發菜中GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因的克隆及原核表達

蔡國強，陳雪峰，范華，劉歡，趙圓圓

( 陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安，710021)

發菜(Nostocflagelliforme)，學名發狀念珠藻，是一種經濟價值極高的光能自養型陸生藍細菌。在我國，野生發菜主要分布在干旱、半干旱的荒漠及半荒漠地帶[1]。發菜胞外多糖是發菜生長過程中分泌在細胞外的活性多糖，具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、提高免疫力等生物活性，可以保護細胞，抵抗外界惡劣環境，賦予了發菜較高的食用和藥用價值[2-4]。然而，發菜因為生長緩慢和過度采掘致使野生發菜資源瀕臨毀滅。如何通過人工培養的方式提高發菜及其胞外多糖的產量成為亟待解決的問題。王貴春等發現，在0.3 mol/L鹽濃度下，發菜胞外多糖產量較正常培養條件下提高了50.3%[5]。趙秀霞等對0 mol/L和0.3 mol/L鹽濃度下的發菜細胞進行轉錄組測序，得到13 170條差異表達基因，其中3 115條上調表達基因，10 055條下調，差異表達基因的GO功能聚類和Pathway代謝通路分析表明，涉及到光合作用、糖酵解/糖合成、Na+/K+運輸、能量代謝、核糖體代謝、次級代謝產物生物合成等眾多通路的基因都出現一定程度的差異表達[6]。GDP-甘露糖4,6-脫水酶是GDP-L-巖藻糖合成途徑中的關鍵酶，可以催化GDP-D-甘露糖形成GDP-4-酮基-6-脫氧-D-甘露糖，進而在GDP-酮-6-脫氧甘露糖3，5-表異構酶的催化作用下，轉化成GDP-L-巖藻糖[7]。在從頭合成途徑中，GDP-甘露糖4,6-脫水酶參與合成活性核糖，為前體糖核苷酸的形成提供原料，從而參與多糖重復單元的合成組裝[8]。前期轉錄組測序結果發現發菜GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因在0.3 mol/L鹽濃度下轉錄水平較0 mol/L提高了2.18倍。

本研究對發菜中的GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因進行克隆及生物信息學分析，并構建其重組表達質粒在大腸桿菌中成功高效表達。為發菜多糖合成調控機理的研究奠定一定的理論基礎,為GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因工程菌株的構建提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

本實驗所用發菜、質粒pET-28a由陜西科技大學微生物制造研究室保藏；大腸桿菌BL21、DH5α感受態細胞以及各種試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；pMD19T載體和各種限制性內切酶，TaKaRa寶生物工程有限公司；溴酚藍，沈陽試三生化科技開發有限公司；考馬斯亮藍，SDS和甘氨酸，美國Sigma公司；巰基乙醇，國藥集團化學試劑有限公司；30% 丙烯酰胺和TEMED，碧云天生物技術公司。

1.2 儀器與設備

DYCZ-24EN蛋白電泳儀，江蘇興化市分析儀器廠；LDZX-30KBS高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；MGC-400HP光照培養箱，上海善志儀器有限公司；2H-4水浴鍋，金壇宏華儀器廠；Mastercycler nexusPCR儀，德國Eppendorf公司；DYY-2C瓊脂糖凝膠電泳儀，北京市六一儀器廠；FR-980A生物電泳圖像分析系統，上海復日科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 目的片段TA克隆

按照天根生化科技(北京)有限公司的植物基因組提取試劑盒方法提取發菜基因組DNA,根據轉錄組測序結果及NCBI相似基因序列同源比對分析后進行引物設計，上游引物的序列為G1：5′-ATGACGCAACAGAAGCGAGC-3′，下游引物的序列為G2：5′-TCAGAAGTGCAAAGCGCC-3′，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR反應體系為：發菜基因組DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，2×TaqPCR MasterMix 10 μL，ddH2O 6 μL。擴增條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，46 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環，72 ℃ 5 min。1%瓊脂糖電泳檢測并回收產物，與 pMD19-T載體連接，轉化DH5α感受態，篩選陽性克隆進行菌液PCR檢測后送至北京奧科鼎盛生物科技公司測序。

1.3.2 序列分析

測序結果在NCBI進行確認，通過DNAMAN推譯得到氨基酸序列，再使用DNAstar進行分析。利用ProtScale分析目的蛋白的親水性和疏水性。利用 DNAMAN和SOPMA對GDP-甘露糖4,6-脫水酶的二級結構進行預測分析。利用TMHMM對目的蛋白進行跨膜區分析。利用NetPhos3.1 Server對目的蛋白進行磷酸化位點分析。

1.3.3 GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因原核表達

根據測序結果，設計GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因的擴增引物，并在上下游的5′端添加BamHI和XhoI的酶切位點以及相應的保護堿基(A1:5′-CGCGGATCCATGACGCAACAGAAGCGAGC-3′;A2:5′-CCGCTCGAGGAAGTGCAAAGCGCC-3′)。擴增條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環，72 ℃ 5 min。1%瓊脂糖電泳檢測。

以GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因與 pMD19-T連接而成的重組質粒為模板進行PCR擴增。將純化后的PCR產物和pET28a質粒用BamHI和XhoI分別進行雙酶切后相連，得到蛋白基因表達載體。將重組質粒轉化到DH5α培養，篩選陽性克隆進行菌液PCR和雙酶切驗證。轉化感受態BL21，誘導表達后通過SDS-PAGE進行電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 發菜GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因TA克隆

提取發菜DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，結果符合預期大小(圖1)。PCR擴增后，在1 100 bp位置出現條帶，符合預期(圖2)。將純化回收后的發菜GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因與pMD19-T相連，轉化感受態DH5α，篩選陽性克隆進行菌液PCR鑒定，結果顯示，成功篩得含有大小為1 200 bp(含克隆位點140 bp左右)的重組克隆載體的陽性菌株(圖3)，表明發菜GDP-甘露糖 4,6-脫水酶基因成功克隆至pMD19-T 載體上。

M-λDNA HindIII;1～2-發菜DNA圖1 發菜基因組DNA抽提電泳圖Fig.1 Electrophorogram of genome DNA from N.flagelliforme

M-DL2000；1-GDP-甘露糖 4,6-脫水酶基因圖2 GDP-甘露糖 4,6-脫水酶基因的PCR擴增Fig.2 GDP-mannose 4,6-dehydratase PCR amplification

2.2 發菜GDP-甘露糖 4,6-脫水酶基因序列分析

通過pMD19-T通用引物對重組片段測序發現：發菜GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因大小為1 080 bp。使用DNAstar對其氨基酸序列表明：GDP-甘露糖4,6-脫水酶包含的氨基酸殘基數為359。 GDP-甘露糖4,6-脫水酶的帶電荷總氨基酸為84個，占總氨基酸殘基23.39% ，其中帶正電荷38個，帶負電分析荷46個。極性氨基酸共有100個，占27. 86% ，疏水氨基酸有119個，占33. 15% ，酸性氨基酸和堿性氨基酸分別占12.53%和10.58%。在GDP-甘露糖4,6-脫水酶中包含較多的氨基酸為Leu(9.19%)、Gly(7.52%)、Thr(6.96%)、Arg(6.69%)、Glu(6.41%)、Ala(6.41%)、Asp(6.13%)、Gln(5.85%)、Tyr(5.85%)(圖4)。

M-DL2000；1～3-GDP-甘露糖 4,6-脫水酶基因陽性轉子圖3 陽性轉化子(DH5α)的PCR驗證Fig.3 PCR identification of positive transformant (DH5α)

圖4 GDP-甘露糖4,6-脫水酶的核苷酸及氨基酸序列 Fig.4 Nucleotide sequence and amino acid sequence of GDP-mannose 4,6-dehydratase

通過DNAMAN軟件將發菜中GDP-甘露糖4,6-脫水酶的核苷酸序列及氨基酸序列與GenBank的同源物種序列進行BLAST比對，發現GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因具有較高的保守性，與點狀念珠藻(NostocpunctiformePCC 73102)的基因同源性達93.1%，氨基酸同源性達97.3%。與絲狀藍藻(Calothrixsp. PCC 7507)的基因同源性達83.3%，氨基酸同源性達92.4%。與筒孢藻(CylindrospermumstagnalePCC 7417)的基因同源性為83.1%，氨基酸同源性達91.2%。與念珠藻(Nostocsp. PCC 7107)的基因同源性為82.64%，氨基酸同源性達93.13%。與NostocpiscimakeCENA21的基因同源性為81.43%，氨基酸同源性達91.12%。與魚腥藻(AnabaenacylindricaPCC 7122)的基因同源性為80.87%，氨基酸同源性達90.58%。與側生藻(Fischerellasp. NIES 3754)的基因同源性為79.39%，氨基酸同源性達88.72%。與多變魚腥藻(AnabaenavariabilisATCC 29413)的基因同源性為78.0%，氨基酸同源性達89.0%(圖5)。

2.3 GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因的疏水性、跨膜區、磷酸化位點分析及二級結構預測

利用ExPASy軟件對發菜GDP-甘露糖4,6-脫水酶的氨基酸序列進行疏水性分析，結果顯示第194位的脯氨酸(Pro)親水性最強，第185位的天冬酰胺(Asnr)疏水性最強。整體來看，親水性區間分布更廣，相對于疏水性區間較多，因此確定GDP-甘露糖4,6-脫水酶是親水性蛋白。

利用TMHMM程序對GDP-甘露糖4,6-脫水酶進行跨膜區分析，結果表明，GDP-甘露糖4,6-脫水酶不含跨膜區。

利用NetPhos對GDP-甘露糖4,6-脫水酶的磷酸化位點進行預測，結果表明，GDP-甘露糖4,6-脫水酶的Ser、Thr和Tyr磷酸化位點個數分別為：17、15和13個。運用DNAMAN軟件和SOPMA軟件對GDP-甘露糖4,6-脫水酶二級結構進行預測分析，雖然不同軟件的算法存在差異，但經綜合分析認為，發菜GDP-甘露糖4,6-脫水酶的二級結構主要構成方式為α螺旋和隨機卷曲(表1)。

