常壓甘油有機溶劑預處理甘蔗渣的濃醪酶解

洪嘉鵬，岳春，趙曉琴，Marie Rose Mukasekuru ，李祥，孫付保*,孫海彥

1(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(南陽理工學院 生物與化學工程學院，河南 南陽，473004)3(中國熱帶農業科學院 熱帶生物技術研究所，海南 ?？?，571101)

常壓甘油有機溶劑預處理甘蔗渣的濃醪酶解

洪嘉鵬1，岳春2，趙曉琴1，Marie Rose Mukasekuru1，李祥1，孫付保1*,孫海彥3

1(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(南陽理工學院 生物與化學工程學院，河南 南陽，473004)3(中國熱帶農業科學院 熱帶生物技術研究所，海南 ?？?，571101)

為了實現木質纖維素濃醪酶解在低酶載量時的“三高”(高濃度、高轉化率和高轉化效率)，通過利用常壓甘油有機溶劑預處理甘蔗渣為底物，篩選合適的基質質量濃度(150 g/L)、纖維素酶添加量(6 FPU/g基質)和添加劑(吐溫80, 30 mg/g基質)。接著采用分批補料策略使基質質量濃度達到350 g/L，考察了不同加酶方式對分批補料濃醪酶解的影響。酶解72 h酶解液葡萄糖質量濃度達到132 g/L，葡萄糖轉化率達到了理論值的60%。結果表明，常壓甘油有機溶劑預處理基質具有較好的可酶解性，添加吐溫80可以顯著提高酶解效率。常壓甘油有機溶劑預處理甘蔗渣的分批補料濃醪酶解推動了纖維素乙醇濃醪發酵工業化進程。

常壓甘油有機溶劑預處理;甘蔗渣;濃醪酶解;分批補料;表面活性劑

目前，纖維素乙醇的生產技術路線已經打通，但是過高的生產成本嚴重阻礙了商業化進程。WINGREN等人研究發現，當基質質量濃度從50 g/L提高到80 g/L時，相應的操作成本會降低19%。而當基質質量濃度從200 g/L上升到300 g/L時，燃料乙醇的成本能降低0.10美元/加侖[1-2]。高基質濃度(濃醪)酶解工藝相比于低基質濃度酶解工藝，其在經濟效益方面的優勢非常巨大，主要體現在：(1)由于反應體系體積的減小而導致的設備成本降低；(2)由于加熱和冷卻所需能耗的降低而減少了操作成本；(3)更高的產物濃度意味著下游工藝的成本會被降低；(4)用水量的減少導致了后期廢棄物處理的成本降低[3]?？梢?，利用纖維素生物質原料生產燃料乙醇的一個挑戰在于如何實現高基質濃度的纖維素水解產糖的過程。

另外，纖維素酶成本對纖維素燃料乙醇生產經濟性的影響很大，低纖維素酶添加量能夠幫助降低整個行業的生產成本(0.5～1.5美元/加侖)[2, 4-5]。文獻報道，通常堿催化預處理后基質酶解的加酶量為20 FPU/g纖維素，酸催化預處理基質的加酶量為100 FPU/g纖維素，堿催化后的基質所需的加酶量明顯低于酸催化后的基質[6]?？傊?，如何實現低酶載量時基質高效水解是另外一個值得關注的方向。

截至目前，已有不少關于木質纖維素基質濃醪水解的研究報道。BARYAN等人在180g/L的基質質量濃度，加酶量20 mg/g(分別為10 mg CTec3和HTec3)葡聚糖的條件下酶解72 h，葡萄糖產率為68%，木糖產率為65%[7]。DAVID等人在加酶量為10.7 FPU/g纖維素的條件下通過分批補料的方式使基質質量濃度達到333 g/L，240 h的水解液中的葡萄糖質量濃度達到了將近140 g/L[3]。本實驗室前期開展了汽爆-堿性過氧化氫預處理玉米秸濃醪酶解的研究，劉健權等人[8]在加酶量為30 FPU/g基質的條件下，以156 g/L為起始基質質量濃度，在酶解12 h時補加相當于200 g/L初始基質濃度的干物料以及相應量酶液后繼續酶解24 h，此時酶解液中的糖質量濃度達到了142 g/L，纖維素轉化率接近60%。盡管這些研究結果在酶解條件(酶載量、酶解時間或基質質量濃度)和酶解水平(產糖量、酶解率和酶解效率)的某一個指標方面取得明顯進展，但這些研究在低酶載量時木質纖維素基質濃醪水解“三高”水平方面均尚未取得突破。

