不同營養添加物對黃酒酵母的乙醇耐受及發酵性能的影響

楊昳津，林祥娜，夏永軍，王光強，俞劍燊，胡健，艾連中*

1(上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海，200093)2(上海食品微生物工程技術研究中心，上海，200093) 3(上海金楓酒業股份有限公司，上海，200120)

黃酒是我國傳統的釀造飲料酒，與啤酒、葡萄酒并列為世界“三大古酒”[1]。黃酒釀酒酵母的釀造性能直接影響黃酒釀造的生產效率和產品品質[2-3]。但隨著發酵過程中乙醇的不斷積累，會對酵母細胞的生長、存活和發酵產生抑制[4-6]。高濃度乙醇對釀酒酵母細胞的毒害作用主要體現在改變細胞的形態和細胞生理活動。酵母為了生長、生存和發酵會對乙醇的脅迫產生相對的應激反應，即乙醇耐受性[7]。

提高黃酒酵母的乙醇耐受性不但可以提高原料利用率和發酵速率，同時可以使發酵進行得更為徹底，從而進一步提高乙醇產量，提高黃酒釀造品質[8-10]。在乙醇脅迫環境下生長時，不同的酵母表現出不同程度的乙醇耐受性，表明不同酵母對乙醇脅迫的應答存在極大的差異[11-13]。釀酒酵母對乙醇脅迫的應答及耐受機理一直是國內外學者研究的重點[14-18]，細胞中的許多組分與酵母的乙醇耐受特性密切相關，如影響細胞膜流動性的磷脂脂肪酸和肌醇等[19]、與蛋白質活性相關的氨基酸[20]、與質膜兩側跨膜電勢運輸相關的無機離子[21]、作為分子伴侶防止蛋白質錯誤折疊的海藻糖[22]；并且細胞的許多基因也控制著酵母菌的乙醇耐受性[23-27]。而通過添加一些對應的效應物，如氨基酸、無機鹽離子、海藻糖等，若可以提高黃酒酵母的乙醇耐受性，則在實際發酵生產中，可通過添加效應物提高酵母的乙醇耐受性能進而提高黃酒釀造的生產效率，為優質黃酒的釀造提供前提。

本課題通過乙醇定向馴化得到1株乙醇耐受性明顯提高的黃酒釀酒酵母單倍體菌株。為了維持酵母的優良性狀，最好是培育純合二倍體菌株，因此，獲得優良的單倍體不僅是性狀遺傳分析所必須，又可為育種作好親本的準備。通過培養及發酵過程中添加不同濃度的脂肪酸、氨基酸、無機離子、海藻糖和肌醇，分析不同的外源添加物對定向馴化后黃酒酵母的乙醇耐受性及發酵性能的影響，該單倍體黃酒酵母可用于進一步選育優良的二倍體黃酒發酵菌種，良好的發酵菌種對優質黃酒的釀造具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

釀酒酵母BR 20菌株，從黃酒發酵醪液中分離得到并保存于中國微生物保藏中心，保藏編號為CGMCC 9445。

1.1.2 主要培養基與試劑

生長培養基(YPD)：葡萄糖 20 g/L, 蛋白胨 20 g/L，酵母粉10 g/L，20 g/L瓊脂；

發酵培養基：MgSO41 g/L, KH2PO42 g/L, (NH4)2SO43 g/L, 蛋白胨3.6 g/L, 酵母粉4 g/L, 葡萄糖80 g/L；

產孢培養基：葡萄糖1 g/L，KCl 1.8 g/L，乙酸鈉8.2 g/L，酵母粉2.5 g/L，20 g/L瓊脂；

于121 ℃下滅菌15 min，冷卻后備用。

棕櫚酸、硬脂酸、油酸、甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、MgSO4、NaCl、KCl、無水乙醇、海藻糖、肌醇等，均為分析純試劑。蝸牛酶購于上海生工生物工程有限公司，碘化丙啶購于上海詡圣生物公司。

