菊芋渣選擇性吸附天然菊粉酶催化制備短鏈低聚果糖

李 鑫， 周 瑾， 賴晨歡， 勇 強

(1. 南京林業大學 江蘇省林業資源高效加工利用協同創新中心， 江蘇 南京 210037;2. 南京林業大學 化學工程學院， 江蘇 南京 210037)

·研究報告——生物質化學品·

菊芋渣選擇性吸附天然菊粉酶催化制備短鏈低聚果糖

李 鑫1,2， 周 瑾2， 賴晨歡1,2， 勇 強1,2

(1. 南京林業大學 江蘇省林業資源高效加工利用協同創新中心， 江蘇 南京 210037;2. 南京林業大學 化學工程學院， 江蘇 南京 210037)

以菊粉加工廢棄物(菊芋渣)選擇性吸附黑曲霉產的天然菊粉酶提高菊粉酶活力(I)與轉化酶活力(S)的比值(即I/S比值)，并將此純化后的菊粉酶應用于后續的短鏈低聚果糖(FOSs)的生產，考察了純化后菊粉酶對FOSs產率的影響。結果顯示：選擇的較佳吸附條件為：菊芋渣質量濃度為100 g/L，吸附pH值為5.0，吸附溫度為4 ℃。經菊芋渣的選擇性吸附，天然菊粉酶酶系中轉化酶活力降低80.84%，菊粉酶活力保留67.92%，I/S比值由原來的1.13上升至4.02。經菊芋渣選擇性吸附后的天然菊粉酶用于制備短鏈低聚果糖，可顯著提高短鏈低聚果糖的濃度，酶解條件為：菊粉質量濃度為40 g/L，酶解pH值為5.0，溫度為50 ℃，酶用量為20 U/g(以菊粉質量計)，短鏈低聚果糖質量濃度達到16.06g/L，是原酶液制備短鏈低聚果糖的2.55倍；短鏈低聚果糖得率為40.16%。

菊粉酶；選擇性吸附；菊芋渣；菊粉；短鏈低聚果糖

低聚果糖(FOSs)，是通過β-2,1-糖苷鍵在果糖殘基的C1位上連接1～3個果糖分子所形成的混合物，聚合度(Dp)在3～9范圍內[1]。短鏈FOSs的聚合度為3～5，主要在近段結腸位置被利用[1]，能夠促進腸道內有益菌如雙歧桿菌的增殖，還具有防止齲齒和降血糖、膽固醇等生理作用[2]。因此，FOSs作為一種可溶性膳食纖維，是重要的功能性食品原料之一[3]。FOSs的生產主要有兩種方法：一是以蔗糖為原料，在高濃度底物存在的條件下，蔗糖在β-果糖轉移酶的作用下發生轉移反應，所得產物為GFn型FOSs(G為葡萄糖，F為果糖，n為果糖分子數)，但在制備過程中會積累大量的副產物葡萄糖，進而抑制果糖基轉移酶的產生[4]，并且 FOSs純度不高[5]，工藝繁雜，成本較高；二是以菊粉作為底物，內切菊粉酶隨機切割長鏈菊粉分子，所得產物為Fm型(F為果糖分子，m為果糖的分子數)與GFn型的混合物，此法的產品純度較高，工藝簡單，成本較低，是目前主流生產FOSs的方法[6]。國外以菊粉加工FOSs的公司主要有比利時的Orafti公司和Cosucra公司，以及美國的Jarrow Formulas公司[7]。其中Orafti公司所生產的低聚果糖純度達到93%～97%[8]，現有的研究報道中基于菊粉的酶法制備FOSs的得率達到60%～86%[1]。以菊粉為原料生產FOSs，關鍵在于內切菊粉酶的制備。然而，天然菊粉酶是由內切菊粉酶和外切菊粉酶組成的復合酶系，菊粉在內切菊粉酶的作用下主要產物為低聚果糖，而低聚果糖則在外切菊粉酶的作用下最終會水解成為果糖和葡萄糖[9]。因此，內、外切菊粉酶的拆分對生產FOSs非常重要。天然菊粉酶酶系中內切菊粉酶和外切菊粉酶均表現一定的菊粉酶活力和轉化酶活力，多數外切菊粉酶比內切菊粉酶表現出更高的轉化酶活力[10]。因此，天然菊粉酶活力的高低常以菊粉酶活力(I)與轉化酶活力(S)的比值來表示，即I/S比值。拆分內、外切菊粉酶的傳統方法主要有超濾、鹽析、柱層析、電泳等[11]，這些方法都存在效率低、成本高、不易于工業化生產等缺點。本研究以黑曲霉產的天然菊粉酶為研究對象，采用菊粉加工廢棄物(菊芋渣)為吸附劑來選擇性吸附天然菊粉酶，降低天然菊粉酶酶系中的轉化酶活力，保留較多的菊粉酶活力，即提高I/S比值，以期通過低成本的選擇性吸附方法改變天然菊粉酶的酶系結構，提高低聚果糖的產率，為低聚果糖的工業化生產提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

