類風濕關節炎患者檢測血清14-3-3η蛋白和自身抗體的臨床意義①

曾婷婷 譚立明 陳娟娟 蔣永清 吳 洋 田永建 余建林 李 華 段新旺

(江西省醫學檢驗重點實驗室，南昌大學第二附屬醫院檢驗科,南昌 330006)

類風濕關節炎患者檢測血清14-3-3η蛋白和自身抗體的臨床意義①

曾婷婷 譚立明 陳娟娟 蔣永清 吳 洋 田永建 余建林 李 華 段新旺

(江西省醫學檢驗重點實驗室，南昌大學第二附屬醫院檢驗科,南昌 330006)

目的探討血清14-3-3η蛋白與自身抗體檢測對類風濕關節炎(RA)診斷的臨床價值。方法收集134例RA患者、90例非RA關節病變患者及同期40例健康體檢者血清樣本，采用ELISA和速率比濁法分別檢測14-3-3η蛋白、抗CCP抗體(anti-CCP)、抗RA33抗體(anti-RA33)、抗Sa抗體(anti-Sa)和類風濕因子(RF)含量，并分析其對RA的診斷價值。結果①血清14-3-3η蛋白、anti-CCP、anti-RA33、anti-Sa、RF水平在RA組均顯著高于非RA組和對照組，組間差異都具有統計學意義；②繪制各指標ROC曲線，14-3-3η蛋白、anti-CCP、anti-RA33、anti-Sa、RF曲線下面積(AUC)分別0.831、0.852、0.615、0.706和0.739，均P<0.01；其中14-3-3η蛋白和anti-CCP達到中等以上診斷價值，對應cutoff值分別為2.59 ng/ml 和24.10 U/ml;③ 所有指標中anti-Sa特異度最強為97.69%，RF靈敏度最高為83.58%；14-3-3η診斷RA的特異度為91.54%僅稍次于anti-Sa和anti-RA33抗體，但其敏感度較anti-Sa和anti-RA33均高。結論14-3-3η蛋白、anti-CCP、anti-RA33、anti-Sa和RF在RA中均顯著升高，對RA的診斷都有一定的價值。同時，14-3-3η診斷RA的敏感度和特異度相比自身抗體更有一定優勢，可以作為輔助診斷RA的指標。

類風濕關節炎；14-3-3η蛋白；抗CCP抗體；抗Sa抗體；抗RA33抗體；類風濕因子

類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)是臨床常見的自身免疫病，患者血清中可以檢測出多種自身抗體。類風濕因子(Rheumatoid factor,RF)和抗環瓜氨酸肽抗體(anti-cyclic citrullinated peptide antibody,anti-CCP)結合關節和影像表現能夠確診典型病例；然而RA表現多樣，部分不典型的早期和(或)血清學陰性的患者常被誤診、漏診[1]。因此，完善RA現有診斷策略，提高診斷水平十分重要。通過查閱文獻發現，14-3-3η蛋白在RA血清和關節滑液中顯著升高，并能上調多種與RA相關的炎癥因子的表達[2,3]，提示其可能參與RA疾病發生。本研究通過測定2014年10至2017年2月就診于南昌大學第二附屬醫院的134例RA、90例非RA炎性關節病變患者及該院同期40例健康體檢者血清14-3-3η蛋白、anti-CCP、抗RA33抗體(anti-RA33)、抗Sa抗體(anti-Sa)和RF水平，分析比較14-3-3η蛋白和幾種自身抗體在RA診斷中的價值。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象 受試對象均為2014年10月至2017年2月南昌大學第二附屬醫院門診及住院患者或健康體檢者。134例RA患者為RA組，男34例，女100例，男女比例1∶2.94，年齡25～83歲，平均(51.90±11.79)歲；Non-RA組為90例非RA關節病變患者，其中OA70例，男20例，女50例，男女比例1∶2.5，年齡28～76歲，平均(52.76±10.30)歲，AS患者20例，男8例，女12例，男女比例1∶1.5，年齡25～79歲，平均(47.80±13.11)歲；對照組為40例該院健康體檢者，男10例，女30例，男女比例1∶3，年齡35～83歲，平均(53.23±11.13)歲。所有患者均符合相關指南診斷標準[4-6]，并經風濕免疫科醫生確認。組間性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05)。所有標本均在患者知情同意條件下獲得，并獲得南昌大學第二附屬醫院倫理委員會批準許可。

