口腔定植菌檢測技術的系統評價

夏立平 秦 陽 葉文琴

1.江蘇醫藥職業學院護理學院,江蘇鹽城 224005;2.海軍軍醫大學附屬長海醫院,上海 200433

口腔定植菌檢測技術的系統評價

夏立平1秦 陽1葉文琴2▲

1.江蘇醫藥職業學院護理學院,江蘇鹽城 224005;2.海軍軍醫大學附屬長海醫院,上海 200433

目的尋找適合機械通氣(MV)患者口腔定植菌的檢測方法,完善MV患者口腔護理評估方法.方法使用計算機檢索2005年1月～2015年4月的文獻,對納入研究的文獻的進行閱讀,并遵循quot;系統綜述和薈萃分析優先報告條目quot;聲明對研究內容進行系統評價.結果最終納入7篇文獻,其中4篇中文文獻,3篇英文文獻.口腔定植菌檢測方法有涂片鏡檢法、細菌培養法、菌落形成單位法,以及DNA探針和PCR技術.結論16SrDNA/16SrRNA檢測技術能夠大大提高口腔微生物的鑒定成功率,具有廣闊的應用前景.

機械通氣;口腔定植菌;檢驗技術;文獻檢索;16SrDNA/16SrRNA

機械通氣(mechanical ventilation,MV)是利用機械裝置來控制、代替或改變自主呼吸運動的一種通氣方式[1].在呼吸機的幫助下,通過機械通氣維持氣道通暢、改善通氣和氧合、防止機體缺氧和二氧化碳蓄積,幫助機體度過基礎疾病所致的呼吸功能衰竭,為治療基礎疾病創造條件[2-3].有研究顯示,口咽部定植菌的誤吸和移位是MV患者發生VAP的獨立危險因素,根據口咽部微生物的種類,有針對性地進行口腔護理干預,可以顯著降低VAP的發生率[4-6].之前本研究組對于MV患者口腔護理的指南和系統評價進行循證研究,均未發現有關口腔定植菌檢測技術的相關證據,為尋找適合MV患者口腔定植菌的檢測方法,完善MV患者口腔護理評估方法,本研究針對口腔定植菌檢測技術進行系統評價,分析現有的口腔定植菌檢測方法的準確性及應用效果,以總結出文獻報道中的不同檢測手段,并對其檢測效果進行分析,為構建MV患者口腔護理方案提供理論依據.

1 資料與方法

1.1 評價標準

遵循quot;系統綜述和薈萃分析優先報告條目quot;(Preferred Reporting Items for Systematic reviews and Meta-Analyses,PRISMA)聲明來制定該系統評價的研究內容.該聲明是對系統評價或薈萃分析報道內容的主要條目進行界定和介紹,旨在幫助改進此類文章的撰寫,提升系統評價或薈萃分析的質量[7].

1.2 納入與排除標準

本系統評價針對口腔定植菌的檢測技術展開,納入文獻特征包括:(1)使用檢測方法調查口腔定植菌的種類或數量的相關實驗性和觀察性研究;(2)研究對象為人類,限定范圍為口腔細菌,其種族、國籍不限;③同時納入中英文文獻.主要的檢測方法包括:細菌培養法、細菌酶檢測法、免疫學檢查技術、DNA探針雜交技術、聚合酶鏈反應技術(PCR技術)等.排除標準為:(1)細菌檢測對象為動物;(2)未說明檢測結果指標,如檢出率或特異度等.

1.3 檢索策略

使 用 計 算 機 檢 索 Cochrane Library、Pubmed、EMbase、CBM、萬方數據庫,所有數據庫均為近十年,即2005年1月1日～2015年4月.對納入研究文獻的參考文獻進行閱讀,保留與本系統評價相關的研究,并對其中不明確或無法獲得原文的文獻與作者進行聯系.英文檢索詞包括:(oral colonized bacteria / oral colonization)amp;(testing method/bacterial culture/bacterial enzyme test/immunology examination/DNA probe hybridization/polymerase chain reaction/16SrRNA/denaturing gradient gel electrophoresis/gene chip/16SrDNA)amp;(detection rate/sensitivity/specificity/accuracy);中文檢索詞包括:口腔定植菌、檢測方法/細菌培養法/細菌酶檢測法/免疫學檢查技術/DNA探針雜交技術/聚合酶連反應技術(其中包括傳統PCR、半定量和定量PCR)/16S rRNA基因/變性梯度凝膠電泳技術/基因芯片技術、檢出率/敏感度/特異度/精確性.以Pubmed為例,說明檢索過程,見圖1.

圖1 檢索過程

1.4 文獻篩選

由兩位接受過循證護理培訓的研究人員分別獨立進行篩選,首先閱讀文題,若符合納入標準則進一步閱讀摘要、全文,并在此基礎上交叉核對.對存在分歧的點由第三位人員協助判斷.

