芝麻香型白酒釀造過程中乳酸菌分離及其碳源利用特征

杜海，邢敏鈺，徐巖

(江南大學 釀酒科學與酶技術中心，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

芝麻香型白酒是20世紀60年代出現的一種創新香型的白酒。其生產工藝是結合醬香型白酒和濃香型白酒的工藝優點發展起來的。芝麻香型白酒釀造過程采用清蒸清燒，蒸前高溫潤糧的工藝，高溫堆積、高溫發酵，高溫發酵是在泥底磚窖的窖池內完成的。獨特的工藝使芝麻香型白酒既具有突出的焦香，又有輕微的醬香，生成獨特優雅的芝麻香味[1]。芝麻香型白酒因其獨具特色的風味吸引了越來越多消費者的喜愛。

除了工藝的創新，芝麻香型白酒釀造還將高溫大曲、麩曲(主要指河內白曲)、生香酵母曲、細菌曲混合使用，做為糖化發酵劑[2]。其中，河內白曲，由黑曲霉變異而來，能夠耐高溫、耐乙醇，產生的酸性蛋白酶具有較高的糖化力和液化力，因此被廣泛應用于白酒釀造過程[3-5]。酵母曲中通常為Pichiakudriavzevii、Wickerhamomycesanomalus、Saccharomycescerevisiae以及Candidatropicalis等[6]。其中，Saccharomycescerevisiae發酵產生大量乙醇，是主要的產酒酵母[7-8]。細菌曲主要是由Bacilluslicheniformis、Bacillussubtitles、Bacillusstearothermophilus等芽孢桿菌組成[3, 6]。由于純種菌株的人為添加，芝麻香型白酒發酵過程中霉菌、酵母、芽孢桿菌的功能相對清楚[6,9]。白酒發酵過程是由多種微生物共同發酵產生的，其中來源于釀造環境的乳酸菌與上述人為添加微生物之間存在一定的相互作用，構成穩定的釀造微生物群落進行自然發酵。乳酸菌的種類及群落動態對白酒品質至關重要。然而，由于技術水平的局限，對芝麻香型白酒釀造過程中乳酸菌研究較少，對于該香型白酒釀造過程中乳酸菌群結構和代謝特征的認識仍不清楚。

本文旨在通過可培養技術考察芝麻香型白酒發酵過程中乳酸菌的群落結構，解析乳酸菌的菌群演替規律，確定芝麻香型白酒中重要的乳酸菌菌種。同時利用BiologGenIII微孔板對可培養乳酸菌對不同碳源的代謝能力進行測定。通過分析乳酸菌對代謝特征，解析不同乳酸菌在白酒發酵體系的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

BiologGenIII微孔板、厭氧盒等。酒醅樣品均取自某芝麻香型白酒廠，堆積周期為18 h，發酵周期為50 d。

1.2 主要試劑及培養基

M.R.S.肉湯培養基，購于OXOID公司。M.R.S.固體培養基：在M.R.S.肉湯培養基中，加入2%的瓊脂配置而成。飽和苯溶液(pH=7.9±0.2)，購于上海生工。三氯甲烷，購于上海生工。

1.3 采樣方法

樣品為芝麻香型白酒酒醅。芝麻香型白酒除了傳統的手工發酵方式，還存在機械化操作的生產方式。兩種發酵過程中的原料、發酵劑、以及工藝均相同，但是由于操作方式不同，導致發酵環境的不同，而乳酸菌大多是來自于發酵環境中的。因此，分別采取手工班和機械班的酒醅，用于乳酸菌的研究。

為了科學取樣，分別選擇手工班和機械班各3組堆積樣品進行跟蹤取樣，作為平行樣品。堆積發酵周期為18 h，每隔6 h取1次樣品，取樣時間分別為0、6、12、18 h。手工班的酒醅在地面直接進行堆積發酵，堆積酒醅取樣位置如圖1 (a)所示，取樣點為a、b、c、d四個點；機械班的堆積發酵是在堆積箱中進行的，堆積酒醅的取樣位置如圖1 (b)所示為a～i九個點。不同取樣位置分別取50 g左右的酒醅混合成一個樣品。堆積結束的樣品即為窖池發酵0 d的樣品。窖池發酵周期為50 d，取樣時間分別為3、5、10、15、20、25、30、35、40、50 d，取樣位置為a～i九個點，如圖1 (c)所示。在每個取樣點分別取50 g左右的酒醅混合成一個樣品。將采集的酒醅樣品密封，在-80 ℃冰箱中保存。

