牛奶、嬰兒配方奶粉中硒元素的形態研究進展

劉夢霞，于景華

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

0 引言

硒在自然界中通常以有機形式和無機形式存在[1]。各種硒化合物的不同的生理、生物活性，及其遷移轉化規律，不僅取決于硒的總質量分數水平，而且同硒存在的化學形態以及不同化學形態下硒化物的濃度水平直接相關[2]。有研究表明硒的有機形式吸收率可達85%～95%，而無機形式吸收率僅為40%～50%左右[3]。動物體中的硒主要與蛋白質結合，硒在人體內發揮生理作用主要是通過硒蛋白來實現的[4]。硒是目前公認的人體必需微量元素之一[5]。它是人體多種蛋白質的重要組分，還有提高人體免疫力，抗氧化、對抗自由基，預防癌癥等多種功效[6]。

研究牛奶和嬰兒配方奶粉中的硒元素對嬰兒健康有重要意義。本文對現有的牛奶、嬰兒配方奶粉中硒元素形態的研究進行總結、比較，旨為嬰兒配方奶粉中硒元素形態研究提供指導。

1 牛奶蛋白中的硒

在牛奶中，大于95%的硒與蛋白質相連。對脫脂乳進行超速離心，分離得到酪蛋白和乳清蛋白，通過離子交換色譜和凝膠色譜分別分離酪蛋白和乳清蛋白中的蛋白質，氫化物原子吸收光譜法測定分離所得各種蛋白質中硒元素的質量分數，得到牛奶蛋白中的硒元素分布情況如表1所示[7]。從表中可以看出大于70%硒存在于酪蛋白中。單位質量κ-酪蛋白含硒量最多，但由于奶中κ-酪蛋白質量分數低，所以該蛋白中的硒質量分數僅占脫脂乳硒質量分數的17%，而β-酪蛋白中硒的質量分數占脫脂乳硒質量分數的33%，比例最大，αs-酪蛋白、β-乳球蛋白中硒質量分數分別占脫脂乳硒質量分數17%，6%～8%，其他蛋白中硒質量分數占脫脂乳硒質量分數的3.5%。Bierla[9]等人在研究硒元素在牛奶蛋白中的存在形式時，也表明大部分硒元素存在于酪蛋白中；而硒元素與乳清蛋白結合，可能是通過硒代甲硫氨酸殘基取代β-乳球蛋白、α-乳白蛋白中的甲硫氨酸殘基，形成新的含硒蛋白質。T IEN HOAC[8]也證實硒元素在牛奶乳清蛋白中主要與β-乳球蛋白、α-乳白蛋白結合。

表1 牛奶中硒元素的分布情況[7]

2 奶中硒元素形態的測定

硒元素在牛奶和嬰兒配方奶粉中通常以硒化合物（如硒-蛋白質、硒-多肽）的形式存在，這類乳制品中復雜的成分會對硒化合物的提取造成干擾，降低硒化合物的提取效果，進而影響其測定準確性。因而許多學者針對提取及測定硒化合物的方法進行改進優化，提高硒元素在乳制品中的測定準確性。例如學者林立[10]改進的酸處理法能夠提高硒元素的形態穩定性。下面對這些方法的優缺點進行論述。

2.1 樣品處理方法

2.1.1 酸法處理

林立[10]等人在測定奶粉中硒形態時，對樣品進行乙酸沉淀蛋白、流動相（三氟乙酸、檸檬酸、乙醇）提取，通過加標回收試驗驗證，發現采用該方法提取時，硒元素的各形態之間未發生相互轉化。而且在后續ICP-M S方法測定過程中能夠減小基質效應的影響，增強檢測的靈敏度、準確性和穩定性。但在測定得出結果后發現該提取方法對奶粉中硒代胱氨酸的提取效率低，一方面由于硒代胱氨酸易與奶粉中的蛋白質吸附共沉淀，另外硒代胱氨酸中的Se-Se化學鍵不穩定，容易斷裂與蛋白結合，因此采用合適的離子對試劑并采用溫和的提取方式，可以有效地絡合硒代胱氨酸，避免破壞硒代胱氨酸的穩定性，從而提高硒代胱氨酸的提取率。

