氮兩種類型。在含氮的次生代謝產物中，生物堿結構類型超過了20 000種[5]。已經被分離鑒定和具有重要藥用價值的次生代謝產物包括具有抗腫瘤作用的長春花堿、紫杉醇、喜樹堿等，具有鎮痛鎮咳作用的罌粟堿、可待因、嗎啡等，具有鎮咳作用的二甲基嗎啡、諾司卡品等，具有鎮靜作用的東莨菪堿、利血平等，具有抗菌作用的小檗堿、血根堿等，具有抗瘧作用的金雞納堿、青蒿素等，可作為男性保健品的育亨賓堿等[6-8]。在無氮的次生代謝產物中，也有很多的結構已經被鑒定，其中最大的一類是萜類，其中的半萜、倍半萜、二萜和三萜都有很重要的生物活性[6-7，9]；另外一類具有生物活性的無氮次生代謝產物是多酚類，其特點是存在多個酚羥基，這些酚羥基在生理條件下可離解為氧負離子，從而發揮良好的生物活性[2]。此外，含有酚羥基的化合物還有木脂素類、香豆素類、糖類和醌類等化合物[3-4]。

2 博落回中芐基異喹啉類生物堿的生物合成

芐基異喹啉類生物堿是博落回中的重要活性成分。比如血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿、別隱品堿等。在其他物種中芐基異喹啉類生物堿的生物合成屢見報道[10-15]，包括四氫異喹啉類、嗎啡烷、原小檗堿、苯并菲啶和阿樸菲生物堿等的生物合成，其中四氫異喹啉類、嗎啡烷和原小檗堿的生物合成途徑幾乎已完全被闡明，大部分的相關基因被成功克隆和表達[16-23]。芐基異喹啉生物堿由苯丙氨酸和酪氨酸衍生而來，并在復雜的生化網絡中經由分子內耦合、還原、甲基化、羥基化等反應生成多種結構[10]。目前芐基異喹啉生物堿生物合成基因的主要來源植物是罌粟Papaversomniferum、花菱草Eschscholziacalifornica、墨西哥薊罌粟Argemonemexicana、日本黃連Coptisjaponica、草甸蕓香Thalictrumflavum、伏牛Berberiswilsoniae[24]以及博落回屬植物[25]。見圖1。

注：實線代表一步反應；虛線代表多步反應；BBE.小檗堿橋酶；CFS.華紫堇堿合酶；SMT.金黃紫堇堿9-O-甲基轉移酶；TDC.四氫小檗堿合酶；SPS.金罌粟堿合酶；TNMT.四氫化原小檗堿cis-N-甲基轉移酶；MSH.P450依賴型N-甲基刺罌粟堿14-羥化酶；P6H.原阿片堿6-羥化酶；DBOX.二氫苯并菲啶氧化酶。圖1 博落回中主要生物堿生物合成簡圖

3 酵母代謝工程生產BIAs

酵母是重建復雜的植物化合物生物合成途徑的微生物首選，主要原因是酵母有一個可以利用的全基因組代謝模型，并且許多植物的酶，比如細胞色素P450、異戊烯基轉移酶和FAD-依賴型氧化還原酶，都需要一個最佳的表達活性的真核細胞環境。近年來，國外一些學者在酵母中構建了BIAs的生物合成途徑。如，Martin團隊[26]將罌粟中血根堿生物合成通路上的多個基因重組到酵母中，實現了多基因在酵母中的共表達，并生成高藥用價值的血根堿。Hawkins等[27]通過基因重組，在酵母中合成了BIAs生物合成通路中的重要中間體(S)-reticuline。D.Smolke團隊[28]通過構建不同物種的細胞色素P450和還原酶基因的重組酵母，并進行培養條件優化，提高了BIAs在酵母中生產的產量，同時還對原小檗堿生物堿在酵母中的合成進行了優化[29]。2015年，SCIENCE報道了Galanie等在酵母中實現了嗎啡的全合成[30]，這也是首次實現嗎啡在酵母中的全合成，該研究為今后實現其他BIAs的全合成奠定了堅實的基礎。

4 博落回屬植物中BIAs生物合成進展

博落回屬植物包括博落回和小果博落回，其中含有的血根堿、白屈菜紅堿等BIAs具有良好的抑菌、抗炎作用，在歐洲已成為飼用抗生素的良好替代品[25]。從2006年1月開始歐盟全面禁止在飼料中添加任何抗生素，導致血根堿的需求逐年增加。目前血根堿的主要來源是從博落回植株中提取，而博落回作為一種野生資源，這種獲取方式導致其野生資源的存儲量逐年減少。由于還未實現大規模的人工種植，導致了目前只能通過獲取野生資源來提取血根堿。又由于芐基異喹啉類生物堿分子結構的復雜性，通過化學合成血根堿的成本很高，也不利于產品開發[31]。雖然利用植物細胞培養生產次生代謝產物在一定程度上能緩解藥用植物資源的緊缺，但是由于次生代謝物的細胞內自毒性高，使得許多組培材料中的次生代謝產物不積累或者含量很低，再加上生產成本較高等因素限制了組培技術的利用。因此，找到一種可替代和可持續高效生產BIAs的方法是當務之急。雖然國際上已有一些科研團隊正在進行產BIAs的工程菌構建工作，但是由于罌粟和花菱草等植物的生物信息數據有限以及從這些植物中克隆的功能酶轉化效率不高等因素影響了工程菌的產出效率。

