分子標記輔助選擇在陜恢206選育中的應用

張選明 李培江 張志奇 沙志鴻 劉志立 王小紅 顧朝軍 嚴洪慶

摘 要：水稻稻瘟病是漢中地區水稻的主要病害之一，選育抗病品種是防治稻瘟病最經濟有效的方法。該研究以同時含有稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-km的蜀恢527，含有稻瘟病抗性基因Pi-b的R150為基因供體配置雜交組合，利用Pi-ta、Pi-km和Pi-b的基因標記對分離世代進行基因位點檢測，結合田間多代選育、抗性篩選將3個基因轉育到同一品種，通過分子標記與田間多代性狀篩選，選育出抗病、高產、優質水稻新品種“陜恢206”。研究表明，利用分子標記輔助選擇，為選育多抗水稻品種提供了簡單、便捷的選育方法，同時也為水稻抗病育種提供了新的遺傳資源。

關鍵詞：水稻；稻瘟??；分子標記輔助選擇；Pi-ta；Pi-km；Pi-b

中圖分類號 S511 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）09-0019-04

Application of Marker-Assisted Selection in Breeding of Shanhui 206

Zhang Xuanming et al.

（Shaanxi Rice Research Institute，Hanzhong 723000，China）

Abstract：Rice blast is the main disease of rice in Hanzhong area，breeding resistant varieties is the most effective way to prevent rice blast.Shuhui 527，containing both Pi-ta and Pi-km，was crossed with R150 which carried Pi-b.Three gene-markers Pi-ta and Pi-km and Pi-b were used for marker-assisted selection in each segregating generation.After the multi-generation breeding and identification of resistance，three resistance genes were put together finally.Through the molecular marker and field multi-generation character，breeding new varieties of disease resistance，high yield and high quality rice "Shanhui 206".These results indicated that marker-assisted selection could not noly be a simple and effective way but also provide genetic resources for breeding new rice multi-resistant varieties.

Key words：Rice；Rice blast；Marker-Assisted Selection；Pi-ta；Pi-km；Pi-b

稻瘟病是由子囊真菌（Magnaporthe grisea）引起的水稻病害，其危害面積與危害程度日趨嚴重，已成為限制水稻高產穩產的重要因子[1-2]。實踐證明，培育抗性品種是防治稻瘟病最經濟、有效的方法。由于稻瘟病病菌具有耐藥性、易變異等特點，導致單一抗性品種不能夠長期保持抗性。因此，篩選和利用廣譜抗性基因以及利用分子技術將多個抗性基因整合到一個品種中，是選育持久抗性品種的必然趨勢[3-4]。

傳統的抗性育種主要依賴于表現型，而表現型容易受環境以及人為因素的干擾，從而降低了選育結果的可靠性及抗病育種效率。隨著分子生物學技術的快速發展，水稻抗性育種已從傳統技術轉向分子技術，DNA分子標記、PCR（聚合酶鏈式反應）以及水稻全基因組測序的完成，都極大地推進了運用分子手段進行抗性育種，由于其直接、快捷、可靠且不受環境干擾的優點，也越來越受到人們的關注。截至2015年3月，已至少報道了69個抗稻瘟病位點共84個主效基因，其中，Pi-ta，Pi-b，Pi-zt，Pi1，Pi2，Pi5，Pi9等24個基因已被成功克隆[5]。Pi-ta位于水稻第12染色體靠近著絲點附近的區域，由928個氨基酸殘基編碼組成的富含亮氨酸重復序列的細胞質膜受體蛋白[6]。Pi-b是來自日本抗性材料BL-1，該基因位于水稻第2染色體長臂近末端區域[7]。Ashikawa等通過序列分析和遺傳互補實驗研究表明，Pi-km是由2個緊密連鎖的具有獨立功能NBS-LRR類基因（Pi-km-TS和Pi-km2-TS）組成[8]。

本研究利用抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b和Pi-km的特異性分子標記對育種分離世代水稻材料進行基因聚合，并結合田間世代選育，稻瘟病抗性鑒定，快速、準確選育出抗稻瘟病、產量高、優質新品種。不僅為水稻抗病育種提供了一種簡單、快捷的選擇方法，同時為水稻抗病育種提供了新的遺傳資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料 強優抗病恢復系蜀恢527，含有稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-km，但不含抗性基因Pi-b；自育優質、秈粳交中間材料R150，含有稻瘟病抗性基因Pi-b；不育系陜農1A，中九A，宜香1A，內香5A。

1.2 抗病基因標記的選擇 選擇抗病基因Pi-ta在DNA序列上的單核苷酸長度多態性設計的等位基因特異性PCR引物YL155/YL87，用于檢測Pi-ta基因[9]。選擇抗病基因Pi-b在DNA序列上的多態性設計的特異性引物Pi-bdomF/Pi-bdomR，用于對Pi-b基因的選擇[10]。由于Pi-km基因是由兩個緊密連鎖的具有獨立功能NBS-LRR類基因組成，分別對2個基因設計引物Dkm1和Dkm2，用于檢測Pi-km基因。引物名稱、序列和擴增片段預期大小見表1，引物由上海生工公司合成。