2.1.2 酶解法

通過酶解的方法可以使牛奶、嬰兒配方奶粉中的含硒蛋白質、多肽分解，從而得到含硒氨基酸，再對其進行質量分數測定。而且酶解的條件溫和，大多數為37℃，pH 7.0，不易引起乳制品中硒元素形態之間發生轉變。通常使用蛋白酶和脂肪酶處理，提取過程中需要控制酶解溫度、時間及光照情況，以防止有機硒轉化為無機硒，影響測定結果[11-13]。但此方法時間略長，通常在10 h以上，在后續提取過程中可改進方法如超聲輔助酶解等以提高效率。

2.1.3 有機溶劑提取法

有學者用蛋白沉淀法即乙腈提取牛奶中的游離硒蛋氨酸，可以直接提取出純的硒蛋氨酸，避免了分離硒化合物的繁瑣步驟，同時減少了對硒蛋氨酸形態的影響，在后面使用UPLC-M S/M S方法測定硒蛋氨酸質量分數時可以得到較好的精確度、精密度[14]。但該方法僅對游離硒蛋氨酸提取效率高，有其他硒元素形態相互轉化的風險。

2.1.4 微波消解法

微波消解法能同時加熱所有的樣品溶液而不加熱容器，微波加熱時，溶液能很快達到沸點，同時微波能引起酸與樣品之間較大的熱對流，攪動并清除已消解的不活潑樣品的表層，促進酸與樣品更有效地接觸。在加壓的條件下，酸的氧化及活性增加，使粒徑大的樣品也能在短時間內被消化。其次，微波消解是在密閉的容器中進行的，待測元素的損失較少，回收率較高，因微波消化過程中酸的消耗少，減少了由于酸而帶入的污染，從而提高了測定結果的準確性。常用的酸為硝酸[15-16]。

2.2 硒化物分離及形態測定方法

2.2.1 離子色譜－電感耦合等離子體質譜法

有國內學者采用離子色譜－電感耦合等離子體質譜法（IC-ICP-MS）檢測嬰兒配方奶粉中硒的形態，通過優化提取方法和色譜條件，能夠實現硒酸鹽、亞硒酸鹽、硒代蛋氨酸和硒代胱氨酸的定性定量分析，方法的檢出限在0.03～0.10μg/L之間。加標回收率在25.0%～105%之間，測定值的相對標準偏差（n=6）在1.8%～7.8%之間。測定6種奶粉檢測出硒酸鹽、亞硒酸鹽，均未發現硒代蛋氨酸[10]。分析可能是奶粉中硒代蛋氨酸質量濃度低于該檢出限，可以嘗試將蛋白溶液進行低溫濃縮，使硒代蛋氨酸質量濃度升高，然后重新進行檢測。若仍未發現硒代蛋氨酸，則可推斷該嬰兒配方奶粉中可能不存在硒代蛋氨酸。ICP-MS具有很高的靈敏度、準確度，并且它與色譜的接口容易實現，色譜分離柱與ICP-MS的霧化器直接相連即可。由于上述的眾多優勢，電感耦合等離子體-質譜已經成為元素形態分析的重要工具。

2.2.2 液相色譜-氫化物發生原子熒光光譜法

原子熒光光譜靈敏度高，選擇性好，適用于氫化物發生元素的測定。在線性范圍以及光譜干擾等方面均比原子吸收光譜優越。同時，原子熒光光譜儀器設備購買和運行的費用低，一般的實驗室就可以配備。

