食品黃曲霉毒素總量檢測方法的研究與應用

王亞楠, 王曉斐,王自良*

1(河南科技學院 動物科技學院，河南 新鄉，453003) 2(河南科技學院 新科學院，河南 新鄉，453003)

黃曲霉毒素(aflatoxin，AF)是由黃曲霉(Aspergillusflavu)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)經聚酮途徑所產生的含有二呋喃環和氧雜萘鄰酮結構相似的一組有毒次生代謝產物[1]。AF對人體健康具有急性、慢性、致癌、免疫抑制等多種毒性危害作用，自然條件下產生的AF主要包括B1、B2、G1、G2四種，且這4種毒素殘留對人體健康的毒性往往具有協同和加性效應，實施黃曲霉毒素總量(total aflatoxins，TAFs)檢測已成為當前食品質量安全檢測領域發展的必然趨勢[2]。針對這一新的限量要求及在食品國際貿易中的作用，世界上許多國家都展開了TAFs最大殘留限量(maximum residue limit，MRL)及檢測方法的研究，至 2013 年已有 91 個國家制定了TAFs在不同食品中的MRL，如國際食品法典委員會(CAC)和美國食品與藥物監督管理局(FDA)等規定食品中TAFs的MRL為15 μg/kg，日本為10 μg/kg，歐盟(EC)為4 μg/kg，我國現行的《GB 2761—2011 食品中真菌毒素限量》標準中規定了AFB1的限量標準，尚未涉及TAFs限量要求，但在《GB/T 5009.23—2006 食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測定》標準中規定了TAFs限量檢測方法[3]。

食品中TAFs檢測方法目前主要有生物分析法(bioassay，BA)、理化分析法(physicochemical analysis，PCA)和免疫分析法(immunoassay，IA)三種，本文就食品中TAFs檢測方法的研究進展、應用情況、技術優勢與缺陷及今后的發展趨勢進行探討，旨在為食品TAFs檢測方法的選擇使用和發展完善提供借鑒和思路。

1 生物分析法

BA的基本原理是通過生物體實驗來驗證樣品的毒性部位和毒性機理，以染毒動物攝入后膽管異常增生程度為主要根據，判斷毒物含量的多少[4]。此法最早應用于雛鴨，后經不斷發展，派生出其他的生物分析法，主要包括雞胚法、軟體動物卵試驗法、組織培養法、豚鼠鑒定法、皮膚毒性實驗法、種子發芽實驗法、微生物鑒定法等。BA的優點是對樣品純度要求不高，設備要求簡單。其缺點是專一性不強，靈敏度較低，操作繁瑣，費用較高，目前除在機體對毒素耐受性和毒理學研究應用外，實際檢測中已很少使用[5]。

2 理化分析法

目前各國主要采用的理化分析方法有薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)、高效液相色譜-串聯質譜法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)、時間分辨熒光分析法(time resolved fluoroisnmunoassay，TRFIA)等，分述如下。

2.1 薄層色譜法

TLC的基本原理是將樣品經過提取、濃縮、薄層分離后，在365 nm紫外激發顯色，其中B1、B2產生藍紫色熒光，G1、G2產生黃綠色熒光，以此來確定TAFs，為半定量分析方法[6]。該方法于1963年由BROADBENT等[7]建立，后經不斷發展，根據其展開方法又分為單向展開法和雙向展開法，后者靈敏性更好。TCL的優點是所需儀器設備簡單，操作簡便，易于普及，是TAFs檢測較為經典的方法，目前國內外仍在使用。其缺點是樣品前處理復雜，操作繁瑣，耗時耗力，干擾因素多，測定結果的準確性差。ROBB等[8]采用該方法檢測樣品中TAFs，B1、B2、G1、G2的檢測限(limit of detection，LOD)均可達到0.5 μg/kg。1990年，該方法被美國官方分析化學家協會(Association of Official Agricultural Chemists，AOAC)列為標準方法[9]。我國國家標準中《食品黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測定》仍采用TLC法[10]。OTTA等[11]于2000年研究報道了過壓薄層色譜法(overpressured-layer chromatography，OPLC)，可同時檢測食品中B1、B2、G1和G2，實現了TAFs檢測，檢測靈敏度達1 μg/kg，符合歐盟對食品TAFs的MRL標準。