基于此，本文以常壓甘油有機溶劑預處理甘蔗渣為原料，嘗試開展低酶載量下基質濃醪水解的實驗。首先對濃醪酶解時初始基質濃度和酶載量進行選擇，接著選擇適用于纖維素酶解的添加劑，最后在選擇分批補料方式的基礎上對基質的分批補料濃醪酶解進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

風干甘蔗渣，取自于廣西壯族自治區，用篩子篩選尺寸為5 mm×1 mm左右的甘蔗渣在105℃下烘干，塑封袋保存備用，成分如下：纖維素含量為41.41%，半纖維素含量為23.78%，木質素含量為20.78%。工業甘油(質量分數95%) 購自江蘇揚州飛揚化工有限公司；纖維素酶CTecⅡ來自諾維信公司饋贈，酶活力為141 FPU/g。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀，日本HITACHI公司；SBA-40E生物傳感分析儀，山東省科學院生物研究所；HYG-A全溫搖瓶柜，江蘇太倉實驗設備廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 甘蔗渣的常壓甘油堿催化有機溶劑預處理

準確稱取10 g甘蔗渣，放入500 mL三孔燒瓶內，添加140 g工業甘油和0.3 g NaOH后機械攪拌混勻，NaOH添加量為2 g/L，對應pH大約為8.2(精密pH試紙測定),并于加熱套內加熱升溫，機械攪拌轉速為200 r/min，升溫至240 ℃后保溫蒸煮10 min，蒸煮結束后冷卻約15 min降至150 ℃以下，然后緩慢加入150 g沸水，快速攪拌使纖維充分解離，趁熱用G1砂芯漏斗過濾，用400 g常溫自來水分2次洗滌過濾后，即獲得常壓甘油堿催化有機溶劑預處理甘蔗渣纖維。主要組成為：57.69%纖維素、28.65%半纖維素、10.74%木質素。

1.3.2 酶解

酶解在100 mL搖瓶中進行，按不同基質濃度稱取相應質量的常壓甘油堿催化有機溶劑預處理甘蔗渣，按不同的加酶量添加所需的纖維素酶，最后加入適量的pH 4.8檸檬酸緩沖液，使反應體系中液體的體積為25 mL。將搖瓶放置于50 ℃，180 r/min的全溫搖瓶柜中酶解，分別在12、24、36、48、72、96 h取樣測定。

1.3.3 分析測定

甘蔗渣原料和常壓甘油堿催化有機溶劑預處理物料的3大組分含量均采用美國能源實驗室(National Renewable Energy Laboratory)NREL法測定[9]；濾紙酶活力(FPA)按照國際理論和應用化學協會(International Union of Pure and Applied Chemistry,IUPAC)推薦的國際標準法測定[10]；組分含量測定中葡萄糖、木糖和阿拉伯糖濃度采用高效液相(HPLC)法檢測，色譜柱采用BioRadAminex HPX-87H (300 mm×7.8 mm)，流動相為5 mmol/L H2SO4，流速為0.6 mL/min，柱溫60 ℃，示差檢測器[11]。酶解過程中還原糖的測定方法采用3, 5-二硝基水楊酸法[12]，葡萄糖含量測定采用SBA-40E生物傳感分析儀法。所有實驗至少重復1次，數據為2次及以上的平均值。

