復合菌發酵臘豆的工藝優化

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(1.揚州大學食品科學與工程學院,江蘇揚州 225000; 2.江蘇省淮揚菜產業化工程中心,江蘇揚州 225000; 3.江蘇天之香食品有限公司,江蘇宿遷 223800; 4.江蘇康旺食品有限公司,江蘇揚州 225000)

臘豆屬于細菌型豆豉的一種。又名納豆、醬豆,即俗稱的水豆豉[1],原產于江蘇宿遷黃墩湖地區,因一般在臘月制作而取名臘豆。臘豆是以豆或豆類制品為原料,經過微生物(例如芽孢桿菌、酵母菌、曲霉菌、乳酸菌等)發酵后分解大豆蛋白質獲得的成品。臘豆色澤醬黃或醬紅色,味道咸鮮適中,口感綿軟,且營養豐富。臘豆中有一類芽孢桿菌能分泌可以溶解血栓的溶栓酶[2],所以具有調節血脂、防止血栓生成的作用。臘豆自古以來就藥食兩用,具有出色的營養功能、調味功能和藥用功能。

中國是大豆的故鄉,現如今臘豆作為一類草根美食已經深深的扎根于老百姓的生活之中。臘豆的制作工藝分為傳統法和工業法兩種,傳統法各有差異而工業法在全國比較統一[3]。我國細菌型臘豆的制作經驗雖很豐富,但目前加工過程中仍有一些不能克服的困難。一是由于細菌型臘豆常由普通老百姓手做,生產過程中各個環節難掌控。二是傳統發酵臘豆pH高,促進部分腐敗微生物的生長,產品安全性降低,影響貯藏期。三是傳統發酵臘豆的口感較差。四是對細菌型臘豆中營養探究的比較少,因常用作調料再次制作銷售的領域相對較窄,加上本身所含營養成分如氨基態氮、游離氨基酸等沒有充分地挖掘,抑制了廣大中國消費者對臘豆的了解,抑制了市場的開拓[4]。

本實驗目的在于通過復合菌發酵改良臘豆的發酵工藝,改善臘豆的營養等指標,延長貯藏期。一方面可以繼續發揚光大臘豆這一中國傳統美食,另一方面可以推動其市場化、標準化、機械化、規?；l展,倡導健康食品消費,改善居民營養健康狀況[5]。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)篩于發酵臘豆中,揚州大學食品微生物中心保藏;黃豆揚州市蘇果超市;營養肉湯培養基:牛肉浸膏10.0 g,蛋白胨10.0 g,氯化鈉5.0 g,蒸餾水1000 mL,pH至7.2～7.4,121 ℃滅菌15 min，固體培養基加瓊脂20.0 g;YPD培養基:酵母浸膏10.0 g,蛋白胨20.0 g,葡萄糖20.0 g,蒸餾水1000 mL,pH調節至5.5,121 ℃滅菌20 min，固體培養基加瓊脂20.0 g;Tris-HCl、三氯乙酸、乙酸、100%乙醇、福林酚試劑、苯、甲醇、異丙醇、氯仿等國藥集團試劑有限公司;所用試劑均為分析純。

SPX-250B-Z型生化培養箱上海博訊實業有限公司;METTLER-TOLEDO FE20K型精密pH計梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司;Sorvall ST 16R型高速冷凍離心機賽默飛世爾科技(中國)有限公司;755S型紫外可見分光光度計上海凌光技術有限公司;HITACH2 L-8500A型氨基酸自動分析儀日本日立公司;DT-00型電子天平美國雙杰兄弟(集團)有限公司;T18型IKA均質機德國ika集團。

1.2　實驗方法

1.2.1臘豆的制作工藝黃豆清洗浸泡(24 h)→蒸煮(100 ℃,20 min)→室溫下冷卻→接菌(100 g煮熟豆子接4 mL混合菌液)→發酵(40 ℃,24 h)→成熟(即臘豆樣品)。

1.2.2菌懸液的制備結合菌落計數,采用分光光度法對三株菌株進行濃度測定,取待用菌株進行3次活化(枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌于營養肉湯培養基中37 ℃培養24 h,釀酒酵母于YPD培養基中30 ℃培養24 h),4 ℃,4000 r/min離心10 min,取沉淀加入滅菌處理過的生理鹽水并調整其濃度至107cfu/mL,4 ℃保存待用。

1.2.3混料設計優化混菌發酵工藝條件采用Design Expert 8.06軟件對3株待用菌株進行復配,根據林榕姍[6]等的研究采用枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的比例邊界范圍為0.2～0.7,釀酒酵母比例邊界為0.1～0.3。

表1　復合菌株混料實驗設計表Table 1　Mixture design of three strains

注：以上處理組中數據表示枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌與釀酒酵母的占總接菌量的比例,CK組為不添加復合菌的處理組,表5同。

