NADH氧化途徑遷移促進丁酸梭狀芽孢桿菌的生長

夏會麗，陳思思，陳雄，黃亞男，謝婷，李愛玲，王志*

1(發酵工程教育部重點實驗室，湖北省工業發酵協同創新中心，湖北省工業微生物重點實驗室，湖北工業大學，湖北 武漢，430068)2(河南省南街村(集團)有限公司，河南 臨潁，462600)3(天方藥業股份有限公司，河南 駐馬店，463000)

NADH氧化途徑遷移促進丁酸梭狀芽孢桿菌的生長

夏會麗1，陳思思1，陳雄1，黃亞男2，謝婷3，李愛玲3，王志1*

1(發酵工程教育部重點實驗室，湖北省工業發酵協同創新中心，湖北省工業微生物重點實驗室，湖北工業大學，湖北 武漢，430068)2(河南省南街村(集團)有限公司，河南 臨潁，462600)3(天方藥業股份有限公司，河南 駐馬店，463000)

為提高丁酸梭菌的發酵生物量，首先在厭氧瓶水平確定了0 h添加0.2 mmol/L乙醛可以有效提高細胞數，后在10 L發酵罐規模研究了葡萄糖和乙醛共補料策略對丁酸梭菌發酵性能的影響。結果表明：采用葡萄糖和乙醛共補料能獲得較高的生物量(11.37×108CFU/mL)，相對于葡萄糖補料發酵(9.93×108CFU/mL)和批發酵(9.39×108CFU/mL)分別提高了14.5%和21.1%。發酵8 h時，丁酸和乙酸的比生成速率相對于葡萄糖補料發酵分別降低18.9%和17.3%，而乙醇的比生成速率卻提高了9.7%，實現了高生物量和低產酸的相對統一。乙醛的添加使NADH的氧化由丁酸合成途徑部分向乙醇合成支路遷移，增強了乙醇的合成效率，降低丁酸、乙酸的積累，提高了丁酸梭菌的生長效率。

丁酸梭菌；生物量；NADH的氧化；乙醛

丁酸梭狀芽孢桿菌(Clostridiumbutyricum)主要存在于干酪、動物的腸道與糞便、土壤等自然環境中[1-2]，是直或彎曲的革蘭氏陽性厭氧內生芽孢桿菌。菌落白色或奶油色，呈煎蛋樣，中間隆起，菌體中常有圓形或卵圓形芽孢，無孢子外壁和附屬絲，形成芽孢后中部膨大呈梭狀或紡錘狀使菌體偏末端部膨大呈梭狀，單個或成對，短鏈，偶見絲狀菌體，周生鞭毛，具有運動性[3-4]。

丁酸梭菌經糖酵解途徑發酵葡萄糖產生丙酮酸、NADH和ATP。乙酰CoA在系列酶的作用下生成丁酸伴隨NADH的氧化和ATP的生成，丁酸、NADH的氧化和ATP的摩爾關系是1∶2∶1。乙酰CoA在乙醛脫氫酶和乙醇脫氫酶的作用下經乙醛生成乙醇，伴隨著NADH的氧化，乙醇和NADH的氧化的摩爾關系是1∶2，但是該方向的碳通量往往不是很大[6]。

發酵過程中隨細菌快速增長而大量積累的有機酸會對細胞產生酸脅迫效應[7-9]，細菌應激響應策略之一是代謝由酸生成向有機分子(如乙醇、丙二醇、1,3-丁二醇等)合成遷移。乙醛是酵母等微生物厭氧發酵過程中常見的特征性分子[10]，乙醛還原為乙醇的過程中能通過NAD+的再生促進NADH/NAD+的平衡而刺激酵母生長[11]。但是，由于丁酸梭菌經乙醛生成乙醇的碳通量不是很大[6]，能否通過強化該途徑以競爭性降低乙酸、丁酸的合成效率來緩解酸脅迫還未見報道。

