利用重組嗜熱棲熱菌尿苷-胞苷激酶生產尿苷酸

范曉光，賈子樊，李國梁，韓洪軍，高立棟，張順棠，李燕軍，陳寧*

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457) 2(蓮花健康產業集團股份有限公司, 博士后科研工作站，河南 項城，466200)

尿苷酸是一種重要的核苷酸產品，可作為食品添加劑、藥品以及藥物前體應用于不同領域[1]。作為母乳中含量第二大的核苷酸，它是嬰幼兒食品中常用的添加劑[2-3]；能參與肝臟解毒物質葡萄糖醛酸苷的合成[4]，也可作為膜磷脂的前體提高腦部胞苷二磷酸膽堿和乙酰膽堿水平[5-6]；以其為前體的碘苷也已廣泛應用于臨床[7]。

現有的尿苷酸的生產方法主要包括化學合成法和核糖核酸(Ribonucleic Acid,RNA)降解法?；瘜W法是將尿苷溶解于酸性溶液中，將2,3位的羥基保護后再使用有毒的POCl3試劑作為磷酸化試劑合成尿苷酸[8-9]，整個過程收率較高但是生產安全性差，容易造成污染。RNA降解法是使用5′-磷酸二酯酶降解來自于酵母細胞的RNA[10-11]，整個過程相對環保但是產品分離困難，細胞裂解物難于處理。

鑒于現有尿苷酸生產方法的不足，使用生物法制備尿苷酸已經成為目前研究的關注點。WANG等使用產氨短桿菌(CorynebacteriumammoniagenesATCC6872)以乳清酸為底物通過兩步法轉化生產尿苷酸[12]。YANG等使用重組釀酒酵母(SaccharomycescerevisiaepYX212-URA5/BJX12)全細胞催化乳清酸生產尿苷酸[13]。但上述方法均存在生產周期較長，生產工藝繁瑣等問題。QIAN等使用來自大腸桿菌(EscherichiacoliK12)的尿苷-胞苷激酶(Uridine/cytidine kinase, UCK)以尿苷為底物生成尿苷酸。該方法轉化周期較短，尿苷酸收率較高，但是催化過程中需要以鳥苷三磷酸(Guanosine 5′-triphosphate, GTP)作為磷酸供體，生產成本較高[14]。

為了獲得適用于工業化生產的尿苷酸制備方法，本研究嘗試使用大腸桿菌(EscherichiacoliBL21(DE3))分別克隆表達來源于嗜熱棲熱菌(ThermusthermophilusHB8)[15]以及枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis168)的尿苷-胞苷激酶。對獲得的重組尿苷-胞苷激酶的磷酸供體偏好性以及酶學性質進行考察。最后對酶催化反應條件進行優化，提高尿苷酸的產量。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質粒

大腸桿菌E.coliDH5α、大腸桿菌E.coliBL21(DE3)以及質粒pET-His(Ampr)均由本實驗室保藏。

1.1.2 培養基

LB(Luria-Bertani)培養基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

斜面培養基：葡萄糖1 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 5 g/L，牛肉膏10 g/L，瓊脂25 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20min。

發酵培養基：葡萄糖3 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L， VH 1 mg/L，pH 6.5～7.2，葡萄糖115 ℃滅菌15 min，其他成分121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑

限制性內切酶、T4DNA連接酶、ExTaq DNA聚合酶均購自寶生物工程(大連)有限公司；PCR產物回收及質粒提取試劑盒購自北京博大泰克生物基因有限責任公司；尿苷標品、尿苷酸標品、腺苷三磷酸二鈉、鳥苷三磷酸二鈉購于美國Sigma公司，其他試劑均為國產分析純。

1.2 質粒pETHis-ttCK和pETHis-uck的構建

根據Genbank上T.thermophilusHB8的尿苷-胞苷激酶UCK同系物ttCK序列編碼基因序列，在其氨基酸序列第93上設計點突變，使酪氨酸殘基突變為組氨酸殘基，并用大腸桿菌中常見的密碼子優化手段對其進行密碼子優化，使其可在大腸桿菌中高效表達，將優化后的序列送至金唯智公司進行合成，得到帶有尿苷-胞苷激酶ttCK編碼基因的重組質粒pUC57-ttCKY93H。

