過表達mqo對重組谷氨酸棒桿菌L-異亮氨酸和4-羥基異亮氨酸合成的影響

盧正珂,史鋒, 2*

1(江南大學，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

過表達mqo對重組谷氨酸棒桿菌L-異亮氨酸和4-羥基異亮氨酸合成的影響

盧正珂1,史鋒1, 2*

1(江南大學，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

4-羥基異亮氨酸(4-hydroxyisoleucine，4-HIL)具有促進胰島素分泌、降低胰島素抵抗活性功能，在治療糖尿病方面有潛在的應用價值。在產L-異亮氨酸(L-isoleucine，Ile)的谷氨酸棒桿菌SN01菌株中過表達ido基因后可以合成4-HIL。為了促進草酰乙酸的供應和4-HIL合成，在這株重組菌中又過表達了mqo。發酵144 h后，ido-mqo過表達菌的4-HIL產量是(60.86±2.24)mmol/L，低于ido過表達菌(72.06±5.60)mmol/L；但是，Ile的積累量高達(101.39±2.20)mmol/L，顯著高于ido過表達菌(5.00±1.43)mmol/L。對ido-mqo過表達菌代謝途徑中部分關鍵基因的RT-PCR分析表明，進入TCA循環的碳流由異檸檬酸裂解酶分流，進入乙醛酸循環，導致4-HIL合成所需的另一底物α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)供應不足和Ile過剩。于是添加α-KG，當添加量為40 mmol/L時，4-HIL的產量提高到(77.7±10.91)mmol/L，Ile到4-HIL的轉化率提高到75%。因此，過表達mqo能夠促進Ile合成，添加α-KG后能夠促進Ile向4-HIL轉化，從而提高4-HIL產量。

4-羥基異亮氨酸；谷氨酸棒桿菌SN01；L-異亮氨酸；mqo；α-酮戊二酸

據世界衛生組織報道，從1980年到2014年，糖尿病患者人數由1.08億增加到4.22億[1]，其中II型糖尿病患者人數最多。研究表明，葫蘆巴種子可用于臨床治療II型糖尿病[2-3]，這其中起關鍵作用的生物活性物質是(2S,3R,4S)-4-羥基異亮氨酸(4-hydroxyisoleucine，4-HIL)[4]，它具有促進胰島素分泌、降低胰島素抵抗作用[5]，因此4-HIL在治療II型糖尿病方面有潛在的應用價值。

目前，4-HIL的制備方法主要有：葫蘆巴種子提取法、化學-酶合成法、酶合成法和微生物發酵法，其中微生物發酵法是適于工業生產4-HIL最簡單、有效和經濟的方法。2009年，研究人員在蘇云金芽孢桿菌2e2 AKU 0251中發現了異亮氨酸雙加氧酶(L-isoleucine dioxygenase，IDO)[6-8]。IDO催化L-異亮氨酸(L-isoleucine，Ile)發生4-羥化反應，生成4-HIL，同時使α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)發生氧化反應，生成琥珀酸，伴隨消耗氧氣并生成二氧化碳。隨后，SMIRNOV等通過在大腸桿菌(Escherichiacoli)中克隆表達IDO編碼基因ido，將外源添加的Ile轉化成了4-HIL[9]，但發酵中外源添加Ile會增加4-HIL的生產成本。

谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)SN01是1株工業用Ile生產菌，實驗室前期在SN01中克隆和表達來自蘇云金芽孢桿菌YBT 1520的ido基因，將SN01中自身合成的Ile成功轉化為4-HIL[10](圖1)，實現了4-HIL的一步從頭合成，搖瓶發酵144 h后4-HIL產量達到(65.44±2.27)mmol/L，Ile向4-HIL轉化率是85%。

圖1 重組谷氨酸棒桿菌中4-HIL的合成途徑Fig.1 Biosynthesis pathway of 4-HIL in recombinant C.glutamicum

