芝麻菜種子萌發過程中芽苗生長和硫苷代謝

李昕悅,楊潤強,王 沛,田 璐,顧振新

(南京農業大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

芝麻菜(ErucasativaMill)是十字花科蕓薹屬一年生植物,原產于東亞與地中海，其具有生長周期短(40～60 d),氣味辛辣,類似芝麻種子的香氣等特點,并且富含胡蘿卜素、維生素C、膳食纖維、類黃酮、硫代葡萄糖苷(Glucosinolate,GLs,簡稱硫苷)等功能成分[1]。歐洲國家常用其葉片做沙拉或清蒸蔬菜;由于其種子的高含油量,印度、巴基斯坦及一些非洲國家則將其作為一種重要的油料作物[2-3]。在日本,芝麻菜在過去數十年中被廣泛食用,且顯示出不斷增長的經濟潛能。在我國,河北、山西、陜西、黑龍江、云南、四川等地均有種植[4],但仍然未被廣泛認知或食用。

硫苷是植物體的一類含氮、硫的次級代謝產物,主要存在于十字花科植物中,流行病學研究發現,硫苷能降低患癌風險,經常食用十字花科蕓薹屬蔬菜,如西蘭花、花椰菜、甘藍、芝麻菜等,有助于預防多種癌癥的發生[5-6]。硫苷一般存在于液泡中,而黑介子酶(Myrosinase,MYR)則位于特定的蛋白體中,正常情況下,兩者分離,相對穩定,當植物組織和細胞遭到機械損傷、病原菌侵染、昆蟲取食或代謝誘導時,硫苷與MYR接觸,逐步發生降解反應形成異硫氰酸鹽(Isothiocyanates,ITCs)、硫氰酸鹽、腈類等一系列產物[7]。目前研究認為其中ITCs在十字花科植物抗癌功效中起決定性的作用,蘿卜硫苷的降解產物蘿卜硫素(Sulforaphane,Sul)是迄今為止在蔬菜中發現的抗癌能力最強的天然活性物質,而芝麻菜中主要含有的是芝麻菜苷(Glucoerucin,GER),其降解產物芝麻菜素(Erucin,Eru)具有與蘿卜硫素相似的結構,兩者可以相互轉化,且芝麻菜素還具有獨特的直接抗氧化作用[8],具有極大的研究價值。

種子在發芽過程中生理生化變化顯著,并伴隨著多種物質間的轉化、分解與合成。郭麗萍等[9]對西蘭花苗研究發現,隨著發芽的進行,蘿卜硫苷含量和蘿卜硫素的形成量不斷降低;周晨光[10]研究了蘿卜種子萌發過程中的生理變化,發現隨著幼苗的生長,硫苷總體上呈下降趨勢;張亮[11]的實驗表明西蘭花種子發芽過程中蘿卜硫苷含量呈先升后降再上升,且與蘿卜硫素含量呈極顯著負相關。說明發芽過程中不同品種間物質變化存在差異,而芝麻菜芽苗菜作為一種新型的即食性食物鮮少被研究。

本研究選擇“板葉”和“東升”兩個品種芝麻菜,研究其萌發過程中生長狀況及硫苷代謝的變化情況,旨在為芝麻菜芽苗菜及相關食品的開發提供一定的科學指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芝麻菜種子 山東壽光惠農種業公司;烯丙基硫苷(純度≥98%)、硫酸酯酶(酶活≥10.000 units/g solid)、異硫氰酸苯酯(純度≥99%) 美國Sigma公司;芝麻菜素 純度≥98%,美國LKT Labs公司;DEAE Sephadex A-25樹脂、咪唑 北京索萊寶科技有限公司;甲醇、乙腈(色譜級) 美國天地公司;葡萄糖試劑盒 貨號:F 006,南京建成生物工程公司;二氯甲烷、沒食子酸、福林酚、甲醇、乙醇、乙酸、醋酸鈉、鹽酸 醫藥集團(上海)化學試劑公司。