1.2.4pH的測定稱取5.0 g臘豆樣品,切碎研磨,加入25 mL蒸餾水,振蕩20 min,使用pH計直接測定。

1.2.5質構的測定取完整顆粒臘豆置于質構儀上進行檢測,采用質構參數為硬度、彈性、咀嚼性和內聚性,測定條件:采用下壓式測定,測定模式和選項:采用直徑50 mm的平底柱形探頭P50,探頭測前速度2.00 mm/s;探頭測定速度 1.00 mm/s,探頭測后速度10. 00 mm/s;探頭進行2次測定,間隔時間:5.00 s;測定距離:20 mm;形變量為:70%;壓力:5.0 g,數據采集速率為200 pps。

1.2.6氨基態氮的測定使用甲醛滴定法,參照GB/T 5009.39-2003進行滴定和計算。

表2　發酵臘豆感官評分表Table 2　Sensory score of fermented Ladou

1.2.7游離氨基酸的測定樣品前處理:準確取臘豆樣品2.0 g,研磨,使用10 mL 4%的磺基水楊酸,將其重洗至10 mL離心管中。振蕩混勻,16000 r/min離心10 min,取上清液稀釋后用0.45 μm濾膜過濾后上機分析。測定條件:分離柱:2.6 mm×150 mm,樹脂2619#。柱溫53 ℃,溫度98 ℃,柱后衍生。測量波長:570,440 nm,流量0.225 mL/min,泵壓110 kg/cm2[7]。

1.2.8感官評價根據食品感官評定標準,制訂評分標準。實驗在揚州大學揚子津東校區篤行樓感官評定實驗室進行(參照國標GB/T 23493-2009),人員20人,均為食品系專業的感官鑒定人員。

1.3　數據處理

本實驗中所用到的數據分析軟件有SigmaPlot 10.0和SPSS 20.0。

2　結果與討論

2.1　復合菌株發酵對臘豆pH的影響

不同比例復合菌株發酵24 h臘豆pH的結果,如圖1所示。

圖1　不同比例復合菌株發酵24 h臘豆的pH的比較Fig.1　Comparison of pH of 24 h Ladou fermented with different proportions of strains注：不同小寫字母表示差異顯著(p≤0.05)。

由圖1可知,在發酵24 h時,臘豆的pH均在5.2～5.6之間。接菌組顯著低于CK組(p≤0.05),且不同處理組之間存在顯著差異(p≤0.05),其中1、6、10組成熟期pH顯著低于其他處理組(p≤0.05),而這幾組均為枯草芽孢桿菌含量較高且酵母含量較低組,配比分別為:0.6∶0.2∶0.2;0.533∶0.367∶0.1;0.467∶0.3∶0.233。在臘豆發酵過程中,微生物所產生的淀粉酶和脂肪酶,使得大豆中的碳水化合物以及脂肪分解成大量的有機酸和脂肪酸從而降低臘豆的pH,較低的pH會導致蛋白質變性,使得臘豆的組織結構更加緊密,從而增加其硬度和咀嚼性[8]。第1、6、10組的結果說明說明枯草芽孢桿菌具有更高的分解脂肪和碳水化合物的能力,對于降低pH作用更明顯。低pH環境下,可以有效地抑制部分腐敗微生物的生長,保證產品安全性,延長貯藏期,且各處理組的pH均在5.0以上,保證了食品內容物的平衡。

2.2　復合菌株發酵對臘豆質構的影響

臘豆發酵成熟期的質構分析,本研究選擇硬度、彈性、膠黏性和咀嚼性這4個指標來衡量臘豆品質,表3中為臘豆發酵24 h時各處理組的質構分析結果。

由表3可知,接菌組在成熟時期的硬度、彈性、膠黏性和咀嚼性均相對低于CK組,第6組的硬度、彈性和咀嚼性均小于其他處理組,這符合亞洲人的口感標準。發酵過程中微生物作用導致纖維素酶活性增大,纖維素降解,導致其硬度降低[9]。在發酵過程中,微生物的作用產生大量的脂肪酶,脂肪酶分解脂肪從而導致脂肪含量降低,脂肪含量與彈性呈正相關[10],所以其彈性降低。脂肪可以使得纖維容易活動,具有潤滑劑和連接劑的作用,從而增加其咀嚼性[10],因此,發酵中隨著脂肪含量的降低,接菌組咀嚼性也顯著低于CK組。其中,第6組中枯草芽孢桿菌含量較高,說明枯草芽孢桿菌有更強的分解脂肪和纖維素的能力,與發酵臘豆pH分析地結果相一致,綜合考慮,第6組更適合實際生產。

表3　復合菌株發酵對臘豆質構的影響Table 3　Texture analysis of fermentation Ladou with compound strains

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(p≤0.05)。2.3復合菌株發酵對氨基態氮含量的影響

臘豆中氨基氮的含量可以反映解蛋白質的水解程度,同時氨基氮是臘豆風味物質的前體物,由不同比例復合菌株發酵24 h,臘豆中氨基態氮含量結果如圖2所示。

圖2　不同比例復合菌株發酵24 h臘豆氨基態氮含量的比較Fig.2　Comparison of amino nitrogen content in 24 h Ladou fermented by different proportions of strains