在谷氨酸棒桿菌中，草酰乙酸不僅是TCA循環中關鍵的中間物質，也是IDO催化反應的兩個底物α-KG和Ile的共同前體物質，因此在4-HIL的合成途徑中，草酰乙酸的供應很重要。本研究中，在外源表達ido的基礎上，構建過表達蘋果酸：醌氧化還原酶(malate:quinone oxidoreductase，MQO)編碼基因mqo的重組菌，來增加草酰乙酸的供應，探究重組菌搖瓶發酵中4-HIL產量的變化，為4-HIL的工業化生產提供重要依據。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

所用菌株包括大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌SN01，質粒包括pJYW-4-ido[10]和pJYW-4-ido-mqo，均為本實驗室保藏。

1.1.2 主要培養基

發酵種子培養基：用于發酵前期活化菌株培養，含有24.0 g/L葡萄糖，0.4 g/L (NH4)2SO4，1.25 g/L尿素，40.0 g/L玉米漿，1.0 g/L KH2PO4，0.5 g/L MgSO4，pH 7.2。滅菌條件為121 ℃，15min。

發酵培養基：用于發酵生產氨基酸，含有140.0 g/L葡萄糖，20.0 g/L (NH4)2SO4，10.0 g/L玉米漿，1 g/L KH2PO4，0.5 g/L MgSO4，0.5 g/L FeSO4，20 g/L CaCO3，pH 7.2；需要時添加20、30或40 mmol/L α-KG。滅菌條件為115 ℃，15 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組菌的搖瓶發酵

谷氨酸棒桿菌的搖瓶發酵主要參照方慧敏[11]的操作，其中種子培養基置于回旋式搖床30 ℃、150 r/min培養；發酵培養基置于回旋式搖床30 ℃、200 r/min培養。每隔12 h取1次樣，測定菌體濃度、殘糖、氨基酸含量和α-KG含量等。

1.2.1.1 氨基酸含量的測定

測定胞內外氨基酸含量時發酵樣品的處理方法參照文獻[12]，之后用HPLC測定氨基酸含量[13]。在計算胞內氨基酸含量時首先計算出DCW (g/L) =0.34×OD562，然后再根據1 g DCW = 1.6 mL的公式計算得出胞內體積[14]，最后得出胞內氨基酸的實際含量。

1.2.1.2 α-KG含量的測定

胞內α-KG含量測定方法參照牛騰飛[15]的操作。測定胞外α-KG含量時樣品的處理方法是，首先將發酵液12 000 r/min離心5 min，取上清液經0.22 μm孔徑的水相針式濾膜過濾后，再進行后續HPLC操作測定α-KG含量。胞內外α-KG的計算方法參照胞內外氨基酸的計算方法。

1.2.2 基因轉錄水平分析

利用RNA反轉錄和RT-PCR分析菌株中關鍵基因的轉錄水平。取48 h的發酵液200 μL，12 000 r/min離心3 min，沉淀用100 mg/mL的溶菌酶于37 ℃處理30 min，后續具體操作參照RNA提取試劑盒說明書、cDNA反轉錄試劑盒說明書。反應以16S rRNA作為內參進行校正，通過Ct值來比較基因轉錄水平差異，最終通過計算2-ΔΔCt來獲得目的基因相對于對照菌株的轉錄水平[16]，數值>1為上調，<1則為下調。

2 結果與分析

在谷氨酸棒桿菌中，依賴黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和脂質的膜結合蛋白MQO[17]不僅能催化蘋果酸回補草酰乙酸，還能加快TCA循環的下游途徑，因此在本文中，構建了過表達mqo的重組菌，并分析重組菌中4-HIL產量的變化。

2.1 構建質粒pJYW-4-ido-mqo

以SN01基因組為模板，用引物mqo-F(5’-CAAGGATCCAGAAGGAGATATTGCATGTCAGATTC-C-C-CGAAG-3’)和mqo-R(5’-TATGTCGACTTAGGCTTCCTCAAGCTTCAGG-3’)PCR擴增基因片段BamHI-mqo-SalI，連接到質粒pJYW-4-ido上，獲得重組質粒pJYW-4-ido-mqo。質粒pJYW-4-ido-mqo的PCR驗證和酶切驗證結果見圖2。pJYW-4-ido-mqo全長9 260 bp。

