尖吻蝮蛇凝血酶在大鼠體內的藥代動力學*

鄧沁，劉宏，蘇薇薇，彭維，吳忠，王永剛，姚宏亮

(中山大學生命科學學院∥廣東省中藥上市后質量與藥效再評價工程技術研究中心，廣東 廣州 510275)

尖吻蝮蛇凝血酶(Haemocoagulase Acutus，簡寫為Halase)是本團隊從尖吻蝮蛇蛇毒中分離純化的一種類凝血酶，研究表明其具有較強的止血作用，且無毒[1-6]。本文采用125Ⅰ標記的放射性同位素法(RA)、三氯醋酸沉淀結合放射性檢測法(TCA-RA)研究尖吻蝮蛇凝血酶在大鼠體內的藥代動力學，為臨床應用提供參考，現報道如下。

1　材　料

1.1　試劑與儀器

尖吻蝮蛇凝血酶，實驗室自制，純度大于95%。三氯醋酸，上?；瘜W試劑采購供應站。生理鹽水，中國大冢制藥有限公司。超純水，用日本密理博公司的純水器制備。微機多探頭γ-計數器：北京核儀器廠，型號：FJ630G/12。

1.2　實驗動物

Wistar大鼠，雌雄兼用，體質量200 g左右，由軍事醫學科學院四所動物實驗中心提供，動物生產合格證醫動字第005號。

2　方法與結果

2.1　125Ⅰ-Halase的制備

標記：采用氯胺T法進行尖吻蝮蛇凝血酶的125Ⅰ標記。

純化：使用Sephadex G50凝膠柱分離純化125Ⅰ標記物，收集125Ⅰ-Halase 測定放射比活性為52.3 mCi/mg (1 935 MBq/mg)，質量濃度為0.84 mCi/mL(31.1 MBq/mL)，放化純度>95%。制備125Ⅰ-Halase色譜圖見圖1。

生物活性：測定125Ⅰ標記后的尖吻蝮蛇凝血酶在標準血漿中的凝血時間，以檢驗標記后的Halase生物活性。結果表明標記后不影響樣品的生物活性。HPLC分析也證明標記前后色譜行為未改變，見圖2。

圖1　125Ⅰ-Halase色譜圖Fig.1　125Ⅰ-Halase chromatogram

圖2　Halase標記前后色譜比較Fig.2　Comparison between labeled Halase and unlabeled HalaseA: 標記前的Halase色譜圖; B：標記后的Halase色譜圖

2.2　測定方法的建立和驗證

2.2.1標準曲線的制備以質量濃度為0.24 μg/mL的尖吻蝮蛇凝血酶(含放射性6.28 μCi/mL)配置標準液，以生理鹽水為溶劑，配成質量濃度為0.03、0.06、0.12、0.30、0.60、1.20、3.00和6.00 ng/mL的標準液，各取200 μL標準液置于測定管中，在γ-計數器上測定1 min，將質量濃度與計數值(cpm)繪成標準曲線，標準曲線方程為：Y=25.8+5 660.8X(n=8，r=0.999 9)。

2.2.2校正曲線的制備

(1)RA法制備校正曲線：按標準曲線的尖吻蝮蛇凝血酶質量濃度和相應的125Ⅰ-Halase制備測定血清中尖吻蝮蛇凝血酶的校正曲線，結果顯示質量濃度與cpm呈直線相關，校正曲線為：Y=56.3+5 479.8X(n=8，r=0.999 9)。質量濃度為0.12、0.60、6.00 ng/mL時，從血清中用RA法直接測定尖吻蝮蛇凝血酶的回收率，結果見表1 ；其日內、日間測定精密度結果見表2；本法最低能檢測到0.03 ng /mL。

表1　血清中125Ⅰ-Halase的回收率(Mean±SD， n=5)Table 1　Percent recovery of 125Ⅰ-Halase in serum (Mean±SD， n=5)

表2　血清中125Ⅰ-Halase的測定精密度(Mean±SD， n=5)Table 2　Precision of 125Ⅰ-Halase in serum (Mean±SD， n=5)

同法制備測定心、腦、肝、腎、肌肉組織中125Ⅰ-Halase的校正曲線，以及尿、糞、膽汁的校正曲線，結果分別為：心：Y= 12.5+5 526.0X(n=8，r=0.999 9)；肝：Y= 98.3+5 225.3X(n=8，r=0.999 5)；腎：Y=61.4+5 350.1X(n=8，r=0.999 7)；腦：Y= 13.3+5 542.5X(n=8，r=0.999 7)；肌肉：Y= 68.5+5 338.8X(n=8，r=0.999 9)；尿：Y=219.8+4 915.1X(n=8，r=0.999 5)；糞：Y=138.0+4 882.7X(n=8，r=0.999 9)；膽汁：Y= 17.6+5 653.4X(n=8，r=0.999 9)。