為提高丁酸梭菌的生物量及生長效率，本研究首先在厭氧瓶水平優化了乙醛的添加濃度，確定了乙醛的促生長功能。在此基礎上重點研究了10 L發酵罐水平丁酸梭菌批培養、碳源補料發酵和碳源乙醛共補料發酵的生長、酸醇代謝差異，為該菌株的工業化生產提供理論依據和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丁酸梭狀芽孢桿菌HBUT-01(ClostridiumbutyricumHBUT-01)，為本實驗室從河畔污泥中分離得到的菌株，菌落為奶油色的規則圓形菌落，生長過程中有H2產生，細胞中間膨脹，呈梭形，一端有淀粉粒積累，現保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC M 2016628)[12]。

種子培養基(g/L)：葡萄糖8.0，胰蛋白胨10.0，牛肉膏10.0，酵母粉3.0，瓊脂20，pH 7.2，115 ℃滅菌20 min。

發酵培養基(g/L)：葡萄糖16.1，蛋白胨25.0，酵母粉7.0，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.8，MnSO4·H2O 0.02，p H 7.2，115 ℃滅菌20 min。

酵母粉：安琪酵母股份有限公司；甲酸：天津市光復精細化工研究所；蛋白胨：山東青島悅康生物技術有限公司；其他試劑均來自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DELTA 320 pH計，梅特勒托利多儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；CJ-2D型無菌操作臺，天津市泰斯特儀器有限公司；SGJ-10 L/C發酵罐，上海聯環生物工程設備有限公司；TG18M臺式高速離心機，長沙平凡儀器儀表有限公司；HNY-211B全溫振蕩培養箱，天津歐諾儀器儀表有限公司； UVmini-1240紫外可見分光光度計，島津制作所；蠕動泵，保定蘭格恒流泵有限公司；高效氣相色譜，安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1培養方法

斜面種子活化方法：將保藏在-20 ℃中的丁酸梭菌的厭氧甘油管在氮氣保護下，用接種環接種到厭氧管斜面，恒溫培養箱中37 ℃培養12 h。

厭氧瓶種子培養方法：培養好的斜面，在氮氣保護下加無菌、無氧的生理鹽水3 mL洗菌苔，倒入無菌無氧的空三角瓶中，搖晃均勻，取0.6 mL菌懸液于種子培養基(厭氧瓶120 mL，裝液量30 mL)，于37 ℃、100 r/min的搖床內培養12 h。

厭氧瓶發酵培養方法：裝液體量30 mL，初始pH 7.2，115 ℃高壓滅菌20 min，以2%的接種量轉接厭氧瓶種子菌液，37 ℃，100 r/min的搖床內培養9～12 h。

10 L罐培養方法：發酵培養基基料5 L，接種量2.5%(v/v)，轉速100 r/min，接種前、后通氮氣(流量0.1 vvm)各1 h，后密閉培養。37 ℃培養約12 h左右。用10 mol/L的NH3·H2O控制pH在6.0左右。

10 L罐葡萄糖補料發酵方法：補料瓶中裝8%葡萄糖溶液600 mL，115 ℃高壓滅菌20 min，5～10 h流加8%葡萄糖溶液，控制流加速率使葡萄糖維持在3.0 g/L左右。pH控制同上。

10 L罐葡萄糖和乙醛的共補料發酵方法：滅過菌的8%葡萄糖溶液中加40%乙醛溶液(0.22 μm濾膜過濾)0.16 mL，流加方法同上。pH控制同上。

1.3.2 菌體干重測定

取8 mL發酵液于離心管中，6 000 r/min離心5 min后棄上清。將收集到的菌體用5 mL蒸餾水重懸菌體，離心并重復洗滌2次。然后將菌體105 ℃烘干至恒質量，稱質量計算細胞干重[13]。

1.3.3 細胞數的測定

使用Hungate滾管計數法進行計數[14]。

1.3.4 丁酸、乙酸的測定

采用氣相色譜法測定：安捷倫7890B GC，FID檢測器，HP-INNOWax毛細管柱柱長30 m，內徑0.53 mm，膜厚1 μm；程序升溫條件：40 ℃保留5 min，后以20 ℃/min升到120 ℃，再以10 ℃/min 升到220 ℃，220 ℃ 保留3 min。流速 5 mL/min，進樣口溫度250 ℃，檢測器280 ℃[15]。