黑曲霉NLX-H164，南京林業大學生物化工研究所提供。純菊粉，購自Beneo Orafit公司，菊芋渣由青海威德生物技術有限公司提供。其他化學品均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1天然菊粉酶的制備 在250 mL錐形瓶中裝入50 mL 產酶培養基，產酶培養基由20 g/L菊粉和10 g/L酵母粉構成。接入5 mL黑曲霉NLX-H164，在170 r/min、30 ℃條件下培養。發酵72 h后取出發酵液，5 000 r/min下離心10 min，上清液即為天然菊粉酶酶液。

1.2.2菊芋渣選擇性吸附天然菊粉酶 菊芋渣于60 ℃烘干至質量恒定，再經粉碎至粒徑≤0.85 mm，所得固形物于4℃冷藏待用。取一定質量的菊芋渣于錐形瓶中，加入0.1 mL的天然菊粉酶酶液，用不同pH值的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液定容至20 mL。攪拌至均勻后，在80 r/min條件下恒溫吸附。吸附30 min后取樣，樣品于5 000 r/min離心10 min，收集上清液，測定上清液中菊粉酶活力(I)和轉化酶活力(S)，計算I/S比值。菊芋渣對菊粉酶活力或轉化酶活力的選擇性吸附效果，以酶活力回收率表示，酶活力回收率=上清液中的酶活力(U)/起始加入的酶活力(U)×100 %。其中，酶活力單位(U)的定義為每分鐘生成1 μmol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位。

1.2.3菊粉酶活力(I)的測定 用0.1 mol/L、pH值4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液配制5 %菊粉溶液450 μL，加入50 μL的天然菊粉酶酶液，混勻后，60 ℃水浴中反應10 min，反應結束后，即刻取出并用沸水浴滅活5 min，從反應液中取出200 μL，加入1.5 mL DNS試劑和1.8 mL水，混勻后，沸水浴反應5 min，冷水冷卻后，用蒸餾水在試管中定容至25 mL，測定520 nm處的吸光度值。根據果糖標準曲線計算得出樣品溶液中的還原糖質量(mg)，進而計算酶活力。

1.2.4轉化酶活力(S)的測定 用0.1 mol/L、pH值4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液配制5 %蔗糖溶液450 μL，取50 μL酶液加入混勻后，60 ℃水浴中反應10 min，反應結束后，即刻取出并用沸水浴滅活5 min，從反應液中取出200 μL，加入1.5 mL DNS試劑和1.8 mL水，混勻后，沸水浴反應5 min，冷水冷卻后，用蒸餾水在試管中定容至25 mL，測定520 nm處的吸光值。根據果糖標準曲線計算得出樣品溶液中的還原糖質量(mg)，進而計算酶活力。

1.2.5酶法制備短鏈低聚果糖 稱取2.0 g菊粉于100 mL酶解瓶中，加入適量吸附處理的天然菊粉酶酶液，補加乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH值5.0)至50 mL，溫度為50 ℃，酶用量為20 U/g(以菊粉質量計)在150 r/min條件下進行酶水解。間隔2 h取樣，樣品于10 000 r/min離心10 min，收集上清液，測定上清液中短鏈FOSs的質量濃度。酶解效果以短鏈FOSs得率表示，短鏈FOSs得率=總短鏈FOSs質量/底物菊粉質量×100%。