PGX-150智能光照培養箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠;DY02九陽智能發芽機 山東九陽股份有限公司;Agilent 1200型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司;UV-2802型紫外-可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;TDL-40B型離心機 上海安亭科學儀器廠;Orion818型pH計 美國Orion公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發芽及取樣方法 稱取2 g芝麻菜種子,于1.5%次氯酸鈉溶液中浸泡消毒15 min,然后用蒸餾水沖洗至pH中性,置于蒸餾水中,30 ℃浸泡3 h后,均勻撒入鋪有蛭石的發芽機中,于30 ℃下發芽,光照16 h/黑暗8 h,每隔12 h用100 mL蒸餾水噴施一次。分別在發芽2、4、6、8 d后取樣(去根),吸水紙吸干芽苗表面水分,液氮速凍后于-80 ℃保存待測。0 d樣品為僅浸泡3 h后的種子。

1.2.2 芽長、鮮重和含水率的測定 芽長:隨機選取30株芽苗,用游標卡尺測定;鮮重:隨機選取30株芽苗為一組,準確測定其重量,重復3次;干重:隨機選取50株芽苗或50粒種子為一組,于60 ℃恒溫箱中烘干至恒重后,準確測定重量,重復3次。

1.2.3 可溶性糖含量的測定 根據王學奎[12]的方法稍作修改。取0.1 g種子或10株芽苗,各加入3.0 mL水研磨成勻漿,90 ℃恒溫水浴浸提20 min,于10000×g離心10 min,然后吸取0.5 mL上清于20 mL刻度試管中,加1.5 mL蒸餾水、0.5 mL蒽酮乙酸乙酯試劑和5 mL濃硫酸,充分振蕩,立即將試管放于沸水浴中準確保溫1.0 min,取出后自然冷卻至室溫,在630 nm波長下測其吸光值。

式中:n為根據標準曲線所得可溶性糖含量(μg);Vt為樣品提取液總體積,mL;Vs為測定時取用的樣品體積,mL。標準曲線方程式為Y=0.006X+0.001(Y為630 nm處吸光度,X為可溶性糖質量,μg),相關系數r=0.9956。

1.2.4 游離氨基酸含量的測定 根據王學奎[12]的方法稍作修改。取0.1 g種子或10株芽苗,各加入3.0 mL 10%乙酸研磨成勻漿,10000×g離心15 min,取1.0 mL上清液于20 mL刻度試管中,依次加入1.0 mL去離子水、3.0 mL水合茚三酮試劑、0.1 mL 0.1%的抗壞血酸。充分混勻后蓋上合適大小的玻璃球,置于沸水中加熱15 min,取出后用冷水冷卻并不時搖動,使加熱時形成的紅色空氣被空氣逐漸氧化而褪去,進而呈現藍紫色時,用60%乙醇定容至20 mL,混勻后于570 nm處測吸光值。

式中:n為根據標準曲線所得的游離氨基含量(μg);Vt為樣品提取液總體積,mL,Vs為測定時取用的樣品體積,mL。標準曲線方程式為Y=0.0479X-0.0034(Y為570 nm處吸光度,X為游離氨基酸質量,μg),相關系數r=0.9982。

1.2.5 硫苷含量的測定 根據Wei等[13]的方法稍作修改。取0.1 g種子或10株芽苗,各加入2.0 mL 70%的沸甲醇,80 ℃恒溫水浴浸提20 min,10000×g離心10 min后收集上清液,沉淀再用2.0 mL 70%沸甲醇提取20 min,合并兩次提取的上清液,即為硫苷粗提液。取2.0 mL上清液流經DEAE SephadexTMA-25離子交換柱,待提取液充分排干后,加2.0 mL 0.02 mol/L的醋酸鈉溶液沖洗2次,隨后加500 μL硫酸酯酶,于30 ℃下反應16 h。用2.0 mL去離子水洗脫,洗脫液用0.45 μm水相濾膜過濾后用于HPLC分析。

HPLC色譜條件:色譜柱為Eclipse XDB-C18column(4.6 mm×150 mm×5 μm),流動相為超純水和20%的乙腈(色譜級),洗脫程序:水洗脫1 min后,1～21～26 min內乙腈線性梯度變化0%～100%～0%。檢測波長:226 nm;流速為1 mL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:20 μL。以烯丙基硫苷為內標,結果以nmol/株表示。

