微生物擴增子高通量測序技術在水產品加工與貯藏中的應用

王偉，冷凱良，劉均忠，郝建華，孫謐*

1(中國水產科學研究院黃海水產研究所，農業部極地漁業開發重點實驗室，山東 青島，266071)2(青島海洋科學與技術國家實驗室，海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東 青島，266235)

微生物擴增子高通量測序技術在水產品加工與貯藏中的應用

王偉1,2，冷凱良1，劉均忠1,2，郝建華1,2，孫謐1,2*

1(中國水產科學研究院黃海水產研究所，農業部極地漁業開發重點實驗室，山東 青島，266071)2(青島海洋科學與技術國家實驗室，海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東 青島，266235)

簡介了微生物擴增子高通量測序技術，簡述該技術在水產品加工與貯藏研究中的應用現狀。在發酵水產品、水產品低溫加工和保鮮防腐等方向，眾多研究以高通量方法測定細菌和古菌的16S rRNA基因片段，準確獲得水產品中微生物的種類和數量信息。微生物擴增子高通量測序技術優于傳統的可培養法，也優于許多非培養分析技術。同時還指出了該技術的存在問題及對策，并探討了該技術的發展方向和應用前景。

擴增子高通量測序;16S rRNA基因;水產品加工與貯藏;微生物檢測

新1代測序(next-generation sequencing, NGS)是區別于經典的桑格測序法的革命性技術，近十幾年迅速發展，已成為主流的測序方法，實現了高通量測序(high throughput sequencing, HTS)[1]。高通量測序使核酸測序成本大幅度下降，從而推動了生命科學各學科的發展[2]。在食品微生物生態學領域，高通量測序技術已成為最重要的非培養技術，主要用于16S rRNA等基因的擴增子(amplicon)測序[3]。擴增子高通量測序可以檢測食品中微生物群落的結構及時空動態變化[4]，為提高食品質量和安全管理水平提供指導。在水產品加工與貯藏領域，目前國內外學者在發酵水產品、水產品低溫加工和保鮮防腐等方向也開始應用微生物擴增子高通量測序技術，獲得了理想的結果。本文述評微生物擴增子高通量測序技術在水產品加工與貯藏研究中的應用現狀，并展望該技術的發展趨勢。

1 微生物擴增子高通量測序技術簡介

16S rRNA基因是用于細菌和古菌分類鑒定的主要基因[5]，目前應用廣泛的第2代測序儀的測序讀長無法覆蓋該基因的1.5 kbp全長，只能測定16S rRNA基因的一段序列。該基因序列含有間隔排列的10個保守區和9個高變區(V1-V9)，可以根據高變區側翼的保守區設計簡并PCR引物，選擇性擴增特定的高變區[6]。提取待測樣品的總DNA后，以PCR方式獲得其中細菌和古菌的16S rRNA基因片段并構建擴增子文庫。對文庫中的PCR產物高通量測序，就能獲得每個樣品中數萬條甚至十幾萬條16S rRNA基因片段的序列，再以生物信息學的方法去除錯誤的測序結果，劃定微生物操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)，并和參考數據庫中已知的微生物基因比較，確定OTU的分類學地位。最后進行微生物生態學分析，計算多樣性指數，進行系統發生樹分析、菌群差異分析、多維度分析和功能預測分析等[7]。

基于焦磷酸測序原理的454測序系統是最先上市的高通量測序平臺[8]，但由于測序費用偏高目前已被最主流的Illumina公司測序儀取代。Illumina的HiSeq2500和MiSeq測序儀是16S rRNA基因擴增子測序的最常用平臺，最大讀長分別為2×250 bp和2×300 bp。賽默飛世爾公司的基于半導體測序原理的Ion PGM測序儀讀長可達400 bp，也用于16S rRNA基因擴增子測序[9]；較新的Ion S5測序儀讀長可達600 bp。Pacific Bioscience公司的第3代測序儀PacBio RS II和Sequel的讀長都超過20 kbp；Oxford Nanopore公司的第3代測序儀MinION讀長超過6 kbp[2]。目前以第3代測序儀開展16S rRNA基因高通量測序的研究報道較少。

2 微生物擴增子高通量測序技術的主要優勢

水產品微生物的研究技術中，16S rRNA基因擴增子高通量測序是一種非培養分析法(culture-independent analysis)，它克服了傳統的培養法對培養基、培養溫度等培養條件的依賴，直接從樣品DNA中確定門、綱、目、科、屬等各個分類學等級上的微生物的種類和相對豐度，可以獲得樣品中大多數微生物的信息。在其他非培養分析法中，熒光定量PCR(qPCR)只能檢測微生物總量和某類微生物數量；限制性內切酶片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)，變性梯度膠凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)，溫度梯度膠凝膠電泳(temperature gradient gel electrophoresis,TGGE)等技術都以PCR擴增16S rRNA基因片段，但后續分析依賴電泳和傳統的桑格測序，結果的準確度以及檢測到的微生物種類數都無法和16S rRNA擴增子的高通量測序相比。微生物擴增子高通量測序還易于開展樣品的高通量分析，即同時對大量樣品開展研究[4]。因此，這一技術在水產品加工和貯藏領域的應用日趨廣泛(表1)。