圖2 質粒pJYW-4-ido-mqo的PCR驗證和酶切驗證圖Fig.2 Verification of plasmid pJYW-4-ido-mqo by PCR and restriction enzyme digestion

1號泳道是用引物mqo-F/mqo-R PCR驗證質粒的結果，擴增片段預計大小是1503 bp，實際驗證正確；2號泳道是用BamHI/SalI酶切質粒驗證，酶切后片段預計大小分別是1 524 bp和7 736 bp，實際驗證正確。驗證結果表明，質粒pJYW-4-ido-mqo構建成功。

再將質粒pJYW-4-ido-mqo電轉入SN01感受態細胞中，篩選出轉化子進行驗證，將驗證正確的重組菌命名為SN01/pJYW-4-ido-mqo(以下簡稱SZ05)。

2.2 過表達mqo對菌株生長狀況的影響

通過搖瓶發酵對mqo過表達菌株SZ05生長情況進行考察，圖3顯示搖瓶發酵過程中，菌株SN01/pJYW-4-ido(以下簡稱SZ01)和SZ05的OD562和殘糖變化。0 h～132 h，菌株SZ05的OD562低于菌株SZ01(圖3a)，在發酵末期144 h，SZ05的菌體濃度稍高于SZ01。0～12 h，2株菌的耗糖率相同(圖3b)，12 h后，菌株SZ05的殘糖量一直高于SZ01，到發酵結束，SZ01的糖耗盡，SZ05剩余14.50 g/L葡萄糖。由此可見mqo過表達影響菌株的生長狀況。據文獻報道，TCA循環減弱不利于菌株生長[18]，因此，菌株SZ05生長變慢可能是由于TCA循環碳流減弱所致。TCA循環碳流減弱原因會進一步分析。

圖3 SZ01和SZ05搖瓶發酵過程的菌濃(a)和殘糖(b)Fig.3 Biomass (a) and residual glucose (b) of SZ01 and SZ05 strains in shake flask cultivation

2.3 過表達mqo對菌株發酵氨基酸產量的影響

通過搖瓶發酵對菌株SZ05產4-HIL的能力進行考察，圖4顯示搖瓶發酵過程中，菌株SZ01和SZ05中氨基酸產量的變化。發酵前60 h，ido單表達菌SZ01快速積累4-HIL(圖4a)，60 h后4-HIL的積累速度變慢，Ile在36 h時積累量最高(圖4b)，隨后伴隨著4-HIL的不斷生成，Ile濃度逐漸降低。發酵全程中，ido-mqo共表達菌SZ05中4-HIL的產量逐漸升高，但產量一直低于SZ01，Ile的積累量也逐漸升高，沒有降低。發酵144 h后，SZ01積累(72.06±5.60)mmol/L的4-HIL，剩余(5.00±1.43)mmol/L的Ile，Ile到4-HIL的轉化率是94%；而SZ05合成(60.86±2.24)mmol/L的4-HIL，產量稍低于SZ01，但剩余(101.39±2.20)mmol/L的Ile，Ile到4-HIL的轉化率只有38%。發酵144 h后，SZ05中天冬氨酸族氨基酸總產量是(205.76±5.30)mmol/L(圖4c)，顯著高于SZ01中天冬氨酸族氨基酸總產量(115.58±8.11)mmol/L，且發酵液中L-谷氨酸(Glu)和L-蘇氨酸(Thr)含量明顯降低(圖4d)，L-丙氨酸(Ala)含量降低不明顯，L-甘氨酸(Gly)和L-賴氨酸(Lys)含量增加，但副產物總量降低。綜上說明，過表達mqo增加了天冬氨酸族氨基酸的產量，但降低了Ile向4-HIL的轉化率。

圖4 菌株SZ01和SZ05發酵氨基酸產量的差異Fig.4 Amino acids production of SZ01 and SZ05

有研究表明，在谷氨酸棒桿菌AHP-3中，敲除mqo后減少了TCA循環的代謝流，增加了草酰乙酸到Lys合成的碳流，提高了Lys的產量[19]。而在本研究中，過表達mqo的菌株出現生長速率下降和Lys積累量增加的現象，且天冬氨酸族氨基酸的產量顯著提高，猜測可能是由于更多的碳流流入天冬氨酸族氨基酸合成途徑，減弱了TCA循環，于是對SZ05中關鍵基因的轉錄水平進行了分析。