1.2.6 異硫氰酸鹽含量測定 根據Chung等[14]的方法并稍作修改。取0.1 g種子或10株芽苗,各用4.0 mL去離子水研磨成勻漿,30 ℃下恒溫水浴2 h后于10000×g離心15 min。取250 μL上清液,與250 μL磷酸緩沖液(0.1 mol/L,pH8.5)、500 μL 1,2-苯二硫醇(10 mmol/L)混合均勻后,于65 ℃下反應2 h,待冷卻后10000×g離心5 min。上清過0.45 μm有機相濾膜后用于HPLC分析。

HPLC色譜條件:色譜柱為Eclipse XDB-C18column(4.6 mm×150 mm×5 μm),流動相為超純水-甲醇(30∶70,V/V),檢測波長:365 nm;流速為1 mL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:20 μL。以異硫氰酸苯酯做標準曲線,根據標準曲線計算樣品中異硫氰酸鹽的含量,結果以nmol/株表示。標準曲線方程式為Y=6403.2X+234.73(Y為HPLC所測峰面積,X為異硫氰酸苯酯濃度μmol/mL),相關系數r=0.9993。

1.2.7 黒芥子酶活性的測定 根據Kim等[15]的方法稍作修改。取0.1 g種子和10株芽苗,各用3.0 mL磷酸緩沖液(0.1 mol/mL,pH6.5)冰浴研磨,4 ℃下10000×g離心15 min,上清液即為粗酶液。各取500 μL粗酶液分別與500 μL去離子水和500 μL 0.2 mg/mL烯丙基硫苷混合均勻,加去離子水的樣直接沸水滅酶5 min,加烯丙基硫苷的樣于37 ℃水浴反應15 min后沸水滅酶5 min,用葡萄糖試劑盒測定葡萄糖的含量。以每分鐘被黒芥子酶轉化生成1 nmol葡萄糖為1個酶活力單位,酶活單位為U/株。

1.3 統計學處理

實驗設3次生物學重復,各指標測定設3次技術重復,結果以x±SD表示。采用Sigmaplot 12.0作圖,實驗數據采用統計分析軟件SPSS 17.0進行統計分析,均值間比較采用Duncan’s多重比較,在0.05水平上進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 芝麻菜芽苗芽長、株重及含水率的變化

“東升”的芽長(圖1)、鮮重(圖2)始終高于“板葉”。兩者鮮重在發芽前4 d迅速增加,發芽后4 d有所減緩。發芽前2 d內“板葉”和“東升”的含水率均迅速升高,分別是發芽初始的1.57倍和1.64倍,4 d后變化趨于平緩,兩品種含水率均無顯著差異(p>0.05),發芽8 d后含水率分別為91.94%和91.88%(圖3)。

圖1 兩種芝麻菜種子發芽過程中芽長變化Fig.1 Changes of sprout length of Banye and Dongsheng rocket during germination注:不同小寫字母表示不同發芽時間下 差異顯著(p<0.05),圖2～圖7同。

圖2 兩種芝麻菜種子發芽過程中鮮重變化Fig.2 Changes of sprout fresh weight of Banye and Dongsheng rocket during germination

圖3 兩種芝麻菜種子發芽過程中含水率變化Fig.3 Changes of the rate of water content of Banye and Dongsheng rocket during germination

種子吸漲后開始萌發,胚芽突破種皮,隨著發芽時間的延長,胚得到充分發育,各種內源酶被激活或合成,大分子有機物分解為小分子物質,為芽苗生長提供物質和能量。同時,細胞不斷分裂、分化,吸水量也迅速增加,具體表現為芽長、株重及含水率的逐漸增長,在其他芽苗類蔬菜中也有相似的變化[16-17]。

2.2 游離氨基酸及可溶性糖含量

如圖4所示,發芽過程中“板葉”和“東升”芝麻菜芽苗中游離氨基酸含量呈相似的變化趨勢,且“東升”始終高于“板葉”。兩者含量均在0 d時最低,分別為1.01 μg/株和1.19 μg/株,然后急劇升高,2 d時分別為0 d的4.22倍和5.24倍,隨后逐天下降,在第6～8 d時又逐漸上升并達到最高值,分別為7.68 μg/株和7.64 μg/株。游離氨基酸是在細胞中以游離狀態存在,是植物根部與土壤間氮素循環和植物體內氮素儲存的主要形態,能反應植物氮素營養狀況[18]。本研究中,芝麻菜種子發芽初期(0～2 d),游離氨基酸含量顯著上升,可能是因為種子中貯藏的蛋白質在發芽初期被分解成可溶的小分子蛋白質或氨基酸,便于運輸及合成新的蛋白質[19]。后隨著發芽時間延長,光合作用被啟動,相關酶活增強,游離氨基酸等小分子在相關酶的催化下,又再度合成新的蛋白或其他含氮物質。