1.2 儀器與設備

3-18K型離心機，德國Sigma公司；PB-10 普及型 pH 計，德國 Sartorius 公司；Guava EasyCyte plus流式細胞儀，美國Merk Millipore公司；Bioscreen C MBR全自動生長曲線儀，芬蘭Oy Growth Curves Ab 公司，ZQZY-BS8全溫振蕩培養箱，上海知楚儀器有限公司；V-1600 PC可分光光度計，上海美譜達儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 單倍體的制備與分離

根據肖冬光[28]的方法，將釀酒酵母BR 20活化后接種至YPD液體培養基中，28 ℃過夜培養后少量涂布于產孢培養基上，28 ℃培養7 d后涂片染色，觀察子囊孢子的形成率。待孢子大量生成時，用無菌生理鹽水制成孢子懸液，并調整菌液的濃度為107CFU/mL，取1 mL菌液4 000 r/min離心10 min后收集菌體，加入1 mL 蝸牛酶(20 mg/mL)進行懸浮，37 ℃水浴酶解4～8 h，酶解期間取樣觀察子囊壁的破壁情況。因酵母孢子比酵母細胞更耐熱，酶解液在58 ℃條件下處理10 min以致死酵母細胞，待溫度冷卻至室溫后離心收集孢子，后用Tris-Cl洗滌2次后進行10-1～10-6稀釋后涂布于YPD平板，28 ℃培養2～3 d。待長出菌落后，將獲得的疑為單倍體的菌株再次接入產孢培養基，7 d后染色觀察其生孢情況，如果不生孢，則可確認為單倍體。同時將未經熱處理的孢子液同時接種于生孢培養基上，作為對照。

1.3.2 子囊孢子的染色

取干凈載玻片1張，滴加少許蒸餾水，接種環取少許菌，涂片固定。滴加5%孔雀石綠染液，在火焰上方加熱3～5 min，冷卻，水洗；加95%酒精脫色20～30 s，水洗；滴加0.5%番紅水溶液復染1 min，水洗，干燥；在顯微鏡下觀察，酵母子囊孢子呈綠色，酵母細胞則為粉紅色。

1.3.3 單倍體黃酒酵母的乙醇定向馴化

對分離得到的單倍體菌株進行乙醇的定向馴化，具體流程步驟見圖1。

圖1 單倍體黃酒酵母的乙醇定向馴化過程Fig.1 The redirect process of ethanol domestication in haploid Chinese rice wine yeast

1.3.4 乙醇馴化酵母株的倍型鑒定

根據參考文獻[29]，用流式細胞儀進行細胞內核酸含量的測定。將活化后的酵母制成種子液后以2%的接種量接入50 mL的YPD培養基中，以200 r/min于28 ℃下培養12～16 h后，調整菌液的濃度為2×105CFU/mL，取1 mL菌液以12 000 r/min離心1 min后收集菌體細胞，加入1 mL常溫存放的PBS溶液重懸；加入4 mL預冷的無水乙醇于-20 ℃中固定10 min；以12 000 r/min離心1 min收集細胞，除去乙醇；用1 mL的PBS緩沖液清洗1次，以12 000 r/min離心1 min收集細胞；加入5 mL室溫存放的PBS緩沖液重懸菌體，12 000 r/min離心1 min收集細胞，加入1 mL碘化丙啶染色液(3 μmol/L)，室溫孵育15 min后進行流式細胞儀分析。

1.3.5 單倍體黃酒酵母的乙醇耐受能力

定向馴化所得菌株與其出發菌株活化后，以2%接種量分別接入含有乙醇體積分數分別為5%、10%及20%的YPD培養基中，于28 ℃下以全自動生長曲線儀記錄其生長情況。

活化后的單倍體酵母，接入液體YPD中培養12～16 h至對數期，調整OD600值為1.0后，制成菌懸液，加入無水乙醇，使乙醇體積分數為18%、19%、20%、21%和22%，振蕩均勻，培養12 h后，以初始的置于冰箱的菌懸液作為對照，用分光光度計測其生長情況。另外，培養4 h后，每12 mL 菌懸液中加入1 mL 0.1 %堿性美藍染色液用血球計數板法測活菌數，計算黃酒酵母的存活率[30-31]。