2 結果與討論

2.1 基質酶解加酶量的選擇

前期實驗結果顯示，常壓甘油有機溶劑預處理甘蔗渣在20 g/L的基質質量濃度，加酶量為5 FPU/g基質時，48 h酶解率達到了90%以上，表明了常壓甘油有機溶劑預處理后基質具有較好的可酶解性[13-14]。為了探究該纖維素基質在高基質濃度條件下的可酶解性，本論文首先在100 g/L基質質量濃度下考察了5種不同加酶量(3、6、10、13、15 FPU/g基質)對酶解過程中的還原糖酶解率的影響，具體實驗結果如圖1所示。

圖1 濃醪酶解(100 g/L基質質量濃度)加酶量的選擇Fig.1 Selection of the enzyme loading to substrates at 100 g/L solid content

從圖1可以看出，在酶解前24 h，還原糖的酶解率與加酶量呈明顯的正相關關系，酶解率隨著加酶量的增加而提高，酶解24 h后，除加酶量為3 FPU/g基質的酶解體系外，其余4種加酶量酶解體系的液化效果均達到了一個較高水平，此時，所有固體基質全部液化，整個酶解體系的傳質傳熱效果較好。這一結果表明，常壓堿催化甘油有機溶劑預處理甘蔗渣基質具有較好的可酶解性，分析認為預處理對原料木質素的有效脫除應該是其重要原因[15]?？紤]到堿預處理對纖維質木質素選擇性脫除效果較好[16]，筆者基于課題組已有的常壓甘油自催化有機溶劑預處理嘗試建立堿催化的常壓甘油有機溶劑預處理(詳細信息將另文報道)，發現堿催化的預處理更能有效溶解脫出甘蔗渣木質素(75%)，比自催化預處木質素脫除(65%)提高15%以上。

在加酶量為6 FPU/g基質時，堿催化預處理基質的48 h酶解率為80.65%，酶載量為15 FPU/g基質所對應的酶解率為87.34%。結果表明，基質酶載量為6 FPU/g基質已達到了較高酶解率，與其他高酶載量相比，高的酶載量已不能有效提高酶解率。鑒于纖維素酶成本和采用低酶載量的考慮，后續實驗中選擇酶載量為6 FPU/g基質。

2.2 濃醪酶解初始基質濃度的選擇

在低纖維素酶酶載量條件下實現高基質濃度的酶解轉化是實現纖維素乙醇產業化的必要途徑[3]。鑒于此，本論文在纖維素酶添加量為6 FPU/g基質的條件下考察了100、120、150、180和200 g/L基質質量濃度時酶解情況。結果如圖2所示。

圖2 不同基質質量濃度下48 h的酶解率Fig.2 Enzymatic hydrolysis of substrates at different solid content for 48 h

酶解48 h時基質100 g/L質量濃度的酶解率為80.6%，而120 g/L和150 g/L基質濃度條件下所對應的酶解率略有降低，分別為78.8%和76.8%；180 g/L和200 g/L基質質量濃度所對應的酶解率明顯降低，在72%左右?？梢?，基質酶解率與基質濃度呈負相關，隨著基質濃度增加，基質酶解率明顯下降，這一現象與其他科研工作者的報道相符[8, 17]。在酶解率相同時，基質濃度越高，意味著基質酶解所產糖濃度越高，這對提高纖維素乙醇工業的生產效率具有重大的意義。因此，本研究選擇在150 g/L基質濃度條件下進行后續實驗。

2.3 不同酶解添加劑對酶解過程的影響

有文獻報道[6, 18-19]，在酶解過程中添加一定量的表面活性劑可以有效減少酶解過程的酶用量及增加糖得率。前期研究發現，在底物濃度為0.05g/g底物條件下添加2種非離子表面活性劑吐溫80和PEG 6000后，葡萄糖產量分別提高20%；席琳喬等發現，添加3.0 g/L的PEG 6000能顯著提高棉稈木質纖維素的酶解效率[20]。鑒于此，本論文在150 g/L基質質量濃度和加酶量6 FPU/g基質的條件下考察生物素、赤霉素、聚丙烯酰胺、吐溫80和PEG 4000五種添加劑對酶解過程的影響。根據本實驗室前期工作及文獻報道[8, 11, 18-19, 21-22]，選擇生物素、赤霉素、聚丙烯酰胺、吐溫80和PEG 4000的添加量分別為75、10、0.05、50和10 mg/g基質，實驗結果如圖3所示。