2.2 高效液相色譜法

HPLC的原理是樣品經過凈化后，在適宜的流動相下，采用反相C18色譜柱對TAFs進行分離，依據每種AF的熒光特性，在熒光檢測器作用下，實現TAFs的定性和定量檢測[12]。該方法由RAO等于1973年建立，可同時檢測B1、B2、G1、G2，LOD為1 μg/kg，后經不斷發展，派生出正相液相色譜法(normal phase HPLC，NP-HPLC)和反相液相色譜方法(reversed phase HPLC，RP-HPLC)，其中RP-HPLC 的靈敏性與穩定性更好，RP-HPLC更受使用者青睞，但RP-HPLC對AF分子具有選擇性，即對B2、G2的靈敏度高，而B1和G1的熒光強度在含水的溶劑中容易發生淬滅致使靈敏度很低甚至無法檢出，需要進行柱前或柱后衍生以增強其熒光性[13]。HPLC的優點是分辨率高，結果可靠，靈敏度高，能夠自動化操作，適于大批量樣品的定性、定量和多元分析，是國內外食品TAFs定量檢測方法中最權威、最易被接受的方法。其缺點是儀器設備昂貴，技術水平要求高，樣品需要進行前處理，不適合快速、現場檢測[14]。朱鵬飛等[15]采用三氟乙酸柱前衍生-RP-HPLC測定食品中TAFs，結果表明，對B1、G1的LOD為0.1 μg/kg，對B2、G2的LOD為0.03 μg/kg，精密度為0.13%～9. 5%，加標回收率為70%～106%。吳燕等[16]采用化學柱后衍生-RP-HPLC測定糧谷類食物中TAFs，結果表明，對B1、B2、G1、G2的LOD分別為0.50 μg/kg、0.15 μg/kg、0.50 μg/kg和0.15 μg/kg，加標回收率為86.7%～97.2%。無論柱前或柱后衍生，RP-HPLC靈敏度高，重現性好，能夠很好滿足食品中TAFs檢測的需要。

2.3 高效液相色譜-串聯質譜法

HPLC-MS/MS的基本原理是使用合適的接口技術將HPLC與串聯質譜聯結起來，它將HPLC的高效分離能力和MS的高靈敏度這兩種優勢結合在一起，實現多種化合物的定性和定量分析[17]。HPLC-MS/MS的優點是具有快速，高效，分辨率高，微量進樣和自動化，相比于HPLC，無需進行柱前或柱后衍生處理，操作相對簡捷，有很大的優勢，使用越來越廣泛。其缺點是儀器設備昂貴，專業技術人員水平要求高[18]。MCCULLUM等[19]用HPLC-MS/MS檢測食品TAFs，結果表明，檢測范圍為0.006～3.0 μg/kg，對B1、B2、G1、G2的LOD分別為0.001 2、0.001 2、0.001 2 μg/kg和0.003 1 μg/kg，加標回收率為97.0%～108.0%。王巖松等[20]用HPLC-MS/MS檢測谷物中TAFs，結果表明，對B1、B2、G1、G2的LOD分別為0.1、0.1、0.2 μg/kg和0.3 μg/kg，加標回收率為74.6%～89.6%，通過實際檢測應用，谷物樣品中B1、G1殘留量為5.86 μg/kg和8.6 μg/kg，B2、G2未檢出。

3 免疫分析法

目前已建立的TAFs免疫分析法有酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbant ssay，ELISA)、膠體金免疫層析法(gold immunochromatographic assay，GICA)、熒光免疫分析法(fluorescence immunoassay，FIA)和免疫傳感器法(immunosensor，IS)等。

3.1 酶聯免疫吸附法

ELISA檢測小分子半抗原的原理是將抗原(或抗體)包被于酶標板，同時加入抗體與待測半抗原(或酶標半抗原與待測半抗原)，抗原與待測半抗原(或酶標半抗原與待測半抗原)共同競爭抗體的抗原結合位點，洗板后酶標板上僅留下抗原與抗體(或酶標半抗原與抗體)反應結合的抗原抗體復合物，復合物的量與待測半抗原的量呈負相關，通過酶底物催化顯色，根據顏色的深淺有無對待測半抗原進行定性和定量檢測。分析方法包括間接競爭ELISA(indirect competitive ELISA，icELISA)和直接競爭ELISA(direct competitive ELISA，dcELISA)兩種技術模式。ELISA的優點是快速方便、操作簡單、成本較低、篩檢樣品量大。缺點是由于抗體與酶均屬生物活性物質，需要低溫保存，易受環境和反應條件影響，穩定性差；存在非特異性反應，檢測結果易出現假陽性問題；樣品萃取需要脫脂、脫鹽、調節pH等，樣品前處理復雜。LI等[21]用篩選出的10C9細胞株所分泌的mAb建立了TAFs ciELISA檢測方法，檢測范圍為2.1～3.2 μg/kg，添加回收率為87.5%～102.0%。KIM等[22]用篩選出的8H10細胞株所分泌的mAb建立了TAFs dcELISA檢測方法，檢測范圍為0.2～25 μg/kg，添加回收率為79.18%～91.27%。計融等[23]用自制的TAFs mAb研制出食品TAFs快速檢測ELISA試劑盒，其對FAFs B+G標準品的LOD為0.26 μg/kg，檢測范圍為0.26～20.00 μg/kg，對Bl、B2、Gl和G2的CR分別為100%、57.5%、104.0%和19.0%，對玉米3個加標回收率分別為98.63%、94.56%和112.05%，對花生的3個加標回收率分別為88.66%、87.50%和85.60%。目前，國內外許多公司研發出商品化、標準化的TAFs檢測ELISA試劑盒，在靈敏性、特異性、準確性、穩定性、適用性等方面均有良好的表現，已成為TAFs檢測的重要手段。如ZHENG等[24]用新加坡Biomin公司的TAFs ELISA試劑盒檢測玉米、高粱、小麥、大米、大豆、花生和棉籽等樣品，LOD為4.0 μg/kg，檢測范圍為4.0～40.0 μg/kg。IQBAL等[25]用美國Romer Labs科技公司的TAFs ELISA試劑盒對120個糙米樣品進行檢測，并用TLC、HPLC和LC-MS/MS進行驗證，結果表明，ELISA試劑盒的LOD為1.0 μg/kg，檢測范圍為1.0～40.0 μg/kg，加標回收率范圍為83.2%～90.4%，實際檢出陽性88個，樣品TAFs值為1.24～11.68 μg/kg，檢測結果與TLC、HPLC和LC/MS-MS的檢測結果完全一致，檢測靈敏度ELISA試劑盒優于TLC，但稍低于HPLC和LC/MS-MS。