(2)TCA-RA法制備血清校正曲線：按上述血清RA法校正曲線的制作方法，然后每管各加入φ=20%三氯醋酸(TCA)0.2 mL，振蕩，離心(3 000 r/min, 10 min)，棄去上清液，測定沉淀物中尖吻蝮蛇凝血酶的含量，結果表明濃度與cpm呈直線相關，校正曲線為：A=24.7+4 197.7C(n=8，r=0.999 8)。

同法制備測定心、腦、肝、腎、肌肉三氯醋酸沉淀物中125Ⅰ-Halase的校正曲線，結果分別為：心：A= 43.5+3 892.3C(n=8，r=0.999 8)；肝：A= 97.2+3 758.2C(n=8，r=0.999 3)；腎：A= 70.8+3 811.1C(n=8，r=0.999 5)； 腦：A= 45.4+3 994.0 C (n=8，r=0.999 3)；肌肉：A= 86.1+3 969.4C(n=8，r=0.999 4)。

2.3　大鼠靜脈給藥三劑量的藥代動力學研究

2.3.1 RA法

(1)總放射性濃度：本試驗根據藥效試驗所用劑量，在安全、有效的劑量范圍內，設計了大鼠靜脈給藥尖吻蝮蛇凝血酶 0.6、1.2和2.4 μg/kg3個劑量組，每100 g體質量給藥體積為0.5 mL，每100 g體質量含125Ⅰ-Halase 3.142 μCi。給藥后2、5、15、30 min，1、2、3、4、6、8、12、24、36和48 h 采血，分離出血清，2～30 min各取100 μL血清置于測定管中，1～48 h各取 200 μL血清置于測定管中，測定1 min的放射性。每一時間點6只大鼠，3 雌 3 雄。三劑量血藥質量濃度-時間變化趨勢比較見圖3。

圖3　用RA法測得的三劑量的血藥質量濃度-時間曲線比較(Mean±SD， n=6)Fig.3　Comparison of plasma concentration-time curves of three doses using RA method(Mean±SD， n=6)

(2)藥代參數：將實驗數據用中國藥理學會數學藥理專業委員會的3P97實用藥代動力學計算程序自動擬合c-t曲線，計算所得藥代動力學參數結果見表3。用RA法所測得的iv血清中總放射性的消除半衰期t1/2β8～10 h，AUC與劑量呈正相關，r為0.999 8。

表3　 由總放射性測定求得的尖吻蝮蛇凝血酶的藥代參數

2.3.2TCA-RA法

(1)血清中尖吻蝮蛇凝血酶質量濃度：本試驗設計方案與總放射性測定方案相同，給藥劑量與采血時間均同上，采血后取血清200 μL，加等量的φ=20%三氯醋酸，振蕩，3 000 r/min，離心10 min，移走上清液，測定1 min沉淀物中的放射性。計算出尖吻蝮蛇凝血酶的質量濃度，每一時間點測定6只大鼠， 3雌3雄。三劑量血藥濃度-時間變化趨勢比較見圖4。結果可見各時間點的尖吻蝮蛇凝血酶質量濃度與劑量相關，質量濃度比總放射性低，消除也比總放射性快。

圖4　用TCA-RA法測得的三劑量的血藥質量濃度-時間曲線比較(Mean±SD， n=6)Fig.4　Comparison of plasma concentration-time curves of three doses using TCA-RA method(Mean±SD， n=6)

(2)藥代參數：將實驗數據用中國藥理學會數學藥理專業委員會的3P97實用藥代動力學計算程序自動擬合c-t曲線，計算所得藥代動力學參數結果見表4。用TCA-RA法所測得的iv血清沉淀物放射性的消除半衰期t1/2β5～6 h，AUC與劑量呈正相關，r為0.999 0。

表4　由血清沉淀物含量求得的尖吻蝮蛇凝血酶的藥代參數Table 4　Pharmacokinetic parameters of Halase calculated by serum sediments

2.4　組織分布試驗

2.4.1RA法測定的總放射性的分布大鼠靜脈注射尖吻蝮蛇凝血酶1.2 μg/kg ( 每100 g體質量給藥體積為0.5 mL，每100 g體質量含125Ⅰ-Halase 3.142 μCi)，給藥后5 min、30 min、2 h 、8 h和24 h 處死動物，取全血、腦、心、肺、肝、脾、腎、胃、小腸、肌肉、脂肪、卵巢、子宮和睪丸，每一組織臟器用水按1∶5的比例制成勻漿，取0.4 mL 進行總放射性測定，再根據校正曲線計算出各組織的放射活性含量；每一時間點取樣6只動物，雌雄各半。結果見圖5，從結果來看： 肝、脾和心在給藥后5 min藥物含量最高，其他絕大部分組織在給藥后 30 min藥物含量最高，以后逐漸降低；在各時間點，放射活性以肝組織含藥量顯著高于其他組織，脾、肺、腎、胃、心等組織含藥量較高，腦、脂肪組織含量最低，除肝臟外各組織含藥量都小于同期的血藥含量。