圖1 酒醅取樣位置示意圖Fig.1 The schematic graph of the sampling sites

1.4 乳酸菌的分離、鑒定

(1)分離：將10 g酒醅樣品溶于100 mL無菌水中，混勻。對其進行梯度稀釋，取10-2、10-3、10-43個稀釋度的菌懸液加入無菌平皿，分別傾入已熔化并冷至40 ℃左右的乙醇濃度5%、10%，pH梯度為4.0、5.0、6.0的M.R.S.固體培養基，立即混勻，待凝固后，放入厭氧盒中倒置，于30 ℃、37 ℃厭氧培養。選擇合適梯度的傾注平板，用無菌牙簽盡可能多的挑取單菌落，在新平板的不同區域進行點種，以菌種原始的培養條件進行培養。將點種平板上菌落形態差異較大的菌株接種M.R.S.肉湯培養基，培養4 d左右，取2 mL菌液，用于甘油管保藏，剩余菌液用于提取基因組進行測序，以判斷其種屬。

(2)鑒定：取2 mL菌液，12 000 r/min離心2 min，收集菌體，加入1 mL無菌水混勻，離心洗滌菌體。加入0.2 mL的無菌水，重懸菌體，將其轉移至含有0.3 g無菌玻璃珠的螺旋管內，再加入0.3 mL酚∶氯仿混合溶液(V∶V=1∶1)。用Beadbeater細胞破碎儀擊打30 s，進行破碎。破碎后，向混合體系內加入0.6 mL的無菌水，顛倒混勻，12 000 r/min離心10min。將上清液轉移至干凈無菌的離心管內，加入上清液二倍體積的冰乙醇。-20 ℃沉淀，過夜。12 000 r/min離心20 min，棄上清，將乙醇用真空干燥箱烘干，加入30 μL無菌水復溶。選擇細菌通用引物27F/1492R對菌株的基因組進行PCR擴增，PCR產物送公司測序，測序結果在NCBI網站與模式菌進行比對，確定菌株的種屬信息。

1.6 乳酸菌碳源代謝能力測定

利用Biolog GenIII微孔板對11株可培養乳酸菌對71種碳源的代謝能力進行測定。具體操作過程：在M.R.S.固體培養基上劃線，分離乳酸菌，挑取單菌落，接種在MRS液體培養基中，于30 ℃、厭氧條件下靜置培養20 h，9 000 r/min離心10 min，在無菌條件下除去培養基，再加入5 mL的無菌超純水重懸，將菌懸液轉接至接種液中，配成細胞濃度為90%～98% 的菌懸液。將菌懸液加到微孔板上，每孔加入100 μL的量。將微孔板置于30 ℃、厭氧條件下靜置培養48 h。根據孔內顏色變化確定乳酸菌碳源利用能力的大小。

2 結果與分析

2.1 可培養方法分離到的乳酸菌種

取芝麻香型白酒不同堆積發酵過程的酒醅樣品，對其進行梯度稀釋，取10-2、10-3、10-43個稀釋度的菌懸液加入無菌平皿，分別傾入已熔化并冷至50 ℃左右的乙醇濃度5%、10%，pH梯度為4.0、5.0、6.0的MRS培養基，立即混勻，待凝固后于厭氧盒中倒置，于37 ℃培養。

選擇合適梯度的傾注平板，并后續通過劃線方法對菌落進行純化。用無菌牙簽盡可能多的挑取單菌落，在新平板的不同區域進行點種，以菌種原始的培養條件進行培養。將點種平板上菌落形態差異較大的菌株接種M.R.S.培養基，培養4 d左右，取2 mL菌液，提取其基因組進行測序，以判斷其種屬，剩余菌液用于甘油管保藏。以傾注平板法從芝麻香型白酒的堆積酒醅樣品獲得了267株菌。