O scar[11]等人通過液相色譜-紫外-氫化物發生-原子熒光光譜法聯用技術分析喂養不同硒化物飼料的奶牛產出的牛奶中硒的形態。使用反向色譜C 18柱，流動相選用氯化四乙胺，優化預還原條件即使用紫外照射和電熱板來提高不同硒化物轉化效率。最后測得硒代胱氨酸、Se（IV），硒代蛋氨酸、Se（VI）檢出限分別為0.4，0.5，0.9，1.0μg/L。在喂養含硒酵母飼料的奶牛產出的牛奶檢測出亞硒酸鹽、硒代胱氨酸和少量硒代蛋氨酸；在喂養無機硒飼料的奶牛產出的牛奶中僅檢測到硒代胱氨酸和亞硒酸鹽。表明奶牛攝入硒的形態對牛奶中硒元素的形態有影響。該方法可用于測定牛奶中硒的形態，快速方便且重復性高，檢出限低，可用于常規牛乳質量檢測。

Pilar Vinas[12]等運用液相色譜-氫化物發生原子熒光光譜法的聯用技術分析嬰幼兒配方奶粉中硒的形態：亞硒酸鹽、硒酸鹽、硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸，檢出限分別為0.4，1.7，0.35，0.54μg/L。該方法使反相C 18色譜柱和離子交換柱串聯連接，流動相為水、磷酸鹽緩沖液。用標準物質即已知硒元素含量和種類的全脂奶粉樣品驗證該方法可靠性，證實該方法可以用于奶粉中硒元素形態的測定。用本方法檢測6種嬰兒配方奶粉，結果顯示僅含亞硒酸鹽。

2.2.3 超高效液相色譜-串聯質譜法

UPLC-MS/MS法具有特異性好、靈敏度高、分析速度快和準確可靠的優點，適用于牛奶中游離硒代蛋氨酸（SeMet）的定量測定。何夢潔[14]等人建立超高效液相色譜-串聯質譜法測定硒SeMet的方法，使用C 18色譜柱，以水∶乙腈∶甲酸（95∶5∶0.1，體積比）為流動相。結果SeMet線性范圍為0.5～100 ng/mL，SeMet批內準確度在97.6%～100.6%，批間準確度在97.7%～99.2%，批內精密度在0.53%～4.49%，批間精密度在1.03%～4.54%。用于測定牛奶中游離SeMet，牛奶中游離SeMet質量濃度為0.74 ng/mL。

2.2.4 石墨爐原子吸收法

Tuzen等[16]用超聲輔助離子液相分散液液微萃取-石墨爐原子吸收法測定飲料中硒酸鹽、亞硒酸鹽的含量，并測定出牛奶、水果、酒類等食物中硒元素的總量。黃高明[15]采用超聲波破碎，離心、透析的方法將有機硒與無機硒分開，微波消解法進行樣品消化，利用石墨爐原子吸收法對富硒酸奶中有機硒的質量濃度進行測定。該方法檢出限為2.5μg/L，精密度為3.24%～8.27%（RSD），加標回收率為98.5%～101.3%，這些方法都可以借鑒到嬰兒配方奶粉的硒元素的測定中。

3 不同分子量乳清蛋白中的分布情況

Bermejo[17]采用SEC-HPLC-HG-ETAAS聯用技術測定了硒元素在牛奶乳清中的分布情況。為克服硒元素在牛奶乳清各蛋白中濃度低的問題，優化富集硒元素的條件，首先離心分離牛奶不同成分即脂肪、乳清、酪蛋白，收集乳清部分并進行超濾濃縮，濃縮物進入SEC色譜分離，UV檢測蛋白質。超濾濃縮蛋白部分，消化并收集硒氫化物，在銥涂層石墨管中預富集硒氫化物。ETAAS Zeeman背景校正法測定硒元素的含量。實驗中測定了6種牛乳基嬰兒配方奶粉，結果表明硒元素主要存在于分子量為40 ku，大于160 ku，小于10 ku部分，其中分子量小于10 ku部分硒含量最高。與Rafael等人[18]的研究結果一致：試驗的絕大多數嬰兒配方奶粉樣品中，硒元素分布在低分子質量蛋白部分。與前文測定牛奶中硒元素分布情況對比，可以發現牛奶與嬰兒配方奶粉中硒元素分布不同。說明在嬰兒配方奶粉原料調配及生產過程中硒元素形態含量都發生了變化，而研究這些具體的變化對嬰兒營養健康狀況意義重大。