1.3.5 葡萄糖測定

葡萄糖含量測定采用3,5-二硝基水楊酸法[16]。

1.3.6 乙醇濃度的測定

使用SBA-40C生物傳感器測定乙醇濃度。

2 結果與分析

2.1 不同乙醛添加量對丁酸梭菌生物量的影響

發酵過程代謝由小分子有機酸向醇分子合成遷移是細菌和酵母等微生物緩解酸脅迫效應的應激響應策略之一。由于丁酸梭菌經乙醛生成乙醇的碳通量不是很大[6]，能否通過強化該途徑降低乙酸、丁酸的合成效率來緩解酸脅迫？因此，考察了不同乙醛添加量對丁酸梭菌生長的影響，如圖1所示。

圖1 乙醛的添加對生物量的影響Fig.1 Effect of acetaldehyde addition on the biomass

乙醛的添加量對丁酸梭菌細胞數的影響成峰型分布，以0.2 mmol/L的添加量生物量最高，達到9.31×108CFU/mL，比對照組(7.35×108CFU/mL)提高26.7%，比0.1 mmol/L和0.3 mmol/L的添加量分別提高1.3%和20.1%?？紤]到丁酸梭菌在厭氧瓶和10 L發酵罐規模的代謝差異以及在10 L發酵罐規模生物量的提高，0.1 mmol/L可能不能滿足菌體的需要，因此確定乙醛的最佳添加濃度為0.2 mmol/L。

2.2 厭氧瓶中添加0.2 mmol/L乙醛對丁酸梭菌生長和代謝的影響

厭氧瓶發酵，0 h添加0.2 mmol/L的乙醛(實驗組)，其對丁酸梭菌生長和主要代謝的影響如圖2所示。

圖2 添加0.2 mmol/L乙醛對丁酸梭菌生物量、丁酸、乙酸和乙醇的影響(實心標識為對照組、空心標識為實驗組)Fig.2 Effect of acetaldehyde addition at 0 h on biomass, butycate, acetic and ethanol of Clostridium butyricum (Filled symbols are the experimental, open symbols are the control)

發酵過程中細胞數比對照組提高10%～15%。另外，發酵過程中丁酸、乙酸質量濃度都持續增加，發酵結束時實驗組丁酸、乙酸質量濃度分別為2.55 g/L和0.73 g/L，比對照組的3.25 g/L和0.87 g/L分別降低21.5%和16.4%。但是，發酵結束時實驗組乙醇質量濃度為0.24 g/L，比對照組提高20%，說明乙醛的添加確實促進了乙醇的生成，降低丁酸、乙酸的合成，提高了丁酸梭菌的生長效率。

2.3 10 L發酵罐分批培養丁酸梭菌的生長與產酸特性

在10 L發酵罐中發酵培養丁酸梭菌，菌體生長和主要代謝變化如圖3所示。

圖3 丁酸梭菌在10 L發酵罐中的生長與產酸醇過程Fig.3 Time course of cell growth as well as acids and ethanol production in batch culture by Clostridium butyricum

經過短暫的延遲期，細胞對數生長至8 h(峰值，9.39×108CFU/mL)后開始自溶，10 h為7.85×108CFU/mL，比峰值下降16.4%。有趣的是，丁酸濃度與細胞數的變化幾乎一致，菌體的生長和丁酸濃度存在明顯的相關性，并有很好的線性相關性(以丁酸濃度為橫坐標，對應時間點的細胞數為縱坐標得到一線性方程：y=0.356 8x-0.587，R2=0.971 7)。2～8 h丁酸質量濃度持續增加至2.98 g/L，之后逐漸降低。乙酸的積累相對較少，8 h乙酸質量濃度(峰值)為0.5 g/L。發酵至10 h時，丁酸濃度是乙酸濃度的6.32倍(表1)，這也說明，丁酸梭菌以丁酸發酵為碳代謝主流。2～8 h細胞對數生長的同時葡萄糖快速消耗，平均消耗速率為2.56 mg/(g·h)，8 h發酵液中葡萄糖質量濃度僅為0.88 g/L。由于葡萄糖等碳源的不足使菌體的抗逆性變差，8 h后細胞開始自溶，這為后期的研究提供了重要的補料窗口信息。