1.1.2試劑 采用ELISA法測定所有研究對象血清14-3-3η蛋白、anti-CCP、anti-Sa和anti-RA33水平。人14-3-3η蛋白ELISA試劑盒購自美國Flarebio生物技術有限責任公司，anti-CCP試劑盒購自上?？菩律锛夹g股份有限公司，anti-Sa和anti-RA33抗體ELISA試劑盒分別購自德國EROIMMUE和IMTEC公司；RF采用美國貝克曼公司IMMAGE 800型全自動特定蛋白分析系統及配套試劑，通過速率散射比濁法測定。操作均嚴格按照試劑說明書及南昌大學第二附屬醫院質量管理標準文件進行檢測。

1.2方法

1.2.1納入標準 符合所有條件者予以納入:①簽署知情協議，自愿參與;②診斷明確，臨床、影像學資料詳實;③對入選患者的資料重新評估，否定合并其他自身免疫疾病;④健康體檢者各系統常規檢查無異常。

1.2.2排除標準 以下情況者予以剔除:①合并嚴重心、肺、肝、腎臟等系統疾病，甲狀腺疾病、糖尿病;②妊娠或哺乳期婦女;③不符合納入標準者。

2 結果

2.1血清14-3-3η蛋白和自身抗體水平 血清14-3-3η蛋白、RF、anti-CCP、anti-Sa、anti-RA33在RA組均顯著高于Non-RA組和健康對照組，組間差異有統計學意義(P<0.01)；14-3-3η和RF水平在non-RA組和健康對照組間差異也具有統計學意義(P<0.01)，見表1。

2.2血清14-3-3η檢測結果ROC曲線分析 根據各組指標所測得水平繪制ROC曲線，AUC分別：14-3-3η蛋白為0.831，95%可信區間0.782-0.881；anti-CCP為0.852，95%可信區間為0.802-0.901；anti-RA33為0.615，95%可信區間為0.546-0.684；anti-Sa為0.796，95%可信區間為0.643-0.770；RF為0.739，95%可信區間為0.676-0.802；P值均小于0.01；所測指標中僅14-3-3η和anti-CCP對RA診斷達到中等以上診斷價值，對應cutoff值分別為2.59 ng/ml 和24.10 U/ml，見圖1。

2.314-3-3η蛋白、anti-CCP、anti-RA33、anti-Sa和RF檢測結果臨床評價

2.3.1計算各指標的AUC、敏感度、特異度、準確度、約登指數(Youden index,YDI)、陽性預測值(Positive predict value,PPV)、陰性預測值(Negative predict value,NPV)、陽性似然比(+LR)和陰性似然比(-LR)，評價14-3-3η和自身抗體對RA的診斷價值，見表2。

2.3.2將所測檢測指標兩兩聯合，進行串聯分析和并聯分析，計算指標聯合后診斷RA的敏感度特異度和約登指數，見表3。

Groups14-3-3η(ng/ml)Anti-CCP(U/ml)Anti-RA33(U/ml)Anti-Sa(U/ml)RF(U/ml)RA3.63±2.16296.96(757.96)21.13(64.32)19.05(53.61)245.89(1110.53)Non-RA1.62(1.39)15.57(12.44)18.31(8.80)15.40(6.62)19.53(195.62)Control0.27(0.44)17.03±20.0116.59±5.2814.28±3.4413.39±3.53Pa1)<0.01<0.010.049<0.01<0.01Pb1)<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01Pc1)<0.011.0000.5690.47<0.01

Note：1)Kruskal-Wallis and post hoc Nemenyi test.Pa.RA vs Non-RA;Pb.RA vs control;Pc.Non-RA vs control.

表214-3-3η和自身抗體檢測結果臨床評價

Tab.2Clinicalevaluationof14-3-3ηandauto-antibodies

GroupsAUCSe(%)Sp(%)AccuracyYDIPPVNPV+LR-LR14-3-3η0.83165.6791.540.780.560.890.727.760.38Anti-CCP0.85280.6086.920.840.660.860.816.160.22Anti-RA330.61537.3193.080.650.290.850.595.390.67Anti-Sa0.70641.7997.690.690.380.950.6218.090.60RF0.73983.5864.180.740.460.710.792.330.26

Note：Se.Sensitivity；Sp.Specificity.

表3指標兩兩聯合試驗臨床評價

Tab.3Clinicalevaluationoftwoparameterscombination

Combination(s)InseriesSensitivity(%)Specificity(%)YDIInparallelSensitivity(%)Specificity(%)YDI152.93%98.89%0.5293.34%79.57%0.73224.50%99.41%0.2478.48%85.21%0.64327.44%99.80%0.2780.02%89.43%0.69454.89%96.97%0.5294.36%58.75%0.53530.07%99.09%0.2987.84%80.91%0.69633.68%99.70%0.3388.71%84.91%0.74767.37%95.31%0.6396.81%55.79%0.53815.59%99.84%0.1563.51%90.93%0.54931.18%97.52%0.2989.71%59.74%0.491034.93%99.17%0.3490.44%62.70%0.53

Note：1.14-3-3η & anti-CCP;2.14-3-3η & anti-RA33;3.14-3-3η & anti-Sa;4.14-3-3η & RF;5.Anti-CCP & anti-RA33;6.Anti-CCP & anti-Sa;7.Anti-CCP & RF;8.Anti-RA33 & anti-Sa;9.Anti-RA33 & RF;10.Anti-Sa & RF.