本課題組在前期基于博落回中生物堿質譜裂解規律建立了一套新的方法，鑒定了博落回中異喹啉類生物堿，并為博落回中生物堿的合成規律預測奠定了研究基礎[32]。在研究博落回的生物堿合成規律研究中，我們通過對博落回中不同組織部位的生物堿組織化學定位發現，根中生物堿出現在中柱鞘外的薄壁細胞和導管周圍；莖和葉柄中的生物堿主要出現在維管束周圍，偶爾也出現在莖的髓細胞中?？傮w上，莖中的生物堿積累量少于根。利用激光顯微切割，結合超高效液相色譜串聯四級桿/飛行時間質譜儀(UPLC-MS/MS)技術測定了博落回根中6種生物堿(血根堿、原阿片堿、別隱品堿、白屈菜紅堿、二氫白屈菜紅堿和二氫血根堿)，發現其主要分布在木栓層和木質部維管束，并推測博落回中的生物堿合成部位是根部[33-34]。2012年通過對博落回和小果博落回轉錄組進行高通量測序[25]，通過10個在不同時間、不同組織器官和不同種樣本的轉錄組、蛋白質組和代謝數據對博落回屬植物的生物堿生源合成的可能機理進行探索。博落回轉錄組數據組裝和聚類之后，兩個種分別得到了69 367和78 255條unigenes。序列分析說明，大約2/3的unigenes與公共數據庫中的序列是相似的。因此，在分析中對于控制生物堿代謝通路中酶的關鍵基因的表達進行了多層次比較和分析。同時，還通過對轉錄組數據注釋找到了血根堿合成通路中所有功能基因的同源基因，并對參與血根堿合成的重要功能基因TYDC、STOX和去甲烏藥堿合成酶基因NCS等進行了生物信息預測與克隆[35-37]。為了進一步解析博落回血根堿與白屈菜堿合成規律和相關基因的克隆，本團隊在轉錄組測序基礎上對博落回進行了全基因組測序(de novo)、組裝及注釋，并結合同位素示蹤和轉錄組代謝組進行大數據分析，克隆了參與血根堿合成的14個基因，并進行了酵母異源表達驗證，目前正在進行后期的個性化生物信息分析和文章撰寫，并將于2017年公布基因組數據。目前博落回作為罌粟科首個完成全基因組測序的物種，其生物信息數據可以對參與BIAs合成的功能基因進行更細致的研究，也有望找到轉化效率更高且更有利于構建工程菌的功能基因。

5 展望

隨著博落回植物全基因組和轉錄數據的公布，以及功能基因的不斷深入研究，以及相關功能基因的不斷深入研究，綜合利用微生物系統的快速繁殖、培養簡單和成本低等優點，將基因工程技術和微生物系統有機結合起來，把植物中合成BIAs的功能基因重組到酵母中生產目的BIAs，在未來一定可以為BIAs的生產提供新的藥源途徑。

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OverviewsinBiosynthesisofMacleayacordataSecondaryMetabolitesandMetabolicEngineering

LIU Jinfeng1，HUANG Peng1，TANG Zhaoshan2，ZENG Jianguo1*

(1.NationalandLocalUnionEngineeringResearchCenterfortheVeterinaryHerbalMedicineResourcesandInitiative，HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China；2.MicolltaBioresourceInc，Changsha410005，China)

Plant growth produces a wide variety of secondary metabolites，many of which have very important medicinal value.However，the content of secondary metabolites with significant medicinal value are low in plants，while the use of microbial metabolic engineering technology can provide a new source of secondary metabolites pathway.In this paper，we reviewed the biosynthesis of plant secondary metabolites，especially the benzylisoquinoline alkaloids ofMacleayaspp.，as well as the research progress of heterologous expression and production of benzylisoquinoline alkaloids in yeast using microbial metabolic engineering technology in China and abroad.At the same time，a prospect of the comprehensive utilization ofMacleayaspp.resources in the further future is discussed.

Benzylisoquinoline alkaloid；Macleayacordata(Willd.) R.Br.；biosynthesis；microbial metabolic engineering

國家自然科學基金資助項目(31200615)；湖南省科技重點計劃(2016SK3002)

*

曾建國，教授，研究方向：中藥資源與綜合利用研究；Tel：(0731)84673824，E-mail：zengjianguo@hunau.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.10.029

2017-02-20)