巴馬豬椎間盤退變模型的建立*

黃 明 孫瑩杰 張鐵錚 李 凱 鄭昊龍 何寶文 陳克研

(1.沈陽軍區總醫院麻醉科， 沈陽 110016)(2.沈陽市第四人民醫院麻醉科，沈陽 110031)

椎間盤突出癥是骨科常見的疾病，尤以腰椎更為常見，雖然目前準確的病因尚未明確，但椎間盤的退變是這一過程的關鍵環節。為深入探討椎間盤退變的病因及病理生理機制，建立巴馬豬腰椎間盤退變模型具有一定的必要性，本實驗通過建立退變的巴馬豬椎間盤退變模型，產生與臨床相似病變癥狀，在實驗動物活體內模擬并觀察椎間盤退變過程，生化物質的檢驗分析及其他伴隨癥狀，從而為臨床椎間盤退變性疾病的研究提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取健康成年巴馬豬6頭(由沈陽軍區總醫院醫學實驗動物科提供)雌雄不限，體質量50～60 kg，按數字表法隨機分為2組，每組3頭，分別為空白對照組(Con組)和造模組(Mod組)，在標準的飼養條件下飼養2周。2組巴馬豬的一般情況見表1。

表1 2組巴馬小型豬實驗前一般情況Table 1 The general situation of two groupsof Bama miniature pigs

1.2 動物模型建立

1.2.1麻醉與監測:巴馬小型豬，術前禁食12 h，不禁水。術前取耳緣靜脈穿刺建立靜脈通路。靜注丙泊酚3.0 mg/kg體質量；待呼吸減慢，肢體活動消失，角膜反射消失時，行氣管內插管。麻醉成功后，將巴馬小型豬固定在手術臺上，持續泵入丙泊酚8 mL/h維持麻醉，術中監測生命體征，調整給藥劑量。

1.2.2手術步驟:將豬麻醉成功后，進行生命體征監測，開通靜脈通路，靜點生理鹽水，在生理鹽水中加160萬U青霉素預防感染，并對豬背部進行備皮，對手術區域進行常規消毒，鋪無菌洞巾，術中根據情況調整丙泊酚劑量。在具有影像引導(C形臂X光引導)手術室內，將豬以左側臥位躺在射線手術臺上。

1.2.3椎間盤退變手術過程:在C形臂X光引導下確定豬L2-3、L3-4、L4-5、L5-6椎間隙，用1%的利多卡因進行浸潤麻醉，用16G的引導針沿定位點穿刺椎間盤。穿透纖維環后側后，呈放散狀將椎間盤進行針刺破壞。每個間盤進行6次穿刺，每個角度間隔30度，將椎間盤進行破壞，完成造模見圖1。術后將穿刺點外敷無菌敷料，并用膠布固定，繼續應用青霉素80萬U，連續應用3 d，每日觀察大小便以及飲食情況，1周后去除敷料，術后1個月行MR檢測驗證模型是否成功。

圖1 C形臂X光引導下進行椎間盤手術Fig.1 The C-arm X-ray guided the intervertebral disc operation

1.3 影像學檢查

在豬進行造模前、造模后1個月分別進行MR檢測，觀察椎間盤狀態，每次行MR檢查均將豬進行全麻，并監測生命體征。進行MR后密切觀察豬的飲食及二便3 d，一切均正常后，進行統一飼養。并運用Pfirrmann分級系統進行評估[1]。

1.4 椎間盤HE染色觀察病理改變

放血處死，游離豬的脊柱，找出相對應的椎間盤，切開椎間盤周圍的韌帶及組織，進行鈍性分離，用手術刀將椎間盤切開，使上下兩個椎體分開，并取下纖維環，放入4%甲醛溶液中固定，對椎間盤組織進行HE染色。

2 結果

2.1 影像學(MRI)變化

Videman等[2]根據椎間盤含水量的變化將退變分為4級:I級,無明顯退變征象,表現為T2加權像均勻高信號；Ⅱ級,可見輕度退變征象,T2加權信號強度輕度降低；Ⅲ級，中度退變,信號強度中度降低,且不均勻；Ⅳ級,嚴重退變,信號缺失。

圖2 巴馬豬腰椎間盤MR檢測結果Fig.2 MRI results of intervertebral discs of Bama miniature pigs

MR檢測結果顯示：Con組巴馬豬椎間盤纖維環呈中等信號,髓核呈高信號影,纖維環信號略有不均勻,局部呈低信號影；Mod組巴馬豬椎間隙變窄，椎間盤后突，硬膜囊受壓，髓核信號基本喪失，椎間盤變型，由于造模過程中對組織損傷較大，部分椎體高度發生明顯變化(圖2)。