2.4 流加葡萄糖對HBUT-01生長和代謝的影響

在10 L發酵罐中發酵培養丁酸梭菌，5～10 h流加8%葡萄糖溶液(600 mL)，控制流加速率使葡萄糖維持在3.0 g/L左右(優化后的殘糖濃度，資料未顯示)，菌體生長和主要代謝變化如圖4所示。

圖4 流加葡萄糖對丁酸梭菌生長和代謝的影響(虛線表示補料的結束和開始)Fig.4 Effects of the feed with glucose on biomass and metabolism of Clostridium butyricum (The vertical dotted lines indicate the start and the end of fed-batch)

經過2 h的延遲期，細胞對數生長至8 h細胞數最大(9.93×108CFU/mL)，比批發酵對照提高6%。由于葡萄糖的流加，整個發酵周期中丁酸和乙酸質量濃度都持續增加。對數末期(8 h，以下同)丁酸質量濃度及其比生成速率分別為3.09 g/L(比對照批發酵提高4%)和74 mg/(g·h)(比對照批發酵僅降低1.33%)，乙酸質量濃度和比生成速率分別為0.36 g/L、8.67 mg/(g·h)。

另外，補料結束時，流加葡萄糖批發酵的乙醇質量濃度為0.26 g/L，和對照批發酵相當。丁酸質量濃度是乙酸的8.02倍(表1)，比對照批發酵高26.9%，說明流加葡萄糖增強了EMP途徑碳通量，增加的NADH優先通過合成丁酸來生成NAD+，保證NADH/ NAD+的平衡，維持代謝過程的正常進行，而且碳流經乙醇合成途徑氧化NADH不占優勢[17]。流加葡萄糖生成乙醇的濃度并沒有增加，再次驗證了乙酰輔酶A到乙醇的碳通量不是很大的報道[6]。

表1 菌株HBUT-01在不同發酵條件下的酸醇比生成速率(實驗數據為3個樣品的平均值±標準偏差)Table 1 Specific production rate of acids, ethanol in different fed-batch culture condition of HBUT-01(Data are means±S.D., n=3)

注：相同的字母表示差異不顯著(p<0.05)。

2.5 流加葡萄糖和乙醛對丁酸梭菌生長和代謝的影響

在上述分批補料條件下，8%的葡萄糖補料溶液中添加0.16 mL濃度40%的乙醛(罐內終濃度為0.2 mmol/L)，控制相同的流加速率，菌體生長和主要代謝變化如圖5所示。

圖5 流加葡萄糖和乙醛共補粒對丁酸梭菌生長和代謝的影響(虛線表示補粒的結束和開始)Fig.5 Effects of the co-feed with glucose and acetaldehyde on biomass and metabolish of Clostridium butyricum(The vertical dotted lines indicate the start and the end of fed-batch)

2～8 h細胞快速生長達到峰值(11.37×108CFU/mL)，比葡萄糖補料發酵提高14.5%，比批發酵提高21.1%。葡萄糖和乙醛共補料的整個發酵過程中，丁酸和乙酸的合成效率均降低。8 h丁酸質量濃度(2.76 g/L)和其比生成速率比葡萄糖補料發酵分別降低10.7%、18.9%，見表1；乙酸質量濃度(0.33 g/L)和其比生成速率比只補葡萄糖的對照組分別降低11.6%、17.3%。

另外，葡萄糖和乙醛共補料，乙醇的合成增強。對數末期乙醇質量濃度(0.35 g/L)和比生成速率比只葡萄糖補料發酵分別提高20.7%和10%。補料結束時乙醇質量濃度(0.36 g/L)和比生成速率分別比只補葡萄糖的對照組(0.26 g/L、7.47 mg/(g·h))提高38.5%和3.1%。