圖1 14-3-3η和自身抗體診斷RA的ROC曲線Fig.1 ROC curves of 14-3-3η and auto-antibodiesNote: AUC 0.5-0.7.Poor diagnostic value;0.7-0.9.Moderate diagnostic value;>0.9.High diagnostic value.

3 討論

RA患者血清能檢測出多種自身抗體[7]。RF作為首個用于診斷RA的血清學指標，具有檢測方法簡便快速、陽性率較高等優點，但其在多種感染性疾病以及其他自身免疫病甚至健康老年人血清中也可檢出[8]，導致其對RA特異度較低，給RA診斷尤其是不典型病例的診斷造成一定困難。2000年Schellekens等[9]將合成的環瓜氨酸肽作為抗原基質，采用ELISA方法檢測RA患者血清中anti-CCP，發現anti-CCP對RA特異度高達98%，即使在早期RA中特異度仍然高達96%。此外，將anti-CCP與RF檢測聯合可以顯著提高RF對RA的陽性預測值，說明anti-CCP檢測對提高RA診斷水平很有價值。2010年ACR/EULAR將anti-CCP寫入指南[4]，作為診斷RA血清學指標。1989年Hassfeld等[10]對95名RA患者血清進行免疫印跡分析，發現36%RA血清中存在針對抗Hela細胞系可溶性核提取物的anti-RA33，而170例健康對照中僅1例該抗體陽性，并證明其與RF等其他自身抗體之間不存在交叉反應。隨后的研究也證實anti-RA33對RA的敏感度雖不及RF，但其特異度相比RF具有明顯優勢[11，12]。1994年Despres等[13]通過同樣的方法在42.7%RA患者血清中發現針對胎盤和脾臟提取物的自身抗體，并將其命名為anti-Sa。anti-Sa與anti-RA33均對RA有很高特異度[14，15]。

通過對受試者血清14-3-3η、anti-CCP、anti-RA33、anti-Sa和RF檢測，所測指標在RA組均顯著高于Non-RA和健康對照組，其中RF陽性率最高為83.58%，其特異度最低僅64.18%，顯著低于其他指標。Anti-RA33和anti-Sa敏感度均低于50%，但兩者特異度顯著高于anti-CCP和RF，與國內外報道基本一致。本研究中anti-CCP靈敏度和特異度分別為80.60%和86.92%，與其他研究結果略有不同[16，17]，可能與所用試劑和受試對象人種差異有關，但本研究所測指標中anti-CCP對RA診斷準確度、約登指數以及AUC均大于其他指標，且經anti-CCP與RF串聯所得約登指數高于其他指標串聯，說明anti-CCP在RA診斷中確有較高價值。

14-3-3是一個高度保守的在真核生物中廣泛表達的酸性蛋白家族，分子量大約為28～33 kD，在哺乳動物中由7種亞型(α/β、γ、σ、ε、ζ、η和θ/τ)組成，14-3-3η蛋白是細胞內重要的信號轉導蛋白，能與超過200種配體蛋白相結合，參與調節多種生命過程以及疾病的發生發展[18，19]。Kilani等[2]在2007年通過免疫印跡實驗首次發現14-3-3η和14-3-3γ兩種亞型在RA患者血清和關節滑液中表達水平升高，前者水平是后者的5倍，而且關節滑液蛋白水平高于血清，提示關節滑膜可能為14-3-3η蛋白的來源。同時14-3-3η水平的升高和基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMPs)-1表達升高密切相關，以重組14-3-3η刺激的成纖維樣細胞，MMP-1蛋白表達水平升高；另外，14-3-3η刺激MMP-1和MMP-9蛋白表達在單核細胞中也得到了證實。所有研究結果都說明14-3-3η能夠增加MMPs表達，而MMPs已被大量研究結果證實參與RA患者關節軟骨以及骨破壞，并能作為RA發生關節骨侵蝕的預測指標[20-22]，提示14-3-3η可能與關節病變骨質破壞存在關聯。Maksymowych等[23]研究認為14-3-3η蛋白能夠提高RA診斷的靈敏度，彌補當前用于RA診斷的血清學指標的不足，在提高RA診斷水平上具有重大意義。本研究結果顯示，血清14-3-3η蛋白水平在RA組為(3.63±2.16) ng/ml顯著高于Non-RA和健康對照組，并且RA患者血清中蛋白水平較OA、AS患者升高更為明顯。這說明侵蝕性關節病變，尤其是RA，患者血清中14-3-3η確實升高，但其是否為導致關節骨質破壞的因素尚待進一步研究證實。ROC曲線結果也可以看出14-3-3η血清水平對RA診斷的AUC為0.831，僅略低于anti-CCP，兩者對RA的診斷有中等價值。此外，指標聯合分析結果顯示，anti-CCP與14-3-3η兩指標經串聯和并聯所得YDI均較大，提示14-3-3η有望成為輔助診斷RA的新指標。上述結果與Maksymowych等[23]結果基本一致，所測蛋白濃度上的差異可能由所用試劑不同造成。