圖2 可培養菌種初篩結果Fig.2 Screening results of strains

2.2 酒醅中乳酸菌的分類鑒定

將初篩獲得菌株分離純化，選取上述菌落形態差異較大的單菌，接種至M.R.S.肉湯培養基，培養4 d后，收集菌體，提取單菌基因組，然后用細菌通用引物27F和1492R進行PCR。PCR結果顯示，成功從37個單菌基因組中獲得目標PCR產物。將上述PCR產物進行測序，其中32株被確定為乳酸菌(如表1所示)。

表1 可培養方法分離芝麻香白酒酒醅中乳酸菌鑒定結果

由表1可知，獲得測序結果的32株菌，從種水平可以分為7類，其中A2是Lactobacillusparacasei(副干酪乳桿菌)，A4是Lactobacilluszeae(玉米乳桿菌)，A8、C10是Lactobacillusacidipiscis(嗜酸乳桿菌)，A9是Lactobacillusbuchneri(布氏乳桿菌)，B15是Lactobacillusfermentum(發酵乳桿菌)，A、A37、B2、B4、B5、B7、B9、B17、B18、B20、B21、B22、B24、B26、C3、C9、C10、C27、C30是Pediococcusacidilactici(乳酸片球菌)，B1、B3、B8、B11、B14、B25、C1、C5是Pediococcuspentosaceus(戊糖片球菌)。

與之前醬香型白酒的測序結果對比，發現新獲得Lactobacillusparacasei(副干酪乳桿菌)、Lactobacillusacidipiscis(嗜酸乳桿菌)、Lactobacillusbuchneri(布氏乳桿菌)、Pediococcuspentosaceus(戊糖片球菌)為芝麻香型白酒和醬香型白酒共有的。

2.3 乳酸菌代謝特征

選擇芝麻香型白酒酒醅中分離獲得的主要乳酸菌PediococcuspentosaceusB24、PediococcusacidilacticiJSA6、LactobacillusparacaseiJJA1、LactobacillusplantarumJD19、LactobacillusfermentumJSA30、Lactobacillusacetotolerans19，白酒發酵體系中常見的乳酸菌LactobacilluspontisJSC25、LactobacilluspentosusNA、LactobacillusacidipiscisA8、LactobacillusbuchneriA9，以及實驗室前期分離得到的乳酸菌WeissellaviridescensW，進行活化，并接種至Biolog GenIII微孔板進行實驗，考察這11株乳酸菌對于71種不同碳源的利用情況。

如圖3所示，大部分乳酸菌對于糖類物質的利用較強，比如糊精、D-麥芽糖、纖維二糖、α-D-葡糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖等。絕大多數可培養乳酸菌能夠很好地利用葡萄糖，Lactobacillus對糊精的利用能力很好，而Pediococcus對糊精的利用相對較弱，Lactobacillusacetotolerans對于碳源的利用能力普遍弱于其他乳酸菌，Lactobacillusacetotolerans利用能力最強的是糊精，其次是D-果糖、D-葡萄糖、D-海藻糖等。因而在發酵過程中，可培養乳酸菌對于葡萄糖的消耗要快于糊精，隨著體系中葡萄糖含量的逐漸降低，可培養乳酸菌物種與功能的多樣性將受到碳源利用能力的制約，白酒雙邊發酵的特點，在一定程度上給乳酸菌發揮其代謝功能提供了一個相對較好的模式。

乳酸菌對于氨基酸的利用較弱，從整體上看，乳酸菌對于氨基酸的利用能力由強到弱依次為：Pediococcus、Weissella、Lactobacillus。乳桿菌中的LactobacilluspentosusNA、LactobacillusparacaseiJJA1、Lactobacillus

圖3 乳酸菌的碳源利用能力圖Fig.3 Carbon source utilization ability of lactic acid bacteria

plantarumJD19對氨基酸代謝相對較強，能利用的氨基酸種類也較多。氨基酸代謝可以為芳香族化合物形成提供前體物質，LactobacilluspentosusNA、LactobacillusparacaseiJJA1、LactobacillusplantarumJD19可能對芳香類物質的形成具有一定的貢獻。

在乳酸菌碳源利用能力測定實驗中，發現大多數乳酸菌幾乎不能利用有機酸，PediococcusacidilacticiB24、LactobacilluspentosusNA、LactobacillusparacaseiJJA1的有機酸利用能力相對較好，但還是很微弱。這表明大多數乳酸菌在生長代謝過程中，幾乎不需要利用外來的有機酸，通過有機酸利用能力的測試，可以為研究乳酸菌產相應有機酸能力的研究提供一定的借鑒。