1.2.6分析方法 短鏈FOSs質量濃度分析參考文獻[12]，并有一定的改進。短鏈FOSs的聚合度一般為3～5[1]。采用戴安離子色譜系統測定上清液中的短鏈FOSs質量濃度，離子色譜條件為：色譜柱為CarboPac PA10，柱溫30 ℃，流速0.3 mL/min。以超純水、200 mmol/L NaOH 和 500 mmol/L NaAc為流動相，洗脫梯度：0～13 min，80 %水和20 % 200 mmol/L NaOH；13～30 min，90 %～85 % 200 mmol/L NaOH 和10 %～15 % 500 mmol/L NaAc；30～55 min，80 %水和 20 % 200 mmol/L NaOH。

2 結果與討論

2.1 菊芋渣吸附條件對菊粉酶活力的影響

2.1.1菊芋渣質量濃度 菊芋渣作為吸附劑，其濃度的高低會影響天然菊粉酶酶系的選擇性吸附。隨著菊芋渣質量濃度的增加，體系中的固形物含量隨之提高，能夠增加吸附底物與酶組分的接觸，提高吸附效率。在吸附溫度4 ℃、pH值4.6條件下，研究菊芋渣質量濃度對菊芋渣選擇性吸附菊粉酶的影響，如圖1(a)所示。

圖1 菊芋渣吸附條件對菊芋渣吸附菊粉酶的影響Fig. 1 Effect of adsorption conditions on the adsorption of inulinase by Jerusalem artichoke residue

由圖1(a)可知，隨著菊芋渣質量濃度由10 g/L上升至200 g/L，菊粉酶和轉化酶的酶活力回收率變化趨勢一致，即隨著吸附劑質量濃度的增加，酶活力回收率也逐漸降低，并趨于平衡。當菊芋渣質量濃度由10 g/L上升至100 g/L時，菊粉酶和轉化酶酶活力回收率下降較快，I/S比值隨菊芋渣質量濃度的增加而增加；當菊芋渣質量濃度大于100 g/L時，菊粉酶和轉化酶的酶活力回收率趨于平穩，I/S比值也趨于平穩。在體系內酶蛋白一定的條件下，增加吸附劑用量，酶蛋白吸附量增加，當酶蛋白吸附飽和后，進一步增加吸附劑用量，酶蛋白吸附量不再增加[13]。同時，菊粉酶酶活力回收率明顯高于轉化酶的酶活力回收率，說明菊芋渣對菊粉酶和轉化酶具有選擇性吸附，菊芋渣優先吸附轉化酶。當菊芋渣質量濃度達100 g/L時，I/S比值達到最大值，為3.06。因此，選擇的最佳吸附劑質量濃度為100 g/L。

2.1.2pH值 pH值不僅影響吸附劑的表面性質，也影響吸附質所帶電荷，特別是蛋白質等吸附質所帶電荷受pH值影響較大，過高和過低的pH值均對吸附不利[12]。因此，選擇合適的吸附pH值對菊芋渣吸附菊粉酶具有重要的作用。文獻表明黑曲霉產菊粉酶的最適pH值在4.0～5.0之間[11]。因此，在吸附溫度4 ℃、菊芋渣質量濃度100 g/L條件下，研究pH值對菊芋渣吸附菊粉酶的影響，如圖1(b)所示。由圖1(b)可知，在pH值3.8～5.4范圍內，菊粉酶與轉化酶的酶活力回收率呈現不同的趨勢，菊粉酶的酶活力回收率表現為先降低后升高再降低的趨勢，而轉化酶的酶活力回收率表現為先降低后升高的趨勢，說明菊粉酶與轉化酶因蛋白質組成的不同，在不同的pH值條件下，所帶電荷存在差異，進而影響吸附效果，表現為選擇性吸附。在pH值為5.0時，菊粉酶的酶活力回收率達到最高為67.62 %，而轉化酶的酶活力回收率最低為21.69 %，I/S比值達到最大值為3.53。因此，菊芋渣吸附菊粉酶的最佳pH 值為5.0，此時菊粉酶中的轉化酶活力被最大限度的去除。