1.3.6 不同濃度添加物對黃酒酵母乙醇耐受能力的影響

將活化后的單倍體黃酒酵母，制成種子液后以2%的接種量接入生長培養基中，于28 ℃下以150 r/min培養至對數期，轉移接種至含乙醇體積分數為10%的生長培養基中，生長培養基中分別加入不同濃度的外源添加物，以加入等體積去離子水作為空白對照，28 ℃下150 r/min培養 48 h，利用光密度法測定菌體生物量。

1.3.7 不同添加物對黃酒酵母乙醇發酵性能的影響

在發酵培養基中分別加入可以最大程度促進菌株在乙醇脅迫下生長的外源添加物，以10%的接種量將種子液接入含乙醇體積分數為10%的發酵培養基中，置于28 ℃ 靜置發酵，以添加等體積去離子水作為空白對照。每隔1天進行稱重，并記錄失重情況，待失重小于0.2 g時，可認為發酵基本完成，停止培養[32]。比較不同外源添加物對菌株發酵的逐日失重量的影響。

2 結果與分析

2.1 黃酒酵母單倍體的分離與制備

利用產孢培養基對釀酒酵母BR 20進行產孢培養，7天后按照1.3.2方法進行單倍體的檢驗，對檢驗結果染色鑒定后拍照，見圖2。

a-未經熱處理致死的營養體；b-單倍體酵母細胞圖2 黃酒酵母子囊孢子的染色結果Fig.2 The staining results of ascospore in Chinese rice wine yeast

由圖2(a)可知，對照組未經過熱處理致死營養體，經產孢培養基培養染色后，可同時觀察到酵母子囊孢子與子囊細胞，顏色表現為紅綠并存。圖2(b)為疑似酵母單倍體菌株在生孢培養基培養后的染色結果，結果均為粉紅色，沒有被染上綠色，說明其在產孢培養基上沒有產生孢子，可確認其為單倍體菌株[33]。將其編號為20-Ha后于-80 ℃條件下保藏于甘油中。

2.2 乙醇定向馴化后黃酒酵母菌株的乙醇耐受性

對20-Ha菌株按1.3.3的方法進行乙醇定向馴化后最終得到Et 20，連續傳代并進行表型觀察。為確定Et 20菌株沒有因為自身配型轉換后雜交從而形成二倍體菌株，以單倍體模式菌株S288c作為對照，采用流式細胞儀進行細胞內核酸含量的測定從而進行倍型的驗證，結果如圖3所示。Et 20的核酸含量峰面積為9794，與S288c的核酸含量峰面積相當(10 000)，說明Et 20與S288c有相似的倍性，均為單倍體菌株，Et 20沒有在乙醇定向馴化的過程中發生自雜交。

圖3 Et 20與S288c的流式細胞儀倍型驗證Fig.3 Genome types of Et 20 and S288c by cell flow analysis

在不同乙醇體積分數下下，繪制馴化前的出發菌株20-Ha與馴化株Et 20生長曲線，并分別進行18%、19%、20%、21%和22%體積分數的乙醇沖擊，分析Et 20的乙醇耐受能力，結果見圖4與表1。

圖4 不同乙醇體積分數下Et 20與20-Ha的生長曲線Fig.4 Growth curves of strains Et 20 and 20-Ha under different ethanol concentration

圖4表明， 5%乙醇對菌株的生長沒有太大的影響，Et 20與20-Ha表現出基本一致的生長規律；當培養基中初始乙醇體積分數為10%時，Et 20與20-Ha的生長速率明顯降低，20-Ha的延滯期延長，而Et 20的延滯期則幾乎沒有變化；當乙醇體積分數為20%時，20-Ha停止生長，Et 20的延滯期延長至16 h，對數期生長時間也明顯縮短，卻仍表現出一定的生長活力。