2.4 過表達mqo的菌株中關鍵基因轉錄水平變化

根據代謝途徑分析表明，過表達mqo回補的草酰乙酸可分別進入天冬氨酸族氨基酸合成途徑和TCA循環。針對菌株SZ05中天冬氨酸族氨基酸的產量顯著提高的結果，對菌株SZ01和SZ05代謝途徑中的關鍵基因(天冬氨酸激酶基因lysC、異檸檬酸裂解酶基因aceA、檸檬酸合酶基因gltA、琥珀酸脫氫酶基因sdhA、異檸檬酸脫氫酶基因icd、α-酮戊二酸脫氫酶基因odhA和ido)的轉錄水平進行了分析(圖5)。

圖5 菌株SZ01和SZ05中主要基因的轉錄水平分析結果Fig.5 The transcription level of target genes

與SZ01相比，SZ05中lysC、aceA、gltA和sdhA的轉錄水平明顯升高，icd的轉錄水平基本無變化，而odhA和ido的轉錄水平稍有降低。這說明過表達mqo有利于加強進入天冬氨酸族氨基酸合成途徑和TCA循環的碳流，但由于aceA和sdhA的轉錄水平顯著升高，使得進入TCA循環的碳流由異檸檬酸裂解酶分流，進入乙醛酸循環，很可能造成IDO酶促反應中底物α-KG供應不足，導致Ile到4-HIL的轉化率降低，從而導致Ile過剩。

研究表明，TCA循環和天冬氨酸族氨基酸合成途徑中碳流分布不均勻會影響菌株生長和產物產量，TCA循環減弱會導致菌株生長變慢[18]。因此，在菌株SZ05中，由于基因lysC和aceA的轉錄水平明顯提高，使得天冬氨酸族氨基酸合成途徑中的碳流增加，TCA循環碳流減少，從而導致菌株SZ05生長變慢。

2.5 過表達mqo后α-KG含量和胞內氨基酸含量的變化

針對過表達mqo后Ile到4-HIL的轉化率低和Ile過剩的問題，進一步測定了胞內外的α-KG含量。在菌株SZ05中，發酵48 h胞內α-KG的含量(0.61 mmol/L)低于SZ01胞內α-KG含量(1.13 mmol/L)(圖6a)，發酵液中α-KG含量(0.81 mmol/L)也明顯低于菌株SZ01發酵液中α-KG含量(3.67 mmol/L)，由此說明，過表達mqo導致底物α-KG供應量降低。

另外，IDO酶促反應會受到過量底物Ile的抑制作用[12, 20]，當Ile濃度在0～10 mmol/L時，IDO的酶活隨底物的增加而提高，當Ile高于20 mmol/L時，IDO的活性受到抑制。IDO是一種胞內蛋白，在胞內起催化反應，胞內Ile的過多積累會抑制IDO酶活。為此進一步測定了60、84和108 h的胞內Ile含量(圖6b)，菌株SZ05中胞內Ile含量(108.13～125.34 mmol/L)顯著高于菌株SZ01中Ile含量(49.12～11.25 mmol/L)，且隨著發酵的進行，SZ01中Ile的積累量是降低的，而SZ05的積累量一直在升高，并顯著高于20 mmol/L。所以Ile過多過快的積累也影響了SZ05中IDO的活性，從而降低了Ile到4-HIL的轉化率。

圖6 菌株SZ01和SZ05中α-KG含量和胞內氨基酸含量的測定結果Fig.6 (a) Intracellular (I) and extracellular (E) concentrations of α-KG at 48 h, (b) intracellular concentrations of 4-HIL and Ile at 60 h, 84 h and 108 h