2.1.3溫度 吸附溫度對于吸附的影響和吸附過程的熱效應相關[14]。同時，溫度也對酶活力產生影響。在菊芋渣質量濃度100 g/L、pH值5.0條件下，研究溫度對菊芋渣吸附菊粉酶的影響，如圖1(c)所示。由圖1(c)可以看出，在4～50 ℃范圍內，吸附溫度的升高對菊粉酶與轉化酶的酶活力回收率影響較小。在4℃時，菊粉酶的酶活力回收率為67.91 %，轉化酶的酶活力回收率為21.33 %，I/S比值為3.61；而在30 ℃時，菊粉酶的酶活力回收率為65.32 %，轉化酶的酶活力回收率為23.19 %，I/S比值為3.18。吸附過程一般為放熱過程，溫度對吸附的影響為負效應，即低溫有利于吸附[15]。同時，溫度過高影響菊粉酶的生物活性。因此，選擇吸附溫度為4 ℃。

2.2 菊芋渣選擇性吸附前后菊粉酶酶活力的變化

經優化后確定菊芋渣選擇性吸附天然菊粉酶的較佳吸附條件為：菊芋渣質量濃度100 g/L，吸附pH值5.0，吸附溫度4 ℃。在此條件下，對天然菊粉酶吸附前后的性質進行比較，結果如表1所示。

表 1 菊芋渣選擇性吸附前后天然菊粉酶性質的對比Table 1 Changes of native inulinase by the selective adsorption of Jerusalem artichoke residue

由表1可知，經菊芋渣吸附后，菊粉酶活力由11.78 U/mL下降至8.00 U/mL，而轉化酶活力從10.39 U/mL降至1.99 U/mL；相應，I/S比值由1.13上升至4.02，增加了255.75 %。菊芋渣吸附天然菊粉酶表現為選擇性吸附，優先吸附轉化酶活力，吸附80.84 %的轉化酶活力，對應的菊粉酶活力僅被吸附32.08 %，使得吸附后的天然菊粉酶酶系中的轉化酶活力顯著降低，保留了較多的菊粉酶活力。

2.3 酶法制備短鏈低聚果糖

利用菊芋渣選擇性吸附處理前后的天然菊粉酶來水解菊粉制備短鏈低聚果糖(FOSs)，按1.2.5節操作，如圖2所示。由圖2可知，40 g/L菊粉溶液本身含有少量的短鏈FOSs，質量濃度為5.77 g/L。吸附后的天然菊粉酶水解菊粉過程中，隨著時間的延長，生成的短鏈FOSs不斷增加，酶解10 h后，短鏈FOSs質量濃度和得率達到最大值，分別為16.06 g/L和40.16 %；進一步增加酶解時間，短鏈FOSs質量濃度和得率開始下降。原酶液的酶水解過程中，酶解10 h，短鏈FOSs質量濃度從5.77 g/L增加至6.31 g/L，僅增加9.36 %，選擇性吸附的天然菊粉酶制備的短鏈FOSs質量濃度是原酶液的2.55倍。天然菊粉酶經菊芋渣選擇性吸附后，多數轉化酶活力被吸附，說明從天然菊粉酶酶系中去除較多的外切菊粉酶，而內切菊粉酶保留較多。利用菊芋渣吸附的天然菊粉酶制備短鏈FOSs的結果進一步證明吸附后的天然菊粉酶酶系中存在較多的內切菊粉酶，能夠隨機切割長鏈菊粉分子，生成短鏈FOSs，增加了短鏈FOSs質量濃度，提高了短鏈FOSs的得率。因此，采用菊粉加工產生的廢棄物(菊芋渣)，經一步法選擇性吸附天然菊粉酶，用以制備短鏈FOSs，具有步驟少、成本低、食品安全性高等優點。同時，短鏈FOSs得率仍然存在較大的提升空間，可通過對菊芋渣修飾提高對天然菊粉酶的選擇性吸附，或結合蛋白質沉淀方法，進一步處理吸附后的天然菊粉酶，提高I/S比值，從而提高短鏈FOSs質量濃度和得率。