3.2 膠體金免疫層析法

GICA檢測小分子半抗原的原理是當樣品中不含小分子半抗原時，游離的金標抗體與固定在膜上的半抗原結合形成紅色條帶，檢測結果呈陰性；當樣品中含有小分子半抗原時，其與游離的金標抗體結合，抑制了金標抗體與固定在膜上的半抗原結合，樣品中小分子半抗原的含量決定了膜上紅色條帶的深淺或有無，檢測結果呈陽性。GICA的優點是快速、簡便、特異性強、穩定性好、可現場檢測、篩檢樣品量大。缺點是只能定性或半定量檢測，無法準確定量；檢測靈敏度不及ELISA、HPLC和LC/MS-MS[26]。ANFOSSI等[27]利用自主研制的B族、G族混合單抗研制出TAFs檢測試紙(test strip)，LOD為1.0 μg/kg，檢測范圍為1.0～40.0 μg/kg，用test strip對25個玉米樣品進行檢測，并用HPLC進行確證，檢測結果與HPLC完全相符。ZHANG等[28]用自主制備的1C11雜交瘤所分泌的單一通用單抗研制出TAFs test strip，LOD為0.46 μg/kg，對Bl、B2、Gl和G2的LOD分別為0.03 μg/kg、0.06 μg/kg、0.12 μg/kg和0.25 μg/kg，用test strip檢測花生樣品，對檢出的20個陽性樣品分別測定TAFs污染組分，并用HPLC進行確證，結果表明，同時檢出Bl、B2、Gl和G2污染樣品0個，同時檢出Bl、B2和Gl污染樣品3個，同時檢出Bl和B2污染樣品18個，只檢出Bl污染樣品1個，只檢出B2污染樣品1個，檢測與HPLC完全一致。徐振斌等[29]應用美國Clover Icheck公司的TAFs test strip對市售96個玉米樣品進行篩檢，檢出的5個陽性樣品用HPLC確證，Test strip的LOD為1.0 μg/kg，相對標準偏差(RSD)小于15.2%，加標回收率范圍為82.4%～95.8%，test strip的檢測結果與HPLC的檢測結果完全一致。

3.3 熒光免疫分析法

FIA的原理是基于熒光未標記的抗原(Ag)和熒光標記抗原(Ag-F)共同競爭結合抗體(Ab)的有限位點而實現的免疫分析方法，目前已建立的用于TAFs檢測的FIA主要包括熒光偏振免疫分析法(fluorescence polarization immunoassay，FPIA)和時間分辨熒光免疫分析法(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)兩種。