Pfirrmann分級顯示， Con組中的MR影像主要以Ⅰ～Ⅱ級為主，未見明顯的退變征象；Mod組中主要以Ⅲ～Ⅳ級為主，可見明顯的退行性改變，其中 Con組椎間盤的Ⅰ、Ⅱ級總數為100%，而Mod組Ⅰ、Ⅱ級總數為16.7%。

2.2 椎間盤形態學改變

HE染色結果顯示，Con組椎間盤未見明顯退變痕跡，髓核呈白色膠凍狀、含水豐富，清晰飽滿，纖維環結構清楚、呈同心圓排列，排列整齊，按Thompson分級為I級；而Mod組的椎間盤纖維化結構紊亂，纖維環局部明顯可見中斷,形成一個瘢痕樣針刺通道,貫穿整個纖維環及髓核,通道周圍組織廣泛硬化,并有骨贅形成， Thompson分級為Ⅳ～Ⅴ級，見圖3～4，表3。

圖3 2組巴馬豬間盤大體病理改變Fig.3 Gross pathological changes of plate among the two groups

圖4 2組巴馬小型豬椎間盤病理組織學變化 HE染色 ×100Fig.4 Histopathological changes of intervertebral discs in two groups of Bama miniature pigs by HE staining ×100

表3 2組豬椎間盤病理分級表Table 3 Pathological grading table of two groups ofporcine intervertebral disc

3 討論

椎間盤退變的動物模型的制作己有近百年的歷史。不同學者對椎間盤退變動物選擇不盡相同，至今已有鼠、犬、兔、羊、猴、豬等十余種動物成功建立了椎間盤退變模型[3]。根據退變的原因，模型的建立主要包括誘發性和自發性兩種[4-5]。誘發性模型既通過改變椎間盤生物力學結構、破壞椎間盤結構及進行基因敲除造成退變。自發性模型是通過特殊的飼養方法或者改變遺傳性狀造成的動物椎間盤退行性改變。在建立動物椎間盤退變模型中，多采用誘發性模型進行實驗，自發性退變模型因受退變機制不明確、實驗周期長等缺點在實驗中很少應用。誘發性椎間盤退變模型有手術直接損傷和化學損傷兩種方式[6]?；瘜W損傷方式相比于直接破壞來說，穩定性較差，藥物劑量難以把握，所以目前基本以直接損傷為主。直接破壞椎間盤有3種方式：終板破壞、髓核抽吸和纖維環穿刺法。纖維環穿刺法誘發的退變相對較輕，退變的程度與穿刺損傷的程度呈正相關,適合于早期退變研究；終板破壞和髓核抽吸型退變模型造成椎間盤的破壞較重，誘發的退變出現時間較短,進展較快,比較適合于對中晚期退變的研究[7]。本研究實驗周期相對較長，研究手段是低強度激光進行治療，研究對象的椎間盤病變相對較輕，結構未發生特別重大改變，所以選擇的造模方式為針刺法。

在動物模型的物種選擇上,最佳的動物對象應屬靈長類及大型家畜，因為上述動物的解剖結構與人類最為接近,但由于實驗經費和倫理等條件約束,無法得到廣泛應用。目前應用較多的模型是大鼠和兔子，但大鼠與兔子的椎間盤相對較小，椎間盤的力學結構與人類的相差較遠，無法完全滿足椎間盤的一些處置。豬的解剖結構與人類解剖相似，相比于大鼠、兔子等小型動物，豬的椎間盤較大，解剖結構差異小，容易進行較復雜的操作，是較為理想的實驗動物。國內學者已應用豬進行椎間盤退行性變的造模，取得了良好的結果[8]。故本實驗選取巴馬小型豬作為此次的模型動物。

本實驗通過巴馬豬來模擬臨床患者，制成與臨床相似的椎間盤退變模型，穿刺造模后1個月進行MR檢查，發現進行穿刺的椎間盤出現間隙變窄，椎間盤后突，硬膜囊受壓，髓核信號缺失，纖維環變形等改變，按照Pfirrmann分級標準，處理后的椎間盤在Ⅲ～Ⅳ級。HE染色結果顯示，與Con組比較，Mod組內的椎間盤髓核呈白色膠凍狀，穿刺部位椎間盤厚度下降，髓核發暗、含量減少，通道周圍組織廣泛硬化，纖維環結構粗糙。上述結果提示經過細針穿刺后的椎間盤發生了明顯的的退行性改變。

總之，通過針刺破壞巴馬豬纖維環及椎間盤的方法，手術操作簡單，可以獲得一種可靠的椎間盤退行病變模型，并且MR和病理學檢查可精確地驗證模型的有效性。