圖3 不同添加劑對酶解產糖的影響Fig.3 Effect of different additives on the glucose yield from enzymatic hydrolysis of substrates

從圖3可以發現，添加吐溫80和PEG 4000對酶解產糖過程起到了明顯的促進作用。酶解24 h，添加50 mg/g基質的吐溫80所對應葡萄糖產量為63 g/L，添加10 mg/g基質的PEG 4000所對應葡萄糖產量為61 g/L，相比空白對照樣品分別提高了10%和7%。同樣，48 h時吐溫80的添加使得葡萄糖產量提高14%，PEG 4000使得葡萄糖產量提高7%。以上實驗數據說明，在酶解過程中添加吐溫80和PEG 4000能明顯促進纖維素酶酶解，但不同種類的表面活性劑促進效果是可能有差異的。鑒于此，表面活性劑吐溫80和PEG 4000被選擇用于后續基質濃醪酶解。

圖4 PEG 4000和吐溫80不同添加量對產糖的影響Fig.4 Effect of the respective dose of PEG 4000 and Tween 80 on the glucose yield from enzymatic hydrolysis of substrates

表面活性劑適宜添加量實驗結果如圖4所示。由圖4可以得出，不同濃度的2種添加劑均對酶解產糖過程起到了一定的促進作用。當PEG 4 000添加量為20 mg/g基質時其對產糖的促進作用最明顯，24 h產糖達到了57 g/L，跟空白對照相比提高了9%；當吐溫80添加量為30 mg/g基質時，24 h酶解率提高已達最高水平，產糖為59 g/L，比空白對照提高了12%。2種表面活性劑相比，添加吐溫80更能促進基質的酶解產糖。這一結果與相關文獻報道的結果相似[21, 23-24]。解釋添加非離子表面活性劑有利于提高纖維素原料酶解最經典的理論為木質素能夠無效吸附纖維素酶的理論。ERICSSON認為，木質纖維素降解過程中，木質素上的大量疏水集團能夠與纖維素酶上分子的碳鏈發生疏水相互作用，對其進行吸附，降低酶解過程中的有效酶量，阻礙纖維素的酶解。添加表面活性劑后，部分表面活性劑可與纖維素酶發生競爭，并部分吸附到木質素表面，從而減少了纖維素酶在木質素表面的無效吸附，最終使整個過程所需的酶負荷量減小，進而提高纖維素原料的酶解率[18, 25]。WILLIAM等人研究發現[22]，當添加0.15 g/g干基質的吐溫80時纖維素72 h酶解率提高36%，半纖維素酶解率提高18%。吐溫80在整個酶解過程的作用主要有3點：纖維素酶穩定劑、木質素破壞劑以及纖維素酶效應物。綜上所述，添加吐溫80能夠促進纖維素酶酶解，這有利于高濃度纖維素基質在低纖維素酶添加量時實現高轉化效率。因此，后續實驗中選擇添加30 mg/g基質的吐溫80，以促進基質酶解產糖。

2.4 分批補料濃醪酶解的加酶方式選擇

前面基質濃度實驗證明了常壓堿性甘油預處理甘蔗渣基質具有很好的可酶解性，在酶載量6 FPU/g基質條件下150 g/L濃度基質的48 h酶解率達到了80%。鑒于過高基質濃度的黏度和流體力學問題，本論文采用了分批補料方式進一步提高酶解時的基質濃度[1, 26-27]。實驗中選擇酶解的初始基質質量濃度為150 g/L，加酶量6 FPU/g基質，在酶解起始12、18、24、30 h分別補加提高50 g/L基質濃度的基質，從而使得酶解30 h時基質質量濃度達到350 g/L，在該條件下考察不同加酶方式對產糖的影響。加酶方式1#是在酶解起始時一次性加入350 g/L基質濃度對應的所有纖維素酶，后面補料時只補加基質；加酶方式2#選擇在酶解起始時一次性加入所需纖維素酶總量的2/3，補加基質時再平均補加剩余的1/3的纖維素酶量。