圖 2 菊芋渣吸附前(a)和吸附后(b)的天然菊粉酶制備短鏈低聚果糖(FOSs)Fig. 2 Preparation of short-chain fructooligosaccharides(FOSs) by the native inulinase before(a) and after(b) adsorbed by Jerusalem artichoke residue

3 結 論

3.1利用菊粉加工廢棄物(菊芋渣)選擇性吸附黑曲霉產天然菊粉酶，制備低轉化酶活力的菊粉酶，較佳吸附條件為：菊芋渣質量濃度為100 g/L，吸附pH值為5.0，吸附溫度為4 ℃。經菊芋渣吸附后，天然菊粉酶酶系中的轉化酶活力顯著降低，菊粉酶活力保留較多。利用吸附的天然菊粉酶制備短鏈低聚果糖，酶解條件為菊粉質量濃度為40 g/L,酶解pH值為5.0，溫度為50 ℃，酶用量為20 U/g(以菊粉質量計)，短鏈低聚果糖質量濃度較之原酶液高2.55倍，菊芋渣選擇性吸附天然菊粉酶，去除較多的外切菊粉酶活力，保留較多的內切菊粉酶活力，大幅度提高短鏈低聚果糖質量濃度和得率。

3.2利用菊粉加工廢棄物建立的選擇性吸附天然菊粉酶的方法，改變天然菊粉酶的酶系結構，有效提高短鏈低聚果糖的質量濃度，為高效、低成本生產短鏈低聚果糖提供一種綠色、安全的新思路。

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Selective Adsorption of Native Inulinase by Jerusalem Artichoke Residue andPreparation of Short-chain Fructooligosaccharides

LI Xin1, 2, ZHOU Jin2, LAI Chenhuan1, 2, YONG Qiang1, 2

(1. Jiangsu Co-Innovation Center of Efficient Processing and Utilization of Forest Resources,Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China; 2. College of Chemical Engineering,Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)

A selective adsorption method was developed to adsorb native inulinase fromAspergillusnigerto reduce sucrase activity by Jerusalem artichoke residue. The inulinase activity(I)/sucrase activity(S) ratio was generally used to characterize the inulinases. Afterward, the native inulinase, selectively adsorbed by Jerusalem artichoke residue, was applied for production of short-chain fructooligosaccharides(FOSs). The results showed that the optimal conditions of the selective adsorption were as follows: Jerusalem artichoke residue loading 100 g/L, pH value 5.0, adsorption temperature 4 ℃. 67.92% Inulinase activity was retained and 80.84% sucrase activity was decreased in the native inulinase system after the selective adsorption. The I/S ratio increased from 1.13 to 4.02. The selective adsorption of native inulinase by Jerusalem artichoke residue improved the production of short-chain FOSs. The conditions of enzymatic hydrolysis were inulin 40 g/L, pH value 5.0, 50 ℃, inulinase loading 20 U/g(based on the mass of inulin) . The mass concentration of short-chain FOSs was 16.06 g/L, which was 2.55 times than that of the original inulinase. The yield of short-chain FOSs was 40.16%.

inulinase;selective adsorption;Jerusalem artichoke residue;inulin;short-chain fructooligosaccharides

TQ35；Q815

A

1673-5854(2017)06- 0033- 05

10.3969/j.issn.1673-5854.2017.06.006

2017- 10-16

江蘇省重點研發計劃項目(BF2015007)；青海省重點研發與轉化計劃項目(2016-HZ-819)；江蘇省高校優勢學科建設工程資助項目(無編號)

李 鑫 (1975— )，男，遼寧大連人，副教授，博士，主要從事生物質資源生物利用研究工作；E-mailxli@njfu.edu.cn。