2.4.2TCA-RA法測定的尖吻蝮蛇凝血酶分布在上述試驗的基礎上，對組織臟器進行了尖吻蝮蛇凝血酶原型藥物的測定。取上述實驗所得組織勻漿400 μL，加TCA 400 μL，振蕩，3 000 r/min離心10 min，移走上清液，沉淀物進行放射性測定。求得組織中尖吻蝮蛇凝血酶含量。試驗結果見圖6所列，從結果來看： 肝、脾和心在給藥后5 min藥物含量最高，其他絕大部分組織在給藥后 30 min藥物含量最高，以后逐漸降低；在各時間點，放射活性以肝組織含藥量顯著高于其他組織，脾、肺、腎、胃、心等組織含藥量較高，腦、脂肪組織含量最低。此法與RA法所得結果一致。

圖5　大鼠靜脈注射1.2 μg/kg尖吻蝮蛇凝血酶后用RA法測得的組織分布Fig.5　 Tissue distribution detected by RA method in rats injected with 1.2 μg/kg Halase (i.v.)

圖6　大鼠靜脈注射1.2 μg/kg尖吻蝮蛇凝血酶后用TCA-RA法測得的組織分布Fig.6　 Tissue distribution detected by TCA-RA method in rats injected with 1.2 μg/kg Halase (i.v.)

2.5　排泄試驗

2.5.1尿排泄Wistar大鼠，雌雄各4只，靜脈給藥尖吻蝮蛇凝血酶1.2 μg/kg (每100 g體質量給藥體積為0.5 mL，每100 g體質量含125Ⅰ-Halase 3.142 μCi ) 后放入代謝籠內，收集給藥后0～2、2～4、4～6、6～8、8～12、12～24、24～36、36～48、48～72、72～96 h 的尿樣和糞樣，尿樣稀釋并計量，糞樣用水制成勻漿后計量。取一定量的尿樣置于測定管內，用γ-計數器測定1 min放射活性，見圖7。從尿累計排泄量來看，給藥后96 h內由尿排出的放射量約占給藥劑量的73.52%，表明該藥主要是由尿排泄。

2.5.2糞排泄在尿排泄試驗收集到的糞樣，制成勻漿后，取一定量的糞樣置于測定管內， 用γ-計數器測定1 min放射活性，結果見圖8，在 96 h 內糞累計排泄量占所給藥劑量的 12.13%。

2.5.3膽汁排泄Wistar大鼠6只，雌雄兼用，體質量200 g左右。烏拉坦(1.2 g/kg，ip)麻醉后，膽管插管，iv 給藥Halase 1.2 μg/kg ，收集給藥后0～2、 2～4、 4～6、6～8、8～12 和12～24 h的膽汁，稀釋后計量。取0.2 mL膽汁置于測定管內，用γ-計數器測定1 min放射活性，結果見圖9。給藥后24 h內由膽汁排出的藥量占給藥劑量的4.16%。

圖7　大鼠靜脈注射1.2 μg/kg尖吻蝮蛇血酶后尿排泄曲線Fig.7　Urinary excretion cure of rats injected with 1.2 μg/kg Halase (i.v.)

圖8　大鼠靜脈注射1.2 μg/kg尖吻蝮凝血酶后糞排泄曲線Fig.8　Fecal excretion cure of rats injected with 1.2 μg/kg Halase (i.v.)

圖9　大鼠靜脈注射1.2 μg/kg尖吻蝮蛇凝血酶后膽汁排泄曲線Fig.9　Bile excretion cure of rats injected with 1.2 μg/kg Halase (i.v.)

3　討　論

應用放射性同位素法進行藥代動力學研究時，測定原型藥物是放射性同位素法測定中要解決的關鍵問題，因為藥物進入體內后會被降解，總放射性測定不能代表原型藥物，為此采用TCA沉淀蛋白法，使尖吻蝮蛇凝血酶沉淀下來而分解產物及游離125Ⅰ留在上清液中被除去，以使測定結果盡可能接近原型尖吻蝮蛇凝血酶的濃度。

從RA法和TCA-RA法研究的尖吻蝮蛇凝血酶組織分布表明，肝、脾和心在給藥后5 min藥物含量最高，其他絕大部分組織在給藥后 30 min藥物含量最高，以后逐漸降低，總放射性與原型藥物在各組織分布的大小順序基本一致。其中在大多數時間肝、脾、腎、肺含藥量較高，腦、脂肪含藥量較低。

靜脈注射給藥后96 h內，有給藥總量的73.52%由尿中回收，12.13%由糞中回收，這部分可能與分布到胃腸及膽汁排泄有關，24 h內膽汁累積排泄量為4.16%。尿、糞 96 h 的總回收率達到 85.65%，說明尖吻蝮蛇凝血酶的排泄消除去向已較清楚。因此認為尖吻蝮蛇凝血酶排泄較完全，并主要由尿排泄。

尖吻蝮蛇凝血酶是一種糖蛋白，與血漿蛋白無特異性結合，國外文獻和新藥申報均未見有關蛋白結合報告，而且由于其藥效作用(與血漿蛋白的作用)問題，會影響藥物與蛋白的分離，不便進行游離藥物的測定，因此本研究未測定相關結果。

參考文獻：

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