1.3 DNA提取 采集分蘗盛期的試驗材料葉片，用CTAB法提取全基因組DNA。

1.4 PCR擴增和電泳 PCR擴增體系為20μL：2μL 10×buffer，2μL DNA，2μL dNTP，1μL正反引物，0.5μL MgCl2，0.5μL Taq酶，11μL蒸餾水，PCR反應條件為：94℃預變性4min，94℃、45s，52℃、1min，72℃、45s，擴增重復34次，72℃延伸10min。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，紫外燈下觀察和檢測。為保證實驗的可靠性，每個DNA樣品重復3次。

2 結果與分析

2.1 利用分子標記輔助選擇聚合Pi-ta、Pi-b和Pi-km基因 利用Pi-ta的基因標記對抗性基因的供體親本和受體親本PCR檢測發現，Pi-ta標記能夠在供體親本中擴增出1042bp的目的條帶，在受體親本中不能擴增出目的條帶。因此可以利用這對基因標記對分離群體中含有Pi-ta抗性的單株進行選擇（圖1）；利用Pi-b的基因標記對抗性基因的供體親本和受體親本PCR檢測發現，Pi-b標記能夠在供體親本中擴增出365bp的目的條帶，在受體親本中不能擴增出目的條帶。因此可以利用這對基因標記對分離群體中含有Pi-b抗性的單株進行選擇（圖2）；利用Pi-km的基因標記對抗性基因的供體親本和受體親本PCR檢測發現，供體親本中能夠同時擴增出223bp和291bp的目的條帶，在受體親本中2條目的條帶不能同時擴增出。因此可以利用這對基因標記對分離群體中含有Pi-km抗性的單株進行選擇（圖3、4）。

利用3對基因的分子標記對F4代分離群體的128個綜合性狀表現好的單株進行選擇，獲得了10株同時含有Pi-ta（純合）、Pi-b（純合）和Pi-km（純合）抗病基因的單株。

2.2 聚合后代的抗性表現和農藝性狀系統選育 2009年，將獲得的10個單株分別種植成160苗的株系，用來自四川和漢中不同地區的5個稻瘟病生理小種對不同株系進行苗瘟和穗頸瘟接種鑒定，結果表明，10個株系對苗瘟和穗頸瘟都表現出很強的抗性。同時通過對分蘗力、成穗率、莖稈粗細等農藝性狀的比較，選擇綜合性狀較好的單株20株進行花藥離體培養，加快穩定，于2009年冬在海南三亞進行種植，優選單株22株，于2010年在漢中種植，優選單株16株，進行編號，分別與陜農1A等多個不育系進行測配，其中編號為206株系與陜農1A所配組合結實率高，豐產性好，抗性強，米質優，表現突出。該株系經與多個不育系陜農1A，中九A，宜香1A，內香5A配組，F1代均表現結實率高，抗性強。該株系經5年南繁北育加代系統選育，現已進入F12代，表現遺傳性穩定，分蘗力強、米質優、抗性強，定名為“陜恢206”，選育過程如圖5所示。

圖5 “陜恢206”的選育過程

2.3 “陜恢206”農藝性狀 “陜恢206”綜合性狀好，全生育期162d，分蘗力較強，成穗率高，平均每穗總粒數168.6粒，結實率平均90.4%，千粒重平均32g，株高平均126.8cm，莖稈粗壯，抗倒伏，成熟轉色佳，株葉形態良。稻米外觀透明，堊白度2.1%，直鏈淀粉含量17.4%，膠稠度84mm，粒長寬比3.4，蛋白質含量8.3%，整體米質指標符合GB/17891—1999《優質稻谷》二級標準。經陜西省水稻研究所植保研究室抗病性鑒定，多點誘發鑒定表明：“陜恢206”對穗頸瘟病表現為高抗，對葉瘟表現為中抗；對紋枯病表現為中感；對稻曲病表現為中抗；人工接菌對白葉枯病表現為中感。