3 討論

乳酸菌是能夠發酵糖類物質產生乳酸的一類微生物的總稱，乳酸菌通常呈革蘭氏染色陽性，不產孢子，過氧化氫酶實驗陰性，耐酸，最適pH在4.0～4.5，厭氧或耐氧的，菌體形態各異，有棒狀(桿菌)和球體(球菌)等[10]。由于乳酸菌普遍存在于食品發酵過程中[11]，對于食品的品質有重要影響，因此，引起了國內外的廣泛關注。

傳統食品發酵過程中風味物質的生成與乳酸菌群的代謝活動密切相關。乳酸菌能夠產生有機酸[12]，直接影響食品的風味。乳酸菌同型發酵的產物主要是乳酸，異型發酵除了乳酸之外，還產生乙酸。乳酸菌代謝產生的乳酸、乙酸等有機酸既可以直接影響食品風味的形成，還能夠以其為底物產生乳酸乙酯、乙酸乙酯等酯類物質對食品風味產生影響。

在發酵過程中，乳酸菌具有調節菌群結構和調控發酵進程的作用。一方面，乳酸菌能夠通過產生乳酸、乙酸等有機酸，產生細菌素等拮抗物質，以及與其他微生物競爭底物等途徑影響其他微生物的生長[13-16]，從而調節發酵過程中的菌群結構。另一方面，乳酸菌直接調控發酵過程，例如Weissella和Leuconostoc能夠啟動發酵，Lactobacillusplantarum能夠加速發酵進程[17-18]。因此研究發酵過程中乳酸菌與其他微生物的相互作用有助于進一步探究發酵機理。

中國白酒是在開放的生產環境下，通過多種微生物相互作用共同發酵產生的[19]。由酒醅微生物和窖池微生物構成的白酒釀造微生物群落自然發酵，最終形成獨具特色的白酒產品。酒醅微生物構成十分復雜，除了來自大曲的微生物以外，還有各種各樣的環境微生物[20]。白酒釀造過程中存在細菌、酵母菌和霉菌等各類微生物。細菌既能代謝產生酸類、醛類等物質對白酒風味產生直接影響，也能通過產生淀粉酶、酯化酶等對出酒率和酒的香味產生影響[21]。其中，乳酸菌作為白酒發酵過程中的優勢細菌，其種類、數量以及動態變化對于白酒釀造過程至關重要[22]。

在白酒發酵的中后期，隨著發酵的進行，發酵體系內酸度和乙醇濃度的升高，氧氣含量逐漸減少，大部分的微生物不能夠耐受高酸度、高乙醇濃度、厭氧等不利條件而逐漸衰亡，而乳酸菌則成為絕對優勢的細菌。乳酸菌的主要產物是乳酸，乳酸能夠減少白酒的刺激感，增加酒體的醇厚感。乳酸菌還能通過異型發酵途徑產生少量的乙酸，乙酸有一定的刺激性，對白酒產品風味的形成有重要影響。同時，乳酸能夠與其他微生物代謝產生的乙醇發生反應，生成乳酸乙酯，乳酸乙酯能夠增加酒體的醇甜感、醇厚度，是重要的呈味呈香物質。除此以外，乳酸菌還能夠通過產生有機酸，降低發酵體系pH，產生拮抗類物質等途徑影響發酵體系中其他微生物的生長代謝，從而調控整個發酵過程。因此，白酒乳酸菌引起了越來越多研究人員的關注。

綜上所述，在芝麻香型白酒發酵過程中，乳酸菌種類豐富，其中既有同型發酵乳酸菌，也有異型發酵乳酸菌。而且不同乳酸菌的生長要求不同，對于碳源的選擇性利用和利用能力的大小均存在較大的差異。白酒釀造的原料是高粱等谷物，其主要成分是淀粉，淀粉水解產生糊精、葡萄糖等物質，而乳酸菌對葡萄糖、糊精等物質的利用能力以及發酵過程中碳源物質的分布對于菌群結構有重要影響。然而，由于篩選條件的設定比較局限，不能滿足所有乳酸菌的生長需求，后續將結合高通量測序等技術的輔助手段，更加全面的分析乳酸菌群的群落組成和演替。

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