1.5 內容提取

設計信息提取表,對納入的文獻提取以下內容:(1)文獻基本特征,包括作者、發表時間、研究類型、研究對象特征;(2)定植菌檢測相關特征,如檢測方法、定植菌種類、檢測的結局指標(包括檢出率、特異度等).

1.6 文獻質量評價

兩位研究人員分別對篩選后保留的文獻進行質量評價,采用由參與上一步的兩名研究人員按照QUADAS-2(Quality Assessment of Diagnostic Accuracy Studies)質量評價標準對納入文獻進行評價[7].該工具主要用于診斷試驗準確性的評價,是Cochrane協作網推薦的診斷試驗系統評價方法學組采用的工具,并在2012年被納入Cochrane協作網專用軟件RevMan5.2中[8-9].QUADAS-2工具分為四個步驟:(1)研究者報道所要進行的系統評價問題;(2)根據系統評價的問題適當刪增,使其能夠適用于該問題;(3)評價已發表的原始研究的流程圖或為未報道的原始研究構建流程圖;(4)判斷研究的偏倚和適用性.在對偏倚風險和臨床適用性進行評價時,包含以下4個部分內容:患者的選擇、待評價的試驗、參考的標準、病例流程及進展,每個部分包含若干個評價問題,具體見結果中相關報道[10].

1.7 資料分析

采用Cochrane協作網中的RevMan 5.3軟件進行數據處理,選擇其中的診斷試驗準確性回顧的模式,完成質量評價部分工作.由于Revman中無法對不同診斷試驗的準確度指標進行合并分析[11],因此僅對各檢測方法的結果進行描述性分析.

2 結果

2.1 文獻檢索結果

經過初檢,得到相關文獻177篇,對以上文獻標題進行閱讀,剔除97篇文獻,對保留的80篇文獻進行摘要和全文篩選,最終納入7篇文獻,其中中文文獻4篇,英文文獻3篇.文獻篩選的過程見圖2.

2.2 文獻基本特征及質量評價

圖2 文獻篩選流程及結果

圖3 納入文獻質量評價(總體)

圖4 納入文獻質量評價(納入的每項研究)

納入研究中的基本特征主要包括:作者及年限、研究類型、研究對象、研究方法、樣本量、檢出的微生物種類以及結局指標,其中由于各文獻中報道的結果統計指標各不相同,故未統一分類列出,結局指標以檢出率為主.表格中總結了對口腔定植菌的10種檢測技術,共計474例研究對象,具體見表1.

納入文獻的方法學質量評價總體結果見圖3和圖4,其中包含了兩部分評價結果,圖3是對7篇納入文獻的總體質量評估結果,主要從偏倚和適用性進行評價;圖4是分別對7篇文獻的每一個評估條目進行具體評分的結果.

表1 納入文獻一般特征

3 討論

3.1 文獻檢索

在確定關鍵檢索詞的過程中,研究者首先嘗試使用quot;口腔定植菌quot;及quot;檢測方法quot;兩個相關檢索詞,但在最初的粗略查找文獻過程中發現,這一檢索方法導致檢索范圍過大,納入了一些并非對檢測方法進行研究的文獻,如對某種細菌的特性進行研究.而加入quot;氣管插管quot;這一關鍵檢索詞進行限定時,又導致檢出結果過少.因此,為增強對檢測方法研究的檢出率,故將結局指標(如quot;檢出率quot;quot;特異性quot;quot;靈敏性quot;quot;準確性quot;)等加入檢索詞.在此基礎上進行檢索的結果針對性較好,經過嚴格的篩選過程,最終保留了7篇中英文文獻.

3.1.1 文獻質量 在文獻質量評價的過程中,由于Kishi的研究[18]中采用了新的口腔中硫化物濃度測定方法來判斷口腔細菌種類,但其結果分析過程中主要針對硫化物濃度對吸煙人群的相關性進行分析,而未報道硫化物測定結果與口腔細菌種類的關系,因此對該研究的質量評價結果,兩位評價員存在分歧,經第三位具有一定循證護理研究經驗的人員進行協助評判,最終給予適用性欠佳的評價結果.對于另外一篇Aas的研究文獻[16],其使用了16SrRNA測序法來進行細菌檢測,文章中僅提到了對照方法為不依賴培養分子分析技術,但其對照組報道的結果在以往發表的文章中進行了說明.由于在檢索時將時間范圍限定在2005年1月1日～2015年4月,因此沒有包含對照組文獻,故對不依賴培養分子分析技術的報道追溯參考文獻,重新閱讀其研究方法與結果,在進行質量評價時將其作為參照檢測方法,從而得出評價結果.

納入的研究均詳細說明了研究對象的基本特征、口腔樣本采集方法、細菌培養方法等,采用DNA探針或PCR引物技術的還詳述了模板DNA制備、PCR引物選擇與擴增方法等,文章質量尚可.各研究中的研究對象均不同,因此納入研究中不同的檢測方法對特定人群的適應性差異較大.