4 加工過程對硒元素的影響

目前國內外對嬰兒配方奶粉生產過程中硒元素形態變化研究較少。L.H.Foster等人[19]在1998年研究了巴氏殺菌和噴霧干燥對液態奶、強化硒酸鈉、亞硒酸鈉液態奶中硒含量的影響。通過分別配制標準液態奶、強化硒酸鈉、亞硒酸鈉液態奶，進行巴氏殺菌、噴霧干燥工藝的對照處理，用氫化物原子吸收分光光度計法測定硒含量得出結論：巴氏殺菌使液態奶、強化硒酸鈉液態奶、強化亞硒酸鈉液態奶中硒含量含量分別減少了7.9%，6.2%，7.0%。噴霧干燥使液態奶、強化硒酸鈉液態奶、強化亞硒酸鈉液態奶中硒含量分別減少了44.8%，11.4%，10.0%。巴氏殺菌、噴霧干燥之后液態奶、強化硒酸鈉液態奶、強化亞硒酸鈉液態奶中硒含量含量分別減少了49.2%，17.6%，15.6%。分析硒含量減少的原因可能為加熱過程中熱空氣和粉末顆粒之間的溫差導致液態奶中固有的硒減少；存在于乳清中的谷胱甘肽過氧化物酶中加熱過程中被破壞導致硒元素在噴霧干燥過程中揮發。

莫海珍在2007年研究甘藍及毛豆儲存及加工過程中硒元素形態的變化。試驗中甘藍的含硒組分以甲基硒半胱氨酸為主，其次為硒蛋氨酸，另外含有痕量的硒胱氨酸，在毛豆中硒主要以硒蛋氨酸的形式存在，而硒甲基硒半胱氨酸的含量很少。冷藏會導致硒的含量隨著時間的延長而減低，采用真空烘干、熱風烘干和噴霧干燥對于甘藍和毛豆進行脫水，其中冷凍干燥對于有機硒的保存率最高，硒蛋氨酸是熱不穩定成分，在噴霧干燥過程中損失最大。說明加熱、噴霧干燥等加工過程會對硒元素的形態變化產生影響。

總結上述研究結果，學者林立[10]、Pilar Vinas[12]僅在奶粉中發現硒元素的無機形態，而研究牛奶中硒元素形態時，O scar[11]、何夢潔[14]等都檢測出了硒元素的無機形態和有機形態?？梢酝萍拔匦螒B在嬰兒配方奶粉的加工過程中發生了變化，但具體發生了哪些變化和變化的機理還有待研究。

5 展望

對于不能被母乳喂養的嬰兒來說，嬰兒配方奶粉是嬰兒的主要營養來源，營養元素的形態關乎其吸收狀況和嬰兒的成長。目前來看，由于現行的主流方法都依賴于特定形態的標準硒化物，而現有的標準品只有僅限的幾種，并不能滿足全面分析乳制品中硒元素形態的要求，所以導致對牛奶、嬰兒配方奶粉中硒元素形態認知不全面，能確定的形態僅有硒酸鹽、亞硒酸鹽、硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸；而且在奶粉加工過程中的硒元素的含量、形態變化研究甚少。另外，由于硒元素在牛奶、奶粉中含量非常少，而且多與蛋白相連，硒化合物提取過程中極易被破壞，所以需要不斷探索出靈敏度高、精確度高的測定方法，預測多維分離手段結合及多項分析技術聯合將成為未來發展趨勢。

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