結果如圖5所示，加酶方式1#，48 h時葡萄糖產量達到106 g/L，96 h時達到了128 g/L。加酶方式2#，在對應酶解時間點的葡萄糖質量濃度分別為88 g/L和116 g/L。實驗表明，在酶解前期一次性添加所有纖維素酶有利于整個分批補料酶解過程的產糖，其葡萄糖產量在整個酶解過程中均明顯高于加酶方式2#，加酶方式1#更加有利于分批補料濃醪酶解過程中葡萄糖的生成。該結果似乎與OLOFSSON等人報道相矛盾，他們在利用構建的數學模型研究加酶方式對SSCF過程中糖的轉化效率時發現，分批補加纖維素酶有利于糖的轉化，其原因在于糖的積累會對纖維素酶造成反饋抑制[28]。不過，本文結果與WANG和GAO等的研究結果一致[29-30]，酶解起始時加入所有的纖維素酶能夠使基質迅速液化，快速減小酶解液的黏度，當后續補加物料時體系里傳質傳熱均達到了一個比較理想的水平。兩種觀點不一致的原因可能在于：本實驗中基質酶載量相對較低，一次性加酶在促使基質快速液化和減小黏度的同時并沒有產生大量葡萄糖以反饋抑制纖維素酶；另外，不同種類纖維素酶對糖反饋抑制的耐受性不同而導致的，本實驗中所用的Cellic CTec2酶制劑屬于諾維信新一代纖維素酶產品，適用于高濃度基質的酶解發酵，糖濃度耐受性更好。鑒于此，選擇加酶方式1#開展后續實驗。

圖5 分批補料不同加酶方式對產糖的影響Fig.5 Effects of the enzyme feeding mode on enzymatic hydrolysis of substrates

2.5 分批補料基質濃醪酶解產糖

本實驗選擇初始基質質量濃度為15 g/L，纖維素酶添加量為6 FPU/g基質，吐溫80添加量為30 mg/g基質，考察分批補料至350 g/L基質濃度的濃醪酶解。實驗結果如圖6所示。在酶解前30 h，添加吐溫80與否的基質酶解趨勢差不多一致，酶解30 h酶解液中葡萄糖質量濃度都在90 g/L左右，此時吐溫80添加對酶解產糖未起到明顯促進作用。但酶解開始30 h后添加表面活性劑的分批補料濃醪酶解產糖快速提高，72 h基本完成酶解，水解產量基本達到最高水平132 g/L，達到理論產糖量的60%；未添加表面活性劑的分批補料酶解產糖過程相對緩慢，72 h產糖110 g/L，96 h產糖120 g/L。分析認為[22-23]，酶解初始時纖維素酶含量較高，相當于14 FPU/g基質，木質纖維素基質結合位點主要被纖維素酶占據，所以吐溫80作用不明顯；酶解30 h后完成了分批補料，此時醪液中基質濃度是350 g/L，纖維素酶濃度顯著降低(理論上為6 FPU/g基質)，此時基質的一些結合位點被吐溫80占據，所以吐溫80此時起發揮有效作用。