表1 微生物16S rRNA基因擴增子高通量測序在水產品加工和貯藏中的應用Table 1 High-throughput microbial 16S rRNA amplicon sequencing in the study of processing and storage of aquatic food

注：*V1-V3區為細菌測序，V3-V5區為古菌測序。

3 水產品加工領域的應用

微生物擴增子高通量測序可用于檢查水產品加工過程中微生物污染。M?RETR?等[12]監測7個加工廠的大西洋鮭魚片，發現主要污染菌是假單胞菌(Pseudomonas)和希瓦菌(Shewanella)。在水產品發酵工藝中應用高通量測序的報道較多：ROH等[21]發現7種發酵海鮮產品的古菌種類都多于細菌，其中6種產品的嗜鹽古菌為優勢菌；KOYANAGI等[22-24]發現在咸魚壽司發酵過程中，乳酸菌占絕對優勢；鹽發酵的日本毛蝦在不同的溫度、鹽濃度和發酵時間等條件下取樣檢測，菌群變化情況為最優發酵條件的選擇提供了重要依據[25-27]；吳燕燕等比較傳統法和新型乳酸菌法腌干魚的發酵工藝，發現新工藝方法獲得的樣品中有益微生物占優勢[29]；于美娟等發現傳統固態發酵魚制品中細菌多樣性豐富，但具有潛在危害的細菌種類也較多[30]。

4 水產品貯藏領域的應用

國內外學者以擴增子高通量測序法對各種水產品在不同保藏條件下菌群隨時間的變化及腐敗菌進行了檢測。CHAILLOU等[10]發現腐敗的鱈魚片中優勢菌為未知的梭桿菌(Fusobacteriales)，而腐敗的鮭魚片中有高溫菌Hydrogenophilushirshii和Geobacillusdebilis，可能來自低溫養殖環境；CALLIAUW等[13]發現4 ℃氣調包裝的去皮褐蝦(Crangoncrangon)腐敗時，可培養方法和高通量測序法能檢測出的細菌種類相似，但相對豐度差別較大；王晶晶等[16]檢測輻照真空包裝的象拔蚌(Panopeaabtupta)，當電子束和γ射線兩類輻照劑量高于4 kGy時，兩類產品中優勢腐敗菌均為變形細菌(Proteobacteria)；儲建軍等[17]發現縊蟶(Sinonovaculaconstricta)冰溫?；钇诮K點的優勢腐敗菌為假單胞菌；朱迎春等[18]發現氣調包裝協同冰溫貯藏革胡子鯰(Calariasgariepinus)魚片顯著降低了細菌的多樣性和豐度，添加保鮮液能抑制主要腐敗菌乳球菌(Lactococcus)。

高通量測序法在應用中充分展示出前述的優勢，能檢出培養法無法檢出的難培養的優勢微生物，還能確定樣品中大多數微生物的相對豐度。不過上述部分研究也說明其檢測結果和傳統培養法及其他非培養方法的結果不是完全一致的[13-14]。

5 存在問題

微生物擴增子高通量測序在水產品加工和貯藏中的應用研究報道幾乎均為細菌和古菌的16S rRNA基因測序，未見真菌轉錄間隔區(ITS)，18S rRNA或26S rRNA基因測序。這可能和水產品研究中對真菌關注較少有關。對真菌進行高通量測序檢測，有可能發現潛在的有益或有害真菌。

由于DNA穩定性較好，高通量測序前提取樣品的總DNA中含有暫未降解的已死亡的微生物DNA，以致研究者無法確定檢測到的微生物是否存活[31]。有3種方案可解決該問題：根據RNA易降解的性質，直接提取樣品中總RNA并反轉錄為cDNA，就能檢測活菌的基因[32]。CHAILLOU等[10]使用NucleoSpin?Plant II試劑盒去除已裂解死亡的微生物的DNA。肖莉莉等[15]使用疊氮溴化丙錠(PMA)預處理南美白對蝦樣品，去除死亡菌體DNA后再進行完整細胞中DNA的提取。PMA作為一種無法進入完整細胞內部的DNA結合光敏試劑，已用于熒光定量PCR檢測的預處理[32]。和常規DNA提取法相比，上述3種方法成本高且操作復雜，并未廣泛使用，但今后可能會成為主流方法。

樣品總DNA中16S rRNA基因的拷貝數在不同種的菌體中存在差異，一般在1～15；同一菌體的16S rRNA基因多個拷貝之間也存在差異[33]。而16S rRNA基因高通量測序的結果默認一個微生物細胞產生1條序列，這就導致多樣性和豐度被高估或低估[34]。真菌ITS區也存在類似問題[31]。樣品總RNA還存在基因轉錄數的差異。對不同種類的微生物16S rRNA基因拷貝數變異問題，有報道以新算法和新軟件改進分析結果的準確度[35]，但尚未廣泛使用。對于細菌種內16S rRNA基因多拷貝差異導致多樣性被高估的問題，SUN等認為16S rRNA基因V4～V5區的種內變異度最低，推薦作為高通量測序的目標區域[36]。