經過乙醇定向馴化后，Et 20的乙醇耐受性能得到了明顯的提高。

進一步分析高體積分數乙醇處理對菌株存活率的影響，由表1可知，乙醇處理體積分數低于20%時，短時的乙醇沖擊對Et 20的生長無明顯影響，培養24 h后存活率從87.9%略微下降至85.1%；20-Ha菌株則生長微弱，經18%乙醇沖擊后的存活率僅為23.2%，繼續提高乙醇濃度菌株則停止生長。當乙醇處理體積分數高于20%時，無論是短時的乙醇沖擊或培養24 h，Et 20的存活率均大幅下降。OD600值從0.163降到0.092，降低了43.56%，培養24 h后的存活率從82.9%降低至37.3%，降低了55.01%。綜上可知，經過定向馴化后的Et 20菌株對高體積分數乙醇的耐受性明顯高于馴化前的出發菌株20-Ha，進一步提高乙醇沖擊體積分數，雖然生長會受到的限制，卻仍有一定的存活率，其乙醇耐受性得到了明顯的提高。

表1定向馴化后黃酒酵母的乙醇耐受情況(n=3)

Table1EthanoltoleranceofdirectedlydomesticatedChinesericewineyeast(n=3)

乙醇體積分數Et20乙醇沖擊4h后的存活率20-Ha乙醇沖擊4h后的存活率Et20培養24h后的OD60020-Ha培養24h后的OD60018%87.9%±0.04a23.2%±0.020.166±0.003b0.089±0.002a19%85.1%±0.03b00.173±0.005a0.032±0.001b20%82.9%±0.06c00.163±0.003cND21%61.4%±0.03d00.121±0.002dND22%37.3%±0.02e00.092±0.002eND

注：1. ND表示菌株不生長；2. 右上角不同字母表示在p<0.05(Duncan)時，樣品存在顯著性差異。

2.3 不同營養添加物對乙醇脅迫下黃酒單倍體酵母生長的影響

乙醇脅迫時，酵母的生長可以反映它的乙醇耐受性，高濃度乙醇存在時，菌株生長的延滯期會相應增加[7-8]，故選擇中等強度的乙醇進行脅迫。在含有10%乙醇的生長培養基中分別添加不同濃度的脂肪酸、氨基酸、無機鹽、海藻糖和肌醇，培養48 h后測定菌體的生物量，以無營養添加物作為空白對照，結果見圖5。

圖5 不同添加物對乙醇脅迫下黃酒酵母生長的影響 (n=3)Fig.5 The effects of different additives on the growth of Chinese rice wine yeast under ethanol stress (n=3)

在乙醇脅迫下，添加的營養物均可使酵母的生物量得到顯著的提高?？梢?，脂肪酸、氨基酸、無機鹽、海藻糖與肌醇的添加可在一定程度上顯著提高Et 20的乙醇耐受性。與空白對照相比，脂肪酸的添加，使Et 20的生物量提高了10%～40%，其中硬脂酸的促進作用最大，與邢建宇等[30]、胡鐵功[34]等的研究結果一致；氨基酸的添加，使Et 20的生物量提高了14%～28%，其中谷氨酸的促進作用最大，與梁澤新等的研究結果一致[35]；無機鹽的添加，使Et 20的生物量提高了10%～23%，其中KCl的促進作用最大；添加海藻糖使Et 20的生物量提高了10%～16%；肌醇的添加使Et 20的生物量提高了9%～14%。乙醇脅迫時，脂肪酸的添加可以最大程度地提高單倍體酵母的乙醇耐受性，其中硬脂酸的效果最好。

隨著添加物質量濃度的提高，Et 20的生物量呈現先增加后降低的趨勢。棕櫚酸、NaCl和MgSO4在1.0 g/L時能最大程度提高Et 20的乙醇耐受性，油酸、谷氨酸、KCl為1.5 g/L，硬脂酸、甘氨酸和脯氨酸為2.0 g/L，海藻糖和肌醇為2.5 g/L；效果最佳的硬脂酸促進提高了40%的生物量，谷氨酸次之，為28%，其后為棕櫚酸和KCl，分別促進提高了24%和23%的生物量，海藻糖和肌醇的添加效果相對較差，均低于20%。不同種類、不同濃度的營養添加物可以不同程度地提高Et 20的乙醇耐受性，總體而言，脂肪酸的促進作用優于氨基酸，無機鹽、海藻糖和肌醇分別次之。