3.1.2 納入文獻的基本特征 由于本系統評價針對的是檢測技術,因此并未規定檢測細菌的種類,因此文獻在菌種的報道上較為豐富,除了口腔中常見的伴放線桿菌、福塞氏桿菌、具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌,還包括用于診斷其他疾病的細菌,如結核桿菌、幽門螺桿菌等.由于口腔中的各種微生物種類繁多,因此受不同疾病影響導致口腔中的主要菌群差異明顯.Aas的研究[16]結果顯示,使用16SrRNA技術可以測出141種口腔細菌,實際上人類口腔中細菌種類還要豐富.王忠朝等人的研究[14]直接采用了三種菌種的標準株來進行實驗,而并未在特定人群中進行菌株采集,但由于以上三種菌種均為口腔常見細菌,對本系統評價的結果沒有影響,故該文獻同樣予以保留.現有的關于口腔定植菌或微生物檢測方法中,大多數是針對口腔疾病進行的研究,如牙周炎、口腔正畸治療等;同時納入的7篇文獻中研究對象同時包括正常人群與異常人群,但其中異常人群并未包含需經氣管插管或機械通氣的危重患者,因此該類患者常見的定植菌種類亦有待進一步研究.

3.2 口腔定植菌檢測方法

以上7篇文獻中基本包括了當前主要應用的幾種口腔定植菌檢測方法,如傳統的涂片鏡檢法、細菌培養法、菌落形成單位法,以及應用越來越廣泛的DNA探針和PCR技術.

張曉娟研究[12]發現,涂片法對結核桿菌的陽性檢出率僅為DNA探針雜交法的一半,其差異具有統計學意義;同時涂片法的檢測周期較長,常需要2～3個月完成.相比之下,使用DNA探針的方法不僅提高了檢出率,還大大縮短了檢測時間,能夠滿足臨床需要.DNA探針能夠與樣本中經過處理的微生物DNA單鏈雜交配對[19],其特異性能夠大大增加檢測的敏感程度,使檢出菌種遠高于常規的涂片法.

黃香娥等[13]使用了多重PCR方法與細菌培養法,對口腔中四種常見細菌進行檢測.傳統的細菌培養法雖然是標準檢測方法,但由于不同細菌所需的培養條件迥異,因此盡管該研究中使用的擴增細菌DNA方法的檢出效果與標準方法結果類似[20],作者仍推薦將前者應用于臨床檢測口腔細菌.該研究中使用的多重PCR能夠通過設計多個引物,擴增多種細菌,大大提高了PCR檢出的效率.

王忠朝等[14]在對三種常見的口腔細菌進行檢測時使用了噻唑藍(Magnetic Tape Terminal ,MTT)法,同時選擇菌落形成單位法作為參照標準.MTT法除了用于檢測細胞增殖和細胞活性,還可以對體外培養的細菌測量其毒性.其原理是通過活細胞線粒體的琥珀酸脫氫酶還原MTT,使其形成結晶;使用酶標儀測定其光吸收值,吸光度越大,形成的結晶越多,意味著細胞活性越強.該方法在最佳波長時誤差最小,測定的結果最為準確[21].但由于其對細菌濃度有要求,因此在符合要求的濃度范圍內檢測效果較好,而達不到要求濃度時該方法也存在一定的缺陷.

張澤等[15-18]均在其使用了16SrRNA片段擴增方法,該方法實際上也是PCR技術中的一種,由于這一段基因序列高度保守,因此其一般用作細菌分類的金標準.據估計,人類口腔中存在的微生物有接近700種[22],在Aas的研究[16]中,使用16SrRNA檢出了141種口腔微生物,具有極高的靈敏度.另外,該方法還避免了傳統的細菌培養與分離過程中耗時、多種微生物混雜難以分離的缺點,大大方便了臨床應用.實際上,在文獻檢索過程中也有一些報道使用了本課題中采用的16SrDNA作為引物片段進行細菌檢測,但由于其未符合本研究的納入標準,故以上進行質量評價的文章中并未有對該方法的介紹和研究.這兩種方法均具有較強的檢出率,并且相比之下應用16SrDNA片段序列分析能夠大大提高少見菌種的鑒定成功率,比16SrRNA有著更為廣闊的應用前景.

除了以上文獻中采用的檢測方法,其他的常用的方法還包括:酶學方法(針對一組致病菌產生的酶,無法到具體的某個細菌)、免疫學技術(如熒光標記或酶聯免疫反應,該方法很大程度上依賴于試劑盒的質量)、細菌基因芯片技術等[23].

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R-33 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616(2017)22-23-05

江蘇省鹽城市醫學科技發展計劃項目(YK2016051);江蘇省高校quot;青藍工程quot;(蘇教師[2016]15號);江蘇省青年醫學人才(QNRC2016805).

▲通訊作者

2017-09-21)