圖4 兩種芝麻菜種子發芽過程中游離氨基酸變化Fig.4 Changes of free amino acid content of Banye and Dongsheng rocket during germination

由圖5可知,在發芽過程中,“板葉”和“東升”兩品種芝麻菜芽苗中可溶性糖的含量總體上先上升后下降,均在第6 d達到最高值,分別達到216.8 μg/株和203.5 μg/株,較0 d時增加1.80和1.25倍。發芽前4 d,“東升”芝麻菜芽苗中可溶性糖含量高于“板葉”,而發芽6 d后,“板葉”則高于“東升”。兩種芝麻菜中可溶性糖含量變化呈現單峰曲線,這與劉浩榮[20]等對油菜在不同生育期的可溶性糖變化有類似的趨勢?？赡茉驗榉N子萌發過程中,生命活動所需的能量主要依靠自身貯藏的物質,體內儲存的淀粉被分解為小分子糖類以供芽苗的生長。發芽后期,生命活動旺盛,新的組織、器官合成,呼吸作用和光合作用均增強,各種小分子的糖類減少,用于新物質的合成[21]。

表1 兩種芝麻菜種子發芽過程中硫苷含量變化Table 1 Changes of GLs content of Banye and Dongsheng rocket during germination

圖5 兩種芝麻菜種子發芽過程中可溶性糖含量變化Fig.5 Changes of soluble sμgar content of Banye and Dongsheng rocket during germination

注：GLs：硫代葡萄糖苷(硫苷)，Glucosinolates；GRA：4-甲基亞磺酰-丁基硫苷，Glucoraphanin；GER：4-甲硫基-丁基硫苷，Glucoerucin；DIM：聚-4-巰丁基硫苷，Dimer-4-mercaptobutyl；-：未檢測出；同列小寫字母不同表示同一品種在在不同發芽時間下有顯著性差異(p<0.05)。

2.3 硫苷代謝

2.3.1 硫苷含量 “板葉”和“東升”兩品種種子中均只檢測到GRA和GER兩種GLs,而在發芽后,主要檢測到GRA、GER和DIM三種GLs(表1),與Kim等[6]的研究結果相似。兩品種中GLs總含量均呈先升高后降低趨勢,在第2 d達到最高,且顯著高于其他發芽時間(p<0.05),分別為初始時的1.20倍和1.91倍,隨后逐天降低,發芽8 d后僅為53.74 nmol/株和55.87 nmol/株。發芽前2 d,“東升”品種中GLs總含量均遠高于“板葉”,在0、2 d分別是其1.47倍和2.34倍,而從第4 d開始,兩者的GLs總含量在相同的發芽時間差異很小。

由表1可知，“板葉”中GRA含量在發芽過程中呈先下降后上升再下降的變化趨勢,其中,第2 d芽苗GRA含量較0 d降低了26.42%,4 d時GRA含量最高,達到37.68 nmol/株,是0 d時的3.63倍,第8 d含量最低,僅為14.65 nmol/株。GER含量則逐漸降低,第8 d僅為0 d時的5.91%。DIM則是發芽后才出現,隨著芽苗的生長逐漸減少,8 d時其含量僅為2 d時的34.98%。

“東升”在發芽過程中,GRA、GER、DIM三種GLs變化趨勢相同,均呈先上升后降低趨勢。GRA在萌發第2 d較第0 d增加了5.68倍,第4、6 d較第2 d分別下降46.84%和88.85%,第8 d僅為15.03 nmol/株。GER也在第2 d含量最高,分別是0 d時的1.64倍和8 d時的65.75倍,不同發芽時間均有顯著性差異(p<0.05)。DIM在發芽后才檢測到,在第4 d達到峰值后逐漸下降,8 d時其含量為4 d時的50.55%。