2.6 添加α-KG對4-HIL產量的影響

由于SZ05中α-KG的供應量明顯不足，導致Ile過剩。因此，進一步研究了添加不同濃度的α-KG對合成4-HIL的影響(圖7)。添加20、30和40 mmol/L的α-KG后，菌株SZ05在發酵144 h后，Ile到4-HIL的轉化率分別提高到70%、81%和75%，4-HIL的產量均比不添加α-KG時高，當添加40 mmol/L的α-KG時，4-HIL的產量提高到(77.7±10.91)mmol/L。因此，在菌株SZ05發酵中添加α-KG有利于提高4-HIL的產量，提高Ile到4-HIL的轉化率。

圖7 α-KG的添加濃度對4-HIL產量的影響Fig.7 Effects of addition of α-KG on 4-HIL production

3 結論

過表達mqo后，過多積累了Ile和天冬氨酸族氨基酸的含量，不利于Ile向4-HIL的轉化，降低了4-HIL的產量。通過對mqo過表達菌株的代謝途徑中部分關鍵基因的RT-PCR分析表明，進入TCA循環的碳流由異檸檬酸裂解酶分流，進入乙醛酸循環，導致IDO酶促反應中另一底物α-KG供應不足和菌株生長變慢，出現Ile過剩的結果。另外，胞內Ile的過多過快的積累也會影響mqo過表達菌株中IDO的活性，從而降低了Ile到4-HIL的轉化率。隨后，通過外源添加α-KG提高了重組菌中4-HIL的產量。在后期的研究中可以通過代謝工程改造敲除異檸檬酸裂解酶編碼基因aceA加強TCA循環提高α-KG的供應，進一步提高4-HIL的產量。本研究為4-HIL的工業化生產提供了重要依據。

[1] World Health Organization. Global report on diabetes[R].Switzerland:Geneva,2016.

[2] NEELAKANTAN N,NARAYANAN M,DE Souza R J,et al.Effect of Fenugreek (Trigonellafoenum-graecumL.) intake on glycemia:a meta-analysis of clinical trials[J].Nutrition Journal,2014,13(1)：7.

[3] GADDAM A,GALLA C,THUMMISETTI S,et al.Role of fenugreek in the prevention of type 2 diabetes mellitus in prediabetes[J].Journal of Diabetes and Mmetabolic Ddisorders,2015,14(1)：74.

[4] FOWDEN L,PRATT H M,SMITH A.4-Hydroxyisoleucine from seed ofTrigonellafoenum-graecum[J].Phytochemistry,1973,12(7):1 707-1 711.

[5] JETTE L,HARVEV L,EUGENI K,et al.4-Hydroxyisoleucine: a plant-derived treatment for metabolic syndrome[J].Current Opinion in Investigational Drugs,2009,10(4):353-358.

[6] KODERA T,SMIRNOV S V,SAMSONOVA N N,et al.A novelL-isoleucine hydroxylating enzyme,L-isoleucine dioxygenase fromBacillusthuringiensis,produces (2S,3R,4S)-4-hydroxyisoleucine[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2009,390(3):506-510.

[7] HIBI M,KAWASHIMA T,KODERA T,et al.Characterization ofBacillusthuringiensisL-isoleucine dioxygenase for production of useful amino acids[J].Applied and Environmental Microbiology,2011,77(19):6 926-6 930.

[8] OGAWA J,KODERA T,SMIRNOV S V,et al.A novelL-isoleucine metabolism inBacillusthuringiensisgenerating (2S,3R,4S)-4-hydroxyisoleucine,a potential insulinotropic and anti-obesity amino acid[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2011,89(6):1 929-1 938.

[9] SMIRNOV S V,KODERA T,SAMSONOVA N N,et al.Metabolic engineering ofEscherichiacolito produce (2S,3R,4S)-4-hydroxyisoleucine[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2010,88(3):719-726.

[10] SHI F,NIU T,FANG H.4-Hydroxyisoleucine production of recombinantCorynebacteriumglutamicumssp.lactofermentumunder optimal corn steep liquor limitation[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2015,99(9):3 851-3 863.

[11] SHI F,FANG H,NIU T,et al.Overexpression ofppcandlysCto improve the production of 4-hydroxyisoleucine and its precursorL-isoleucine in recombinantCorynebacteriumglutamicumssp.lactofermentum[J].Enzyme and Microbial Technology,2016,87-88:79-85.