根據Genbank上B.subtilis168的尿苷-胞苷激酶序列編碼基因，設計帶有酶切位點BamHⅠ 和EcoRⅠ的引物。以B.subtilis168基因組為模板，利用引物(上游引物：5′CGCGGATCCATGGGTAAGAATCCAGTAGTCATTG3′和下游引物5′CCGGAATTC TGCTATGGTATTACAAAATCGCG3′)及Ex-TaqPCR試劑盒擴增得到尿苷-胞苷激酶編碼基因uck。

PCR條件為95 ℃ 5 min 一個循環；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s 30個循環；72 ℃ 10 min 一個循環。反應體系為50 μL，PCR產物經質量分數為1.5%瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收。

目的產物回收后經BamHⅠ 和EcoRⅠ 酶切、電泳及切膠回收后連接至經相同酶切的表達載體pET-His，并化轉至E.coliDH5α感受態細胞中。Super optimal broth with catabolite repression(SOC)中活化后涂布于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB固體培養基上。37 ℃過夜培養后，挑取單菌落利用引物進行PCR驗證，陽性菌株接入含有氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB液體培養基中，經37 ℃振蕩培養12 h后提取質粒進行酶切驗證，獲得正確的重組質粒。

1.3 E.coliBL21-ttCKY93H和E.coliBL21-uck的構建

分別取適宜濃度的質粒pETHis-ttCKY93H和pETHis-uck化轉至E.coliBL21(DE3)感受態細胞中，在SOC中活化后涂布于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB固體培養基上，37 ℃倒置培養12 h。挑取單菌落利用引物進行PCR驗證，陽性菌株接入含有氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB液體培養基中，經37 ℃振蕩培養12 h后保存至甘油管中備用并提取質粒進行酶切驗證，獲得正確的重組菌株。

1.4 重組菌培養

將E.coliBL21-ttCKY93H及E.coliBL21-uck以1%(體積分數)接種量接種至5 mL含有氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB液體培養基搖管中，37 ℃，200 r/min活化培養12 h，以1%(體積分數)接種量接種至30 mL含有氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB液體培養基中，37 ℃，200 r/min培養12 h，再按1%(體積分數)接種量轉接至100 mL含有氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB液體培養基中，37 ℃，200 r/min培養至OD600=0.6～0.8時，添加終濃度為0.1 mmol/L的誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達目的蛋白，37 ℃條件下，200 r/min搖床誘導10 h。

1.5 重組菌擴大培養

將E.coliBL21-ttCKY93H接種至斜面培養基，37 ℃活化培養12 h，再將斜面中的菌全部接種至含有斜面培養基的茄形瓶中，在37 ℃傳代培養12 h，再將茄形瓶中的菌全部接種至含有3 L發酵培養基的5 L發酵罐中。發酵條件為37 ℃，pH 7.0，溶氧25%～35%(溶氧0%定義為添加了少量硫酸銅的飽和亞硫酸鈉溶液中的溶氧，溶氧100%定義為靜止空氣中的溶氧)，進行重組菌擴大培養。培養4 h后流加6 g/L乳糖，并將溫度調低至32 ℃，誘導培養至12 h。

1.6 粗酶液制備

用離心管收集培養后的菌液，4 ℃，5 000 r/min，離心10 min，棄掉上清液，收集菌體細胞。將細胞沉淀于5 mL PBS緩沖液(10 mmol/L，pH 8.3)中，利用移液槍反復吹吸，使菌體細胞重新懸浮。-80 ℃凍融進行細胞破碎，待溶化后進行高速離心1 h去除不溶性碎屑，取得上清液，此時得到的上清液即為粗酶液，用來作為研究催化反應的酶源。

1.7 酶催化反應體系建立

(1)反應體系配制：10 mmol/L尿苷，10 mmol/L Mg2+，10 mmol/L GTP或者ATP，不同pH值的PBS緩沖液，適量粗酶液。

(2)酶活力單位定義：在標準酶活測定條件下，1 min催化底物尿苷生成1 μmol/L尿苷酸所需的粗酶液量定義為一個酶活力單位，即1 U。

(3) 5 L罐反應體系： 10 mmol/L尿苷，10 mmol/L Mg2+，pH 7.5的PBS緩沖液，適量粗酶液，反應過程中連續流加1 mmol/L ATP(ATP終濃度10 mmol/L)。

1.8 底物及產物分析方法

對于底物尿苷和產物尿苷酸，使用高效液相色譜(Agilent 1200)進行分析。檢測條件：紫外檢測器(270 nm)，色譜柱為Hypersil SAX(5 m，4.6 mm×250 mm)，洗脫液流動相為50 mmol/L NH4H2PO3(pH 4.5)，流速為1 mL/min。