圖5 GDP-甘露糖 4,6-脫水酶DNA 的核苷酸序列(左)及推導的氨基酸序列(右) 同源樹Fig.5 Homology tree of nucleotide sequence (left) and its deduced amino acid sequence (right) of GDP-mannose 4,6-dehydratase

表1 發菜GDP-甘露糖4,6-脫水酶二級結構預測結果

Table 1 The secondary structure prediction of GDP-mannose 4,6-dehydratase from N. fiagelliforme

分析方法α螺旋β折疊轉角隨機卷曲DNAMAN69(19.22%)84(23.40%)0206(57.38%)SOPMA140(39.0%)58(16.16%)0161(44.84%)

2.4 GDP-甘露糖4,6-脫水酶在大腸桿菌中的表達

構建GDP-甘露糖4,6-脫水酶的表達載體pET28a-GDP-mannose 4,6-dehydratase,轉化DH5α挑選陽性克隆進行菌液PCR驗證，得到1 300 bp大小的特異性條帶(加上克隆位點300 bp左右)，符合預期大小(圖5)。抽取質粒進行雙酶切驗證，結果在1 080 bp處出現1條特異條帶，與預期片段大小一致(圖6)。測序結果表明插入的片段就是GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因。

M-DL2000；1～3-GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因重組質粒陽性轉化子圖5 陽性轉化子(DH5α/pET28a-GDP-mannose 4,6-dehydratase)的PCR驗證Fig.5 PCR identification of positive transformant(DH5α/pET28a-GDP-mannose 4,6-dehydratase)

1-DL2000；2-雙酶切后GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因；3-重組質粒雙酶切；4-雙酶切后pET28a；5-10 kb DNA ladder圖6 陽性轉化子(DH5α/pET28a-GDP-mannose 4,6-dehydratase)的酶切驗證Fig.6 Dual restriction enzyme digestion identification of positive transformant (DH5α/pET28a-GDP-mannose 4,6-dehydratase)

將表達載體轉化BL21，篩選陽性菌接種到含有卡那霉素的LB培養基，37 ℃，200 r/min培養至OD值為0.8時，加入IPTG使其濃度為1 mmol/L，16 ℃，120 r/min培養20 h后取樣進行電泳。SDS-PAGE電泳檢測結果表明有外源蛋白表達(圖7)，參照蛋白分子量標準，外源蛋白分子質量約為41.08 ku，與預測的GDP-甘露糖4,6-脫水酶分子質量相同。

M-蛋白分子量標準；1-IPTG誘導的空質粒轉化子； 2-未誘導的陽性質粒轉化子；3-IPTG誘導10 h的陽性質粒轉化子；4-IPTG誘導15 h的陽性質粒轉化子；5-IPTG誘導 20 h的陽性質粒轉化子圖7 GDP-甘露糖 4,6-脫水酶基因在大腸桿菌BL21中的表達Fig.7 GDP-mannose 4,6-dehydratase expressed in E.coli BL21

3 討論

由于發菜全基因組尚未公布，因此通過BLAST比對高同源性的基因序列設計特異性引物進行克隆成為研究發菜基因的主要手段[9-10]。所以根據轉錄組測序結果及同源比對分析設計引物進行GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因的克隆，成功得到大小為1 080 bp的目的序列。經同源性比較發現發菜GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因具有較高保守性，與點狀念珠藻(NostocpunctiformePCC 73 102)的核苷酸序列相似度達93.1%，氨基酸序列相似度達97.3%。生物信息學分析表明GDP-甘露糖4,6-脫水酶是親水性膜外蛋白，酪氨酸有13個磷酸化位點，蘇氨酸有15個磷酸化位點，絲氨酸有17個磷酸化位點，二級結構主要構成方式為隨機卷曲和α螺旋，等電點為5.73，正負電荷氨基酸殘基數分別為38和46。這為進一步研究GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因在發菜多糖代謝中的分子調控機制奠定基礎。此外，本實驗構建了GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因的高效表達載體，這為今后GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因工程菌株的構建提供理論依據。

鹽脅迫下發菜多糖產量提高，GDP-甘露糖4,6-脫水酶基因轉錄水平上調。這暗示基因可能是鹽脅迫下發菜胞外多糖代謝的關鍵調控因子，它們在發菜響應鹽脅迫過程中發揮了重要的調節作用。GDP-甘露糖4,6-脫水酶可以催化GDP-D-甘露糖形成GDP-4-酮基-6-脫氧-D-甘露糖，進而形成GDP-L-巖藻糖，參與多糖合成。說明發菜可能通過相關基因調控多糖合成途徑以響應鹽脅迫，這也從分子層面為“鹽脅迫下發菜多糖產量明顯提高”這一結論提供依據。然而，多糖代謝調控是一個復雜的生物調控過程，參與基因眾多，它們如何在轉錄水平調控多糖代謝以響應鹽脅迫還需要進一步研究。

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