種子中GER占總GLs的95%～97%,DIM則是發芽后才出現。隨著芽苗生長,DIM逐漸占據主導地位,說明在發芽過程中GER的下降速度最快。有研究表明,在甘藍[22]和蘿卜[10]種子發芽過程中GRA含量及總硫苷含量逐漸下降,而本實驗發現GRA含量及總硫苷含量均呈現先上升后下降趨勢?？赡茉蚴怯嬃繂挝徊煌?本實驗以株計量而其他學者以克計量,芽苗生長過程中水分增多,以克計算會受到水分的干擾。硫苷在種子發芽過程中存在著復雜的合成、分解及轉化過程[23],發芽初始階段硫苷的合成速率大于分解速率,使硫苷含量在一定程度上表現出上升的趨勢,并且不同種類的硫苷也會相互轉化;后隨著芽苗的生長,部分硫苷作為硫源被分解,用于芽苗的生長代謝[17],致使總硫苷不斷下降。

2.3.2 黑芥子酶活性及異硫氰酸鹽含量 “板葉”的MYR活性在0 d時最低,發芽4 d時達到3.70 U/株且顯著高于其他時間點(p<0.05)(圖6),隨后逐漸降低,2、6和8 d時酶活性無顯著差異(p>0.05)。在“東升”中,發芽初期MYR活性迅速升高,2 d時達到5.70 U/株,是0 d時的10倍,隨著發芽時間延長酶活逐漸降低,但仍顯著高于0 d。發芽4、6 d無顯著差異,8 d時又有所升高,為3.24 U/株。Guo等[24]的研究顯示西蘭花芽苗在發芽過程中MYR活性逐漸增強,而Willianms等[25]的研究則顯示發芽2 d其活性達到最高,3～7 d無顯著差異。Yuan等[26]發現蘿卜芽苗在發芽過程中酶活先增強后下降,在第5 d時最高。這些結果表明發芽可以提高黒芥子酶的酶活,種子吸水萌芽后,與硫苷合成代謝相關的酶被激活,初始階段MYR活力升高。而酶活表現出的變化差異可能與品種和酶活的表示方法有關,前人用的是比活或每克樣品的活性,而本文用的是每株樣品的活性。

圖6 兩種芝麻菜種子發芽過程中MYR活性變化Fig.6 Changes of MYR activity of Banye and Dongsheng rocket during germination

在MYR作用下GLs發生水解產生ITCs,本研究發現在不同的發芽時間節點,除6 d外,“東升”芝麻菜芽苗的ITCs形成量高于“板葉”(圖7)。在發芽初始階段,“板葉”中ITCs形成量升高較快,于第4 d達到最高,為0 d的3.68倍,與第6 d無顯著差異(p>0.05),8 d時含量減少但仍顯著高于0 d(p<0.05)?！皷|升”在0 d時ITCs形成量最低且不同時間間均有顯著差異,在第4 d時達到最高值89.76 nmol/株。其他學者在甘藍芽苗[22]的研究中發現發芽第1 d ITCs形成量達到最高。這可能與所選實驗材料不同、所選時間節點不同及計量單位不同有關。初始階段,種子進入萌芽狀態,體內相關代謝途徑被激活,且硫苷含量及MYR活性升高,所以形成更多的ITCs。隨著發芽的進行,硫苷急劇減少,ITCs形成量減少。

3 結論

本研究通過比較兩個芝麻菜品種在發芽過程中的生理生化與硫苷代謝的變化,發現發芽可以有效提高種子的品質。芽苗生長過程中儲存性糖類物質先于蛋白質被降解，硫苷不斷降解，黑芥子酶活性與異硫氰酸鹽的形成存在時空差異。綜合比較,“東升”的植株大小、含有的營養物質、GLs及ITCs含量較“板葉”更高,更為優秀。因芽苗中主要關注的功能性成分為ITCs,最佳發芽天數選為4 d。目前對芝麻菜相關的功能性食品的研究較少,芽苗菜作為一種廉價易得型食物具有良好的開發前景,可以進一步研究其發芽條件從而獲得富含ITCs的優質芽苗菜,如控制溫度、噴施外源物質、紫外照射等。

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