3 討論

選育抗病、高產、優質水稻新品種仍是現階段的主要育種目標，其中稻瘟病是我們一直致力攻克的對象。由于不同稻區的稻瘟病菌生理小種有可能不同，品種所表現的抗病性常常表現較大的差異。傳統的改良品種抗性，往往需要依賴抗性鑒定和表型選擇，而表現型受環境因素的干擾，選擇效率低、工作量大、育種周期長，從而增加了育種難度。隨著分子生物學的發展，推動了分子育種進程，而定位和克隆的大量稻瘟病抗性基因為MAS技術開展抗性育種奠定了基礎。隨著分子標記輔助選擇技術的日益成熟，不但可加速抗病育種進程，還可以提高育種效率，越來越多的育種家利用與抗稻瘟病基因連鎖的分子標記開展了水稻抗稻瘟病的分子標記輔助育種工作。由于稻瘟病生理小種的區域性差異和潛在的突變性，單一抗性基因不足以提高水稻的抗病性，因此，聚合多個抗病性基因到同一優良植株中是提高植株持久抗病性的有效手段。劉仕平等[11]研究表明，多個抗性基因的聚合后，并不簡單的是單個抗病基因的抗譜之間的簡單累加，而是抗性基因之間表現為極顯著的基因互作，從而促使抗譜拓寬，抗性增強，使其能夠抵抗單個抗病基因不能抵抗的生理小種。在聚合多個稻瘟病抗性基因方面，王軍等[12]利用分子標記輔助選擇聚合水稻抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b和條紋葉枯病抗病基因Stv-bi，選育出多抗、高產、優質粳稻新品系74121。劉武革等[13]利用分子標記輔助選擇將稻瘟病抗性基因Pi-1、Pi-2聚合到兩系不育系GD-7S中，獲得的后代既保持了GD-7S的農藝性狀和配合力，又提高了株系的抗性水平。陳紅旗等[14]利用分子標記輔助選擇將稻瘟病抗性基因Pi-1、Pi-2、Pi-33聚合到金23B中，培育出廣譜、持久抗稻瘟病新材料W1。陳學偉等[15]將Pi-d（t）、Pi-b和Pi-ta抗性基因聚合到保持系雜交品種G46B中，顯著提高了稻瘟病抗性水平。

4 結論

本研究利用稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi-b、Pi-km分子標記對后代分離群體進行分子標記輔助選擇，并結合田間抗性鑒定和常規育種技術，成功的將3個抗病基因進行聚合，選育出抗病、高產、優質恢復系水稻新品種“陜恢206”。實踐證明，利用分子標記輔助選擇技術將與抗病基因緊密連鎖的分子標記對抗性基因進行檢測和篩選，再通過常規育種技術，可以快速準確地聚合多個抗病基因，為水稻抗病育種提供一種高效、簡單、快捷的選育方法。

參考文獻

[1]華麗霞，汪文娟，陳深，等.抗稻瘟病Pi2/9/z-t基因特異性分子標記的開發[J].中國水稻科學，2015，29（3）：305-310.

[2]汪文娟，周繼勇，汪聰穎，等.八個抗稻瘟病基因在華南秈型雜交水稻中的分布[J].中國水稻科學，2017，31（3）：299-306.

[3]殷得所，夏明元，李進波，等.抗稻瘟病基因pi9的STS連鎖標記開發及在分子標記輔助育種中的應用[J].中國水稻科學，2011，25（1）：25-30.

[4]朱玉君，樊葉楊，黃德潤，等.分子標記輔助選擇在水稻育種的應用[J].核農學報，2012，26（5）：756-761.

[5]國家水稻數據中心.稻瘟病主效抗性基因列表[EB/OL].http：//www.Ricedata.Cn/gene/gene_pi.htm，2012-6-20.

[6]Bryan G T，Wu K S，Farrall L.et al.A Single Amino Acid Difference Distinguishes Resistant and Susceptible Alleles of the Rice Blast Resistance Gene Pi-ta[J].Plant Cell，2000：2033-2045.

[7]Wang Z X，Yano M，Yamanouchi U，et al.The Pib gene for rice blast resistance belongs to the nucleotide binding and leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes[J].Plant J，1999，19（1）：55-64.

[8]Ashikawa I，Hayashi N，Yamane H，et al.Two Adjacent Nucleotide-Binding Site–Leucine-Rich Repeat Class Genes Are Required to Confer Pikm-Specific Rice Blast Resistance[J].Genetics，2008，180（4）：2267-2276.

[9]王忠華，賈育林，吳殿星，等.水稻抗稻瘟病基因pi-ta的分子標記輔助選擇[J].作物學報，2004，12：1259-1265.

[10]Robert F，Concetta A，Anna M.et al.Developent of DNA markers suitable for marker Assisted Selection of Three PI Genes Conferring Resistance to Multipe Pyricularia grisea pathotypes[J].Crop Science，2004，44：1790-1798.

[11]劉仕平，李信，汪朝陽，等.基因聚合對水稻稻瘟病的抗性影響[J].分子植物育種，2003，1（1）：22-26.

[12]王軍，楊杰，陳志德，等.利用分子標記輔助選擇聚合水稻抗病基因pi-ta、pi-b和Stv-bi[J].作物學報，2011，37（6）：975-981.

[13]劉武革，王豐，金素娟，等.利用分子標記輔助選擇聚合pi-1和pi-2基因改良兩系不育系稻瘟病抗性[J].作物學報，2008，34（7）：1128-1136.

[14]陳紅旗，陳宗祥，倪深，等.利用分子標記技術聚合3個稻瘟病基因改良金23B的稻瘟病抗性[J].中國水稻科學，2008，22（1）：23-27.

[15]陳學偉，李仕貴，馬玉清，等.水稻抗稻瘟病基因Pid（t）、Pib、Pita的聚合及分子標記選擇[J].生物工程學報，2004，20（5）：708-713.

（責編：張宏民）