2 結果與討論

2.1 重組質粒pETHis-ttCKY93H和pETHis-uck的構建

首先根據Genbank上T.thermophilusHB8的尿苷-胞苷激酶編碼基因序列，利用大腸桿菌密碼子偏好性對其進行密碼子優化，合成得到目的基因ttCK。根據TOMOIKE等人的報道[15]，將T.thermophilusHB8的尿苷-胞苷激酶氨基酸序列中93位的酪氨酸殘基突變為組氨酸殘基，可以顯著增加該酶對于尿苷的親和力。因此在合成設計時引入Y93H突變位點。其次根據B.subtilis168的尿苷-胞苷激酶編碼基因序列，設計引物從B.subtilis168基因組上擴增得到目的基因uck。將上述目的基因分別連接到pET-His表達載體上，利用BamHⅠ 和EcoRⅠ進行雙酶切驗證，結果如圖1所示，經BamHⅠ 和EcoRⅠ雙酶切可以獲得分子量約為2 900 bp及600 bp的片段，與pET-His和目的基因片段的分子量一致，證明上述目的基因已成功連接到表達載體上。

M-1 kb DNA marker; 1-ttCK片段; 2-pET-His片段;3-重組質粒單酶切(BamH I);4-重組質粒雙酶切(BamH I/EcoRI)圖1 單雙酶切驗證pETHis-ttCKY93H(a)和pETHis-uck(b)Fig.1 Identification of recombinant plasmids of pETHis-ttCKY93H (a) and pETHis-uck digestion by restricted endonuclease (b)

2.2 不同來源的重組尿苷-胞苷激酶的表達與鑒定

將重組菌株E.coliBL21-ttCKY93H及E.coliBL21-uck分別接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養基中進行培養，使用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達目的蛋白后，離心收集菌體，超聲破壁后得到粗酶液。對破壁之后的樣品進行SDS-PAGE蛋白電泳分析，結果如圖2所示。重組菌株E.coliBL21-ttCKY93H(泳道3)和E.coliBL21-uck(泳道6)超聲破壁后上清液中均在23 ku處出現明顯的蛋白條帶，與目的蛋白的分子量一致，說明兩種不同來源的重組尿苷-胞苷激酶均實現了可溶性表達。由圖2還可以看出，2株重組菌株超聲破壁后沉淀中也出現目的蛋白條帶(泳道2和5)，說明有一些重組酶以包涵體的形式表達。

M-蛋白marker; 1-3代表E.coli BL21-ttCKY93H;4-5代表E.coli BL21-uck;3,6代表菌體超聲破壁后上清液;2,5代表菌體超聲破壁后沉淀圖2 重組大腸桿菌目的蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant proteins in E.coli BL21

2.3 不同來源的重組尿苷-胞苷激酶催化特性研究

尿苷-胞苷激酶催化的尿苷向尿苷酸轉化過程需要NTP作為磷酸供體。然而，研究表明很多尿苷-胞苷激酶在胞外催化實驗時均需要以GTP作為磷酸供體，例如來自于大腸桿菌、保加利亞乳桿菌的尿苷-胞苷激酶[14]。因此，在本實驗中分別選擇了GTP以及ATP作為磷酸供體，考察不同來源的重組尿苷-胞苷激酶的催化能力，結果如圖3所示。來源于T.thermophilusHB8的尿苷-胞苷激酶能以GTP或者ATP作為磷酸供體催化尿苷生成尿苷酸，以GTP為磷酸供體時的尿苷酸最高得率為93.6%，以ATP為磷酸供體時的尿苷酸最高得率為87.8%。相比之下，來源于B.subtilis168的尿苷-胞苷激酶只有以GTP作為磷酸供體時的催化效果較好，尿苷酸最高得率達到91.5%。與GTP相比，ATP是更為廉價的磷酸供體，而且其可以通過多聚磷酸化酶、乙酸激酶等催化的反應進行循環再生[16]。因此，以ATP作為磷酸供體的尿苷-胞苷激酶的發現對于降低酶法合成尿苷酸的生產成本，實現工業規模應用具有重要的意義。

a-來源于嗜熱棲熱菌的尿苷-胞苷激酶；b-來源于枯草芽孢桿菌的尿苷-胞苷激酶圖3 磷酸供體對于不同重組尿苷-胞苷激酶的催化效果影響Fig.3 Effect of phosphate donor on the catalyzation of different recombinant uridine/cytidine kinase