綜上所述，14-3-3η蛋白、anti-CCP、anti-RA33、anti-Sa和RF在RA中均顯著升高，對RA的診斷都有一定意義，anti-CCP與RF聯合使用對提高RA診斷水平具有較大價值；所測指標中僅14-3-3η和anti-CCP對RA診斷達到中等以上價值，14-3-3η診斷RA的敏感度和特異度相較于自身抗體有一定的優勢，可以作為輔助診斷RA的指標。

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[收稿2017-06-29]

(編輯 許四平 劉格格)

Clinicalsignificanceofserum14-3-3ηproteinandauto-antibodiesdetectioninrheumatoidarthritis

ZENGTing-Ting,TANLi-Ming,CHENJuan-Juan,JIANGYong-Qing,WUYang,TIANYong-Jian,YUJian-Lin,LIHua,DUANXin-Wang.

JiangxiProvinceKeyLaboratoryofLaboratoryMedicine,DepartmentofClinicalLaboratory，theSecondAffiliatedHospital，NanchangUniversity，Nanchang330006，China

Objective:To explore the clinical value of detecting serum 14-3-3η and auto-antibodies in rheumatoid arthritis(RA),and compare their performance in RA diagnosis.MethodsSerum samples of 134 RA patients,90 non-RA inflammatory arthropathy patients,70 of whom with osteoarthritis(OA)and 20 with ankylosing spondylitis(AS),and 40 healthy controls from the second affiliated hospital of Nanchang University were collected.Concentrations of 14-3-3η,anti-CCP,anti-RA33,anti-Sa were detected with enzyme linked immunosorbent assay(ELISA),with RF detected by immunonephelometry.Diagnostic utilities of them for RA were evaluated and compared then.Results① Serum levels of 14-3-3η,anti-CCP,anti-RA33,anti-Sa and RF were significantly higher in patients with RA than non-RA inflammatory arthropathy patients and healthy controls,the differences between groups were statistically significant;② ROC curves were conducted according to the serum levels detected.The AUC of 14-3-3η,anti-CCP,anti-RA33,anti-Sa and RF were 0.831(95% CI:0.782-0.881),0.852(95% CI:0.802-0.901),0.615(95%CI:0.546-0.684),0.706(95% CI:0.643-0.770)and 0.739(95% CI:0.676-0.802)respectively,withPvalues<0.01.Among all index,only anti-CCP and 14-3-3η were of moderate diagnostic value,at the threshold of 24.10 U/ml and 2.59 ng/ml individually;③anti-Sa was of highest specificity and RF was of highest sensitivity among all indexes detected;the specificity of 14-3-3η was merely moderately inferior to anti-Sa and anti-RA33,but its sensitivity was superior to them both.ConclusionSerume14-3-3η,anti-CCP,anti-RA33,anti-Sa and RF levels increased remarkably in patients with RA,and contributed to RA diagnosis.Meanwhile,14-3-3η was advantageous,to some extent,in the sensitivity and specificity over auto-antibodies,and can be utilized as a reference index in diagnosing RA.

Rheumatoid arthritis;14-3-3η protein;Anti-CCP;Anti-Sa;Anti-RA33;Rheumatoid factor

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.11.019

①本文為江西省科技計劃項目(20151122070198、20171BAB205076)和南昌大學研究生創新專項資金。

R446.6

A

1000-484X(2017)11-1689-05

曾婷婷(1992年-)，女，在讀碩士，主要從事自身免疫病抗體檢測方面的研究，E-mail:zengtingting0821@163.com。

及指導教師：譚立明(1963年-)，男，教授,主任技師,碩士生導師,主要從事自身免疫病的病因及抗體檢測方面的研究,E-mail:ndefy84029@ncu.edu.cn。