由圖2可知,接菌組氨基態氮含量顯著高于CK組(p=0.02),由質構的分析結果表明,處理組第6組質構中的硬度、彈性和咀嚼性均小于其他處理組。其中第6組中枯草芽孢桿菌含量較高,而枯草芽孢桿菌具有更好的蛋白降解能力[10],這與第6組中氨基態氮含量高的結論相一致。第6組中混菌的比例分別為0.533∶0.367∶0.1，混菌發酵更有利于實現不同酶系的互補,提高蛋白降解效率[11],枯草芽孢桿菌輔以釀酒酵母和解淀粉芽孢桿菌,可以得到較高的氨基態氮含量。

2.4　發酵臘豆游離氨基酸的分析

不同比例復合菌株發酵24 h后,臘豆中游離氨基酸的結果如表4所示。

由表4可知,不同處理組臘豆的游離氨基酸中,其中苦味氨基酸占約50%,鮮味氨基酸占30%以上,而臘豆感官并沒有感覺到苦味的存在,這個和氨基酸的閾值有關,苯丙氨酸的閾值高達60 mg/100 g,谷氨酸大于30 mg/100 g才有呈味作用。且在后期香辛料的添加,高含量的鹽成分可以使得咸味特征加強,且谷氨酸在酸性條件下可以和鈉離子結合成谷氨酸鈉,導致鮮味更加明顯,從而可以掩蓋苦味。臘豆在發酵期間,蛋白質在微生物和蛋白酶作用下降解為游離氨基酸,這些氨基酸是一些風味物質的前體,臘豆中蛋白質水解成短肽與臘豆滋味形成有一定關系,大量研究已表明,蛋白質水解常引起苦味的產生,這是因為蛋白水解自然形成強烈疏水的肽和氨基酸等降解產物[12],同時也會形成鮮味肽和甜味肽而弱化苦味。根據Tseng 等人對滋味特征的描述,將氨基酸分為鮮味(Asp、Glu)、甜味(Ala、Gly、Ser、Thr、Pro)、苦味(Arg、His、Ile、Trp、Tyr、Val、Leu、Cys、Lys)這三種氨基酸[13-15]。游離呈味氨基酸的構成在發酵食品的滋味形成中發揮了重要作用。由表4可知,CK組并不是氨基酸含量最低組,可能是因為一些氨基酸被微生物所利用,也可能是因為,pH較低的環境下抑制堿性蛋白酶的活性。其中第13、15、16組氨基酸含量較低,這個與所接菌株有關,這幾組酵母含量都比較高,且枯草芽孢桿菌含量也不高。在所有處理組中谷氨酸含量是最高的,其次是苯丙氨酸,其中處理組5、6兩組這兩株氨基酸顯著高于其他組分,其次甜味氨基酸中,丙氨酸含量為最高,其中第5、6、9兩組含量最高,綜合來看,第5、6組的發酵劑配比更適合臘豆發酵。

表4　不同比例復合菌株發酵24 h臘豆游離氨基酸的比較Table 4　Comparison of free amino acids in fermented 24 h Ladou by different proportions of strains

2.5　感官評價

不同比例復合菌株發酵24 h后,臘豆的感官評價結果如表5所示。

表5　不同比例復合菌株發酵24 h臘豆的感官評價Table 5　Sensory evaluation of 24 h Ladou fermented with different proportions of strains

由表5可知,CK組的感官評分最低,僅75.7分,而處理組中,第6組感官得分最高,其次第10、12、14、5組,這幾組中,枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌含量較高,說明枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌在發酵過程中是主導作用。綜合以上研究,在第6組的配比中,微生物發酵具有更強的分解脂肪和碳水化合物的能力,使得臘豆的硬度、彈性、咀嚼性適中,且在第6組中,氨基態氮含量較高,鮮味氨基酸和甜味氨基酸都高于其他組,風味較好,所以第6組更適合實際生產。

3　結論

采用Design Expert 8.06軟件對3株待用菌株進行復配,研究表明,在pH這個指標上,接菌組顯著低于CK組,其中第6組pH顯著低于其他組(p≤0.05),低pH環境下,可以有效的抑制部分腐敗微生物的生長,保證產品安全性,且延長貯藏期。此外質構受到發酵劑的影響,接菌組各項指標顯著優于CK組(p≤0.05)。在氨基態氮含量方面,接菌組都優于CK組,但是游離氨基酸含量來看,CK組并沒有顯著低于接菌組,第6組其鮮味氨基酸和甜味氨基酸都高于其他組(p≤0.05),通過感官分析,第6組得分最高。綜合考慮,選擇第6組為最佳配比,第6組中,每100 g煮熟豆子接4 mL混合菌液,復合菌液的配方為枯草芽孢桿菌:解淀粉芽孢桿菌:釀酒酵母為5.33∶3.67∶1。

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