2.4 不同營養添加物對黃酒單倍體酵母發酵性能的影響

在實際發酵及酒的釀造過程中通常會采用CO2的損失量來表征酵母菌株的發酵能力和發酵強度。在10%乙醇脅迫下，向發酵培養基中分別加入最大程度促進菌株生長的添加物(2.3分析結果)，不同營養添加物對Et 20發酵時產生的CO2失重情況如圖6所示。

圖6 不同添加物對乙醇脅迫下黃酒酵母發酵性能的影響 (n=3)Fig.6 The effects of different additives on the fermentation performance of Chinese rice wine yeast under ethanol stress (n=3)

從圖6可以看出，發酵過程中，添加不同營養物后Et 20的總發酵強度均明顯高于空白對照。不同的營養添加物對Et 20發酵釋放產生CO2的規律基本相同：在發酵1天后出現了單日最大的CO2釋放量；隨著發酵時間的增加，CO2的失重量也逐漸降低。黃酒發酵為半開放式發酵，故用于發酵的黃酒酵母一般采用“前急后緩”菌種，即在發酵初期酵母可迅速增殖形成生長優勢從而抑制細菌過度的生長引發的酸敗。Et 20亦符合該種模式，故發酵3天后，在乙醇積累與營養消耗的雙重脅迫下，發酵強度隨時間延長明顯降低，但不同營養添加物對Et 20在乙醇脅迫下的發酵性能產生了不同的影響。相比空白對照，海藻糖在乙醇脅迫下能較好地提高Et 20的總發酵強度，脂肪酸、氨基酸與無機鹽分別次之，而肌醇的效果相對較差。添加的脂肪酸中，硬脂酸添加后，Et 20在發酵3天后的發酵強度下降幅度最低；添加的氨基酸中，甘氨酸能較好的提高Et 20的發酵性能；而所添加的3種無機鹽則作用相當。

在10%乙醇脅迫下，添加海藻糖可最大限度地提高Et 20的總發酵強度(4.63 g)，較空白對照(3.33 g)高出了39.04%；硬脂酸添加效果次之，發酵8天后Et 20累積的總CO2失重量(4.20 g)較對照高出26.13%；其后為甘氨酸，Et 20總發酵強度提高了14.71%；無機鹽的添加最大可提高12.31%的總發酵強度；添加肌醇后則僅提高了7.21%的發酵強度。隨著發酵的深入與乙醇的積累，添加外源營養物可不同程度地降低乙醇脅迫對黃酒酵母發酵性能的影響。海藻糖作為細胞內源性的“保護物質”，雖然可極大促進Et 20在乙醇脅迫下的發酵強度，但在促進菌株在乙醇脅迫下的生長卻沒有明顯的優勢；而硬脂酸既可以較好地促進Et 20在乙醇脅迫下的生長，同時也可以較大程度地提高Et 20的發酵強度。

3 結論

為選育高乙醇耐受性的黃酒酵母，為后期黃酒育種提供優質的前提，本課題通過菌種單倍體化與乙醇定向馴化獲得了1株可耐受乙醇體積分數為20%的單倍體釀酒酵母Et 20，在一定乙醇脅迫條件下添加不同種類的脂肪酸、氨基酸、無機鹽離子、海藻糖和肌醇，這些添加物均能不同程度提高Et 20菌株的乙醇耐受性，并且隨著添加濃度的升高，外源添加物有先提高后降低菌株乙醇耐受性的趨勢。硬脂酸能最大限度提高Et 20的乙醇耐受性，谷氨酸、KCl分別次之，海藻糖與肌醇的添加效果則相對較差。在10%乙醇脅迫下，添加海藻糖與硬脂酸能較大程度降低乙醇脅迫對Et 20發酵的影響，可分別提高39.03%與26.12%的總發酵強度。海藻糖雖然可極大程度促進Et 20在乙醇脅迫下的發酵強度，卻對提高菌株的乙醇耐受性沒有明顯優勢；而硬脂酸既可以較好地促進Et 20在乙醇脅迫下的生長，也可以較大程度地提高Et 20的發酵強度。定向馴化高乙醇耐受性黃酒酵母，為選育優良的黃酒發酵菌種提供前提，對優質黃酒的釀造具有重要的意義。

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