2.4 來源于嗜熱棲熱菌的重組尿苷-胞苷激酶的催化反應條件優化

將來源于嗜熱棲熱菌的重組尿苷-胞苷激酶粗酶液加入到含有10 mmol/L尿苷，10 mmol/L ATP的不同pH值的PBS緩沖液中，對反應溫度以及反應pH值進行系統優化，反應時間為6 h。由圖4可知，在一定范圍內，適當地提高溫度和pH值有利于重組尿苷-胞苷激酶活力的提升，而過高的溫度以及堿性條件則容易導致酶活力的降低。當溫度為37 ℃，pH 7.5時，重組尿苷-胞苷激酶的活性達到最高值。

a-溫度優化；b-pH優化圖4 來源于嗜熱棲熱菌的重組尿苷-胞苷激酶的催化反應條件優化Fig.4 Optimization of the catalytic reaction conditions of recombinant uridine/cytidine kinase derived from T.thermophilus HB8

在優化的催化反應條件下，進一步考察不同底物濃度對來源于嗜熱棲熱菌的重組尿苷-胞苷激酶的催化效果影響，結果如表1所示。由于使用的是粗酶液，因此一部分的尿苷會在尿苷磷酸化酶的作用下轉化為尿嘧啶，使得尿苷酸的產量降低。過量的底物尿苷存在不利于尿苷酸的合成，當使用2.5 U粗酶液時，6 h內最多可以催化10 mmol/L的尿苷和10 mmol/L的ATP生成8.74 mmol/L尿苷酸。如果ATP不足量，則尿苷的產量會隨之下降。

2.5 利用來源于嗜熱棲熱菌的重組尿苷-胞苷激酶催化尿苷生產尿苷酸

使用2.4中優化的反應條件，在5 L的發酵罐中進行重組菌的培養以及酶催化反應放大實驗，結果如圖5所示。重組菌首先利用葡萄糖進行生長，當葡萄糖消耗完全之后(4 h)，連續流加低濃度乳糖低溫誘導產酶直至菌體生物量不再發生變化，此時重組尿苷-胞苷激酶的總酶活可以達到最大值。

表1 不同底物濃度對來源于嗜熱棲熱菌的重組尿苷-胞苷激酶的催化效果

a-重組大腸桿菌在5 L罐中的擴大培養；b-5 L罐中的酶催化反應圖5 利用來源于嗜熱棲熱菌的重組尿苷-胞苷激酶催化尿苷生產尿苷酸Fig.5 Production of UMP from uridine by recombinant uridine/cytidine kinase derived from T.thermophilus HB8

收集重組菌提取尿苷-胞苷激酶進行酶催化反應放大實驗。在反應初始0 h和2 h分別一次性加入1 mmol/L的ATP，觀察尿苷酸的生成情況。結果表明，當加入的ATP消耗完全時，尿苷酸的合成隨之停止。在反應的3～11 h內持續流加1 mmol/L的ATP，尿苷酸也隨之持續產生，12 h時產量達到最大值8.13 g/L。上述結果表明，連續流加低濃度ATP并不會影響重組尿苷-胞苷激酶的催化效果，后續可以使用聚磷酸激酶催化的ATP再生反應，以少量的ADP作為底物用于尿苷酸的合成，從而進一步降低生產成本，增加工業應用可行性。

3 結論

尿苷酸作為一種重要的食品添加劑和藥物前體，已經廣泛應用于食品和醫藥領域。然而，現有的尿苷酸生產方法如化學合成法和核酸水解法存在工藝復雜、酸堿廢水排放量較大等問題。開發高效、環保的尿苷酸生產制備工藝迫在眉睫。本研究以常用的大腸桿菌表達系統分別過表達來自于嗜熱棲熱菌以及枯草芽孢桿菌的尿苷-胞苷激酶基因，并對重組酶的催化特征進行了分析比較，得到了能夠以ATP作為磷酸供體的尿苷-胞苷激酶，并對其催化反應條件進行了優化。在37 ℃，pH 7.5的反應條件下，使用來源于嗜熱棲熱菌的尿苷-胞苷激酶，6 h可催化10 mmol/L的尿苷和10 mmol/L的ATP生成8.74 mmol/L尿苷酸。為了進一步提升酶促反應的經濟性，今后可以利用大腸桿菌自身的聚磷酸激酶PPK，以多聚磷酸和少量的ADP為底物，實現ATP的循環再生。將聚磷酸激酶PPK與尿苷-胞苷激酶ttCK進行串聯表達，通過全細胞的催化方式制備尿苷酸，最終實現尿苷酸的工業化生物合成。

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