[12] 方惠敏.表達ido的重組谷氨酸棒桿菌代謝途徑改造以提高4-羥基異亮氨酸的產量[D].無錫:江南大學,2016.

[13] SHI F,LI K,HUAN X,et al.Expression of NAD(H) kinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase improve NADPH supply andL-isoleucine biosynthesis inCorynebacteriumglutamicumssp. lactofermentum[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2013,171(2):504-521.

[14] KENNERKNECHT N,SAHM H,YEN M R,et al.Export ofL-isoleucine fromCorynebacteriumglutamicum: a two-gene-encoded member of a new translocator family[J].Journal of Bacteriology,2002,184(14):3 947-3 956.

[15] 牛騰飛.異亮氨酸雙加氧酶的酶學性質及重組谷氨酸棒桿菌合成4-羥基異亮氨酸的研究[D].無錫:江南大學,2015.

[16] LIVAK K J,SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod[J].Methods,2012,25(4):402-408.

[17] MOLENAAR D,van der Rest M E,DRYSCH A,et al.Functions of the membrane-associated and cytoplasmic malate dehydrogenases in the citric acid cycle ofCorynebacteriumglutamicum[J].Journal of Bacteriology,2000,182(24):6 884-6 891.

[18] KOFFAS M A G,JUNG G Y,STEPHANOPOULOS G. Engineering metabolism and product formation inCorynebacteriumglutamicumby coordinated gene overexpression[J].Metabolic Engineering,2003,5(1):32-41.

[19] MITSUHASHI S,HAYASHI M,OHNISHI J,et al.Disruption of malate:quinone oxidoreductase increasesL-lysine production byCorynebacteriumglutamicum[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry,2006,70(11):2 803-2 806.

[20] 付敏杰,聶堯,穆曉清,等.新型異亮氨酸雙加氧酶及其重組大腸桿菌合成羥基異亮氨酸[J].化工進展,2014(11):3 037-3 044.

EffectsofmqooverexpressiononthesynthesisofL-isoleucineand4-hydroxyisoleucineinrecombinantCorynebacteriumglutamicum

LU Zheng-ke1,SHI Feng1,2*

1(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology,Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

4-hydroxyisoleucine (4-HIL), which can exhibit unique insulinotropic and insulin-sensitizing activities, has potential medical value in treating diabetes. AnL-isoleucine (Ile)-producer,Corynebacteriumglutamicumssp.lactofermentumSN01 can synthesize 4-HIL whenidogene. In order to promote the supply of oxaloacetate and synthesis of 4-HIL,mqowas overexpressed in this recombinant strain. After 144 h of fermentation, 4-HIL production of ido-mqo-expressing strain was (60.86±2.24) mmol/L, lower than that ofido-expressing strain (72.06±5.60) mmol/L. However, its Ile concentration was (101.39±2.20) mmol/L, significantly higher than that ofido-expressing strain (5.00±1.43) mmol/L. The RT-PCR analysis of some key genes in the metabolic pathway ofido-mqo-expressing strain showed that the carbon flow entering the TCA cycle was diverted by the isocitrate lyase to the glyoxylic acid cycle, resulting in the insufficient supply of another substrate for 4-HIL synthesis, i.e. α-ketoglutarate (α-KG) and excessive Ile concentration. Therefore, α-KG was added. When 40 mmol/L of α-KG was added, the yield of 4-HIL increased to (77.7±10.91) mmol/L and the conversion ratio of Ile to 4-HIL increased to 75%. Therefore, overexpression ofmqocan promote Ile synthesis, and addition of α-KG can promote the conversion of Ile to 4-HIL, thereby increasing the yield of 4-HIL.

4-hydroxyisoleucine;Corynebacteriumglutamicumssp.lactofermentumSN01;L-isoleucine;mqo;α-ketoglutarate

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014845

碩士研究生(史鋒副教授為通訊作者,E-mail: shifeng@jiangnan.edu.cn)。

江南大學食品科學與技術國家重點實驗室自由探索資助課題(編號SKLF-ZZB-201405)

2017-05-28，改回日期：2017-06-25