不少研究者采取分批補料策略探討高濃度基質的濃醪酶解，如表1所示。龔信芳等人[31]采用以40 g/L為起始底物濃度，每隔12 h進行補料對木薯渣進行分批補料酶解，使得最終底物濃度為160 g/L，72 h水解液中葡萄糖濃度為65.7 g/L。GAO等[30]以120g/L基質濃度為起始基質濃度，分別在6、12和24 h補加7%基質，從而使得最終基質濃度達到了330 g/L，加酶量10 FPU/g基質，酶解120 h的葡萄糖濃度達到了129.50 g/L，葡萄糖轉化率達到了理論值的60%。WANG等[32]在加酶量20 FPU/g纖維素和添加一定量吐溫80條件下，以150 g/L基質濃度作為初始基質濃度，在酶解24 h和30 h分別補加50 g/L和100 g/L基質，使得最終基質濃度達到300 g/L，72 h葡萄糖產量為88.95 g/L。

圖6 基質的分批補料濃醪酶解Fig.6 Fed-batch thick-mash enzymatic hydrolysis of substrates

表1 不同分批補料酶解結果的對比Table 1 Comparison of various fed-batch thick-mash enzymatic hydrolysis of substrates

相比上述實驗結果，本文開展的木質纖維素基質濃醪酶解結果是比較理想的，在實現濃醪酶解 “三高”(高濃度、高轉化率和高轉化效率)特點方面有明顯進展。課題組早期曾評估過常壓甘油自催化有機溶劑預基質的可酶解性，發現預處理后麥草具有較好的可酶解性，但該評估是在低基質濃度(20 g/L，加酶量5 FPU/g基質)條件下進行的，缺乏工業應用價值[33]。在此基礎上，本文以常壓堿性甘油有機溶劑預處理甘蔗渣為原料，探討預處理后基質濃醪酶解(基質濃度350 g/L, 6 FPU/g基質)的可行性。

3 結論

本論文通過考察不同的加酶方式和不同的添加劑對酶解產糖的影響，利用分批補料酶解手段，使得常壓甘油有機溶劑預處理基質在350 g/L質量濃度時酶解72 h，葡萄糖質量濃度為132 g/L，酶解率60%。常壓甘油有機溶劑預處理基質在濃醪方面具有很強的可酶解性，實現了在低加酶量條件下的濃醪酶解產糖，這為下一步繼續開展低酶載量下濃醪基質的“三高”酶解和纖維素乙醇發酵奠定了基礎。

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Thick-mashenzymatichydrolysisofatmosphericglycerolorganosolvpretreatedsugarcanebagasse

HONG Jia-peng1, YUE Chun2, ZHAO Xiao-qin1, Marie Rose Mukasekuru1,LI-Xiang1, SUN Fu-bao1*, SUN Hai-yan3

1 (The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2 (School of Biotechnology, Nanyang University of Technology,Nanyang 473004, China)3 (Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Haikou 571101, China)

In order to reach the "THREE-HIGH" (High-titer, High-productivity and High-conversion) technical levels of enzymatic hydrolysisat low cellulase loading, the enzymatic hydrolysis at high solid concentration was conducted. The enzymatic hydrolysis conditions were optimized enzyme loading 6 FPU/g substrate, substrate concentration 150 g/L) and the suitable additive (Tween 80 30 mg/g substrate. Further, a fed-batch strategy was adopted to make the final solid concentration up to 35%, followed by detecting a reasonable cellulase addition way.Finally, the final glucose yield achieved 132 g/L at 72 h from the fed-batch thick-mash enzymatic hydrolysis, with 60% of the cellulose conversion.Results indicate that the atmospheric alkali-catalyzed glycerol pretreated substrate very applicable and attractive for the thick-mash enzymatic hydrolysis at a low cellulase loading. The feedbatcha preferable way to realize "THREE-HIGH" technological level of thick-mash enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass.

atmospheric glycerol organosolv pretreatment; sugarcane bagasse; thick-mash enzymatic hydrolysis; fed-batch; surfactant

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014387

碩士研究生(孫付保為通訊作者,E-mail: fubaosun@jiangnan.edu.cn)。

國家自然科學基金(21176106)：中國博士后科學基金(2015M571666;2016T90419)；江蘇省生物質綠色燃料與化學品重點實驗室資助課題(JSBGFC14006)；河南省科技開放合作項目(162106000007)

2017-03-21，改回日期：2017-04-27