由于丁酸梭菌以丁酸發酵為主，以補料結束時生成的丁酸和乙醇的摩爾質量和葡萄糖補料發酵相比，進行概算，發現：添加乙醛分子后乙醇的生成量增加2.2 mmol/L，由于1 mol乙酰CoA生成乙醇需要氧化2 mol的NADH，因此，由此途徑氧化的NADH增加4.4 mmol/L。另一方面丁酸減少5.34 mmol/L，由于1 mol乙酰CoA生成丁酸需要氧化2 mol的NADH，因此，由此途徑氧化的NADH減少10.68 mmol/L。說明：經丁酸合成途徑氧化的NADH有41.2%向乙醇支路遷移，增強了乙醇合成、減少了丁酸生成；有2 mmol/L的乙醇的碳架是由乙酰CoA節點流入，乙醛分子作為代謝調控因子起到了調控糖代謝流的作用；丁酸梭菌碳代謝中NADH的氧化還有乳酸和氫氣的生成途徑等，減少的約有58.8%的經丁酸合成途徑氧化的NADH也可能進入了這些途徑。

3 結論

本實驗在10 L發酵罐水平考察了葡萄糖和乙醛共補料策略對丁酸梭菌發酵生長的影響，獲得了一種有效的流加發酵策略，即5～10 h同時流加葡萄糖和乙醛溶液，生物量達到了11.37×108CFU/mL，并且發酵液中丁酸和乙酸濃度降低，使得原來經丁酸合成途徑氧化的NADH有41.2%向乙醇支路遷移，強化了乙醇途徑，有效緩解了酸脅迫，促進丁酸梭菌的生長，成功實現了高生物量和低有機酸產量的相對統一。并且發現乙醇生成途徑不是丁酸梭菌NADH氧化的主要通路，但是該途徑可以通過外源乙醛分子的添加得到強化，乙醛還原酶可能是該途徑的代謝瓶頸。本研究獲得的流加策略對丁酸梭菌工業化生產具有一定的指導意義。

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NADHoxidationtransferpromotesthegrowthofClostridiumbutyricum

XIA Hui-li1, CHEN Si-si1, CHEN Xiong1, HUANG Ya-nan2,XIE Ting3, LI Ai-ling3, WANG Zhi1*

1(Key Laboratory of Engineering (Ministry of Education), Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation, Hubei Key Laboratory of Industrial Microbiology, Hubei University of Technology, Wuhan 430068,China)2(Nanjiecun (Group) Co. Ltd., Linying 462600, China) 3(Topfond Pharmaceutical Co. Ltd., Zhumadian 463000, China)

In order to improve the biomass ofClostridiumbutyricum, acetaldehyde addition with an optimized concentration of 0.2 mmol/L at 0 h was first ensured at the anaerobic bottles level, which can significantly increase the biomass, and then, the effects of glucose co-feeding with acetaldehyde strategies on the fermentation characteristics ofClostridiumbutyricumin a 10 L bioreactor were investigated. The results showed that glucose co-feeding with acetaldehyde enhanced the cell growth (11.37×108CFU/mL), which was 14.5% and 21.1% higher than those of glucose fed-batch culture (9.93×108CFU/mL) and the batch culture (9.39×108CFU/mL). Furthermore, the specific productivity of butyrate and acetic decreased by 18.9% and 17.3%, and the specific productivity of ethanol was increased by 9.7% glucose fed-batch culture, achieving the unity between a higher biomass and a lower acid production simultaneously. The addition of acetaldehyde promoted the NADH oxidation from butyrate biosynthesis pathway to the ethanol biosynthesis branch, which enhanced the ethanol synthesis with the reduced accumulation of butyrate and acetate, and the cell growth efficiency ofClostridiumbutyricumwas improved simultaneously.

Clostridiumbutyricum; biomass; NADH oxidation; acetaldehyde

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014394

碩士研究生(王志副教授為通訊作者,E-mail: 476462848@qq.com)。

湖北省自然科學基金(2014CFB604)

2017-03-27，改回日期：2017-05-08