3.3.1 熒光偏振免疫分析法

FPIA檢測小分子半抗原的原理是用熒光物質標記抗原或抗體，抗原抗體進行特異性結合反應后，依據抗原抗體結合物熒光偏振程度的差異，用競爭性方法測量待測樣品中小分子化合物的含量。分析方法包括置換(single-reagent FPIA)、停流FPIA(stopped-flow FPIA)和有機介質FPIA(organic medium FPIA)三種技術模式。FPIA的優點是高通量、速度快、操作簡便、檢測成本低、定量檢測和可大批量快速篩選樣本。缺點是由于存在基質效應導致有假陽性、由于需要專門熒光偏振設備導致儀器成本高、由于多采用杯式檢測裝置導致試劑用量大且檢測效率低[30]。NASIR等[31]用研制的TAFs族特異性單抗建立FPIA，檢測谷物樣品包括玉米、高粱、花生油、花生醬中TAFs殘留，并與HPLC比較確證，添加回收試驗結果表明，TAFs混合物Bl/B2/Gl/G2按重量比為7/1/3/1，FPIA的LOD為1.0 μg/kg，檢測范圍為1.0～32.0 μg/kg，檢測結果與HPLC的檢測結果完全一致，研究結論為FPIA可用于TAFs檢測。SHENG等[32]用廣譜性較強的抗AFB1單抗建立FPLA，其對AFB1的IC50值為23.33 μg/kg，LOD為13.12 μg/kg，對Bl、B2、Gl和G2的CR分別為100%、65.7%、143%和23.5%，所建立的FPLA可用于TAFs的檢測。

3.3.2 時間分辨熒光免疫分析法

TRFIA檢測小分子半抗原的原理是使用鑭系元素(Eu、Tb、Sm、Dy等)長效熒光標記物，在關閉激發光后再測定熒光強度的分析方法。TRFIA的優點是操作簡便、靈敏度高、檢測線性范圍寬、重復性好、試劑保存時間長、無污染危害等，TRFIA是目前公認的最為敏感的免疫學分析方法。缺點是試劑純度要求較高、鑭系元素離子螯合物的合成難度較大、標記多個靶標物難度大進而多元檢測受到局限等[33]。DEGAN等[34]最早研究報道，以Eu3+標記廣譜性的AFB1多克隆抗體，建立TRFIA用于TAFs檢測，并與ELISA方法進行了比較，對TAFs的LOD為0.004 μg/kg，檢測范圍為0.004～4 μg/kg，其靈敏度高于ELISA。WANG等[35]用Eu3+納米球標記廣譜性的TAFs單抗，建立了用于TAFs檢測的金納米TRFIA(Eu-Nano-TRFIA)，該方法檢測TAFs包括Bl、B2、Gl和G2四種，檢測時間12 min，LOD為0.16 μg/kg，檢測范圍為0.16～30.0 μg/kg，加標回收率為83.9%～113.9%，變異系數(CVs)為3.5%～8.8%，對397個飼料原料樣本進行實際檢測，陽性檢出率為78.3%，陽性樣本TAFs濃度值為0.50～145.30 μg/kg，其中棉籽餅種TAFs含量最高為18.48 μg/kg。該方法與HPLC、ELISA、GICA相比，具有靈敏、準確、快速等優點，能夠更好地滿足食品FA總量污染殘留檢測的需求。

3.4 免疫傳感器法

IS檢測小分子半抗原的原理是IS由抗原或抗體與換能器組成，待測樣品中小分子半抗原與固化在傳感器表面的特異性抗體反應形成抗原抗體結合物，結合物量的大小決定IS的電荷信號，換能器根據電荷信號的強弱變化，達到檢測待檢半抗原的目的。IS根據傳感技術原理可分為光學免疫傳感器、電化學免疫傳感器、熱量免疫傳感器和質量免疫傳感器四種技術模式[36]，目前已建立了用于TAFs檢測的光學免疫傳感器[37]和電化學免疫傳感器[38]。IS用于TAFs檢測的優點是攜帶方便、操作簡單、成本較低、可自動化檢測。其缺點是抗原抗體固化技術不夠成熟、靈敏度與精密度需要進一步提高、難以實現多元檢測和難以實現批量生產[39]。KONG等[40]用納米金研制出半定量和定量IS，實現了霉菌毒素的多元IS檢測，可同時檢測霉菌毒素20種，其中選擇敏感、特異的TAFs族廣譜性單抗，可同時檢測Bl、B2、Gl和G2，LOD為0.25 μg/kg，檢測范圍為0.25～4.0 μg/kg。

4 結語

比較各種食品中TAFs檢測方法，BA法專一性差，靈敏度低，主要用于定性分析，現已很少應用；PCA 法具有靈敏、特異、準確等優點，但存在儀器設備昂貴、技術要求高、成本高、周期長，難以實現現場檢測與快速檢測的行業需求；IA法具有快速、簡便、特異性強、穩定性好、可現場檢測、篩檢樣品量大等優勢，是實現TAFs檢測的主要技術手段和發展趨勢。在IA法的選擇與建立方面，隨著抗體標記技術如酶標記、納米金標記、熒光標記、量子點標記等的逐步完善和新的標記技術如鑭系元素標記等的不斷出現，IA技術正向靈敏、快速、準確、高效、操作簡單的方向發展，將在TAFs檢測中發揮重要作用，對于推動我國食品安全免疫檢測技術的快速發展具有積極意義。

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