目前16S rRNA基因擴增區域的選擇沒有統一標準，也沒有針對某類水產品或其他食品微生物檢測的專門引物。由于16S rRNA基因的差異，不存在能擴增所有原核生物類群的通用引物[6]。有報道，選擇V1～V2區有利于乳酸菌的分類鑒別[37]，但一般選擇V3～V4或V4～V5區。這兩個區域的基因片段長度滿足Illumina測序儀的測序能力，也有相應的通用簡并引物能擴增大多數原核生物的類群[38-39]。

增加16S rRNA基因片段的測序長度有助于提高微生物分類的準確性?；趩畏肿訉崟r測序原理的第3代測序儀PacBio RS II測定近16S rRNA基因全長的V1～V9區，證明了近全長基因能提供更完整的微生物群落組成信息[40]。ZHENG等以此方法檢測了嬰兒配方奶粉中細菌的種類[41]?；诩{米孔測序原理的小型便攜式第3代測序儀MinION可以將模擬細菌群落的全長16S rRNA基因鑒定到種[42]。第3代測序儀不僅讀長較長，測序時間也較短[2,43]；MinION還有現場測序的優勢。第3代測序技術有取代現有2代測序平臺的潛力，但測序準確度尚不及2代測序，且成本過高；現有分析軟件和數據庫多數都是基于2代平臺的測序數據[43]。因此3代測序平臺在微生物擴增子測序領域暫時無法廣泛應用。預計Illumina測序平臺在今后一段時期內仍是主流，細菌多樣性研究仍將基于16S rRNA基因部分區域的測序結果[6]。檢測真菌也和檢測細菌的16S rRNA基因類似，擴增真菌的ITS1，ITS2，18S rRNA V4等區域的許多通用引物都用于食品微生物多樣性研究[3]。今后高通量測序研究內容仍將是眾多引物擴增各種基因片段，不同基因片段測序結果之間的比較仍存在問題。

6 發展趨勢與展望

隨著高通量測序成本不斷降低和生物信息學的發展，宏基因組(metagenome)測序有可能成為研究水產品加工和貯藏中微生物種類、豐度和功能的重要方法。目前食品領域該技術僅在乳制品發酵研究中有報道[3]。宏基因組測序無需PCR擴增，能夠克服上述基因拷貝數和基因片段選擇的問題，同時檢測水產品中的原核生物、真菌、其他真核微生物及病毒的基因組，獲得微生物群落中重要的功能基因[2]。因此宏基因組測序可以補充擴增子高通量測序的結果。

微生物擴增子高通量測序技術在水產品加工與貯藏研究中尚未為主流研究方法，主要原因是其費用不僅高于培養法，還高于16S rRNA基因克隆文庫RFLP/qPCR/DGGE等非培養方法；而且高通量測序對研究技能提出了更高要求，研究人員要掌握生物信息學相關的分析能力[4]。高通量測序耗時較長無法快速獲得結果，這也是影響其應用的重要原因。因此近期內高通量測序不會替代傳統的培養法成為水產品加工和貯藏的常規檢測技術。不過隨著食品質量和安全越來越受到政府和群眾的重視，水產品加工和貯藏各環節的質量提升和隱患排查也越來越依賴先進的科技手段；由于微生物對水產品質量和安全的重要影響，微生物擴增子高通量測序也將更多地應用于水產品加工和貯藏研究中，并綜合其他檢測方法，指導改善生產管理，提高產品質量和安全性能。

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High-throughputmicrobialrRNAampliconsequencinginthestudyofprocessingandstorageofaquaticfoodproducts

WANG Wei1,2, LENG Kai-liang1, LIU Jun-zhong1,2, HAO Jian-hua1,2, SUN Mi1,2*

1(Key Laboratory of Development of Polar Fisheries, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China)2(Laboratory for Marine Drugs and Bioproducts, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266235, China)

Food microbiology has been revolutionized by the advances in molecular genetic technology of microbial ecology. Novel microbial detection methods have been applied in the study of processing and storage of aquatic food products. The microbial diversity in the sample to be studied could be detected by high-throughput sequencing (HTS) approaches as culture-independent analyses. The aim of this review is to give a brief introduction of the microbial amplicon HTS technology, to present a survey of recent aquatic food investigations via 16S rRNA amplicon HTS and to illustrate the potential of this approach for a valuable tool in the better characterization of aquatic foods and their processing and storage.

shigh-throughput amplicon sequencing; 16S rRNA gene; processing and storage of aquatic products; microbe detection

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014760

博士，副研究員(孫謐研究員為通訊作者,E-mail：sunmi@ysfri.ac.cn)。

中國水產科學研究院基本科研業務費項目(2016HY-ZD0902)；青島海洋科學與技術國家實驗室鰲山科技創新計劃項目(2016ASKJ14)

2017-05-14，改回日期：2017-06-29