獸用疫苗中替代方法的研究進展*

王興童 韓凌霞

(中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，獸醫生物技術國家重點實驗室，實驗動物與比較醫學團隊，黑龍江省實驗動物與比較醫學重點實驗室，哈爾濱 150069)

獸用疫苗是獸用生物制品的重要組成部分，安全性和有效性是評價疫苗質量最重要的兩個要素。根據中華人民共和國藥典2010版，效力(Potency)，也稱效價，系指產品達到其目的作用的預期效能，疫苗安全性是指減毒活疫苗不存在殘余毒力、無外源物質污染且沒有毒性。

絕大多數疫苗必須使用數量驚人的宿主動物或實驗動物進行安全性和效力試驗，給動物造成巨大的痛苦，隨著“3R”理念的逐漸推廣和認可，許多疫苗制造商、監管機構以及世界衛生組織等國際組織都致力于減少、替代和優化(3R)原則研制和生產疫苗[1-2]，規定在獸用疫苗研制生產中必須利用替代技術?！吨腥A人民共和國獸藥典》(2010年版)也明確規定：“凡是能用法定的體外方法取代動物試驗進行獸用生物制品質量檢驗的，應盡量采用體外方法，以減少動物試驗?！盵3]，本文就國內外在獸用疫苗動物實驗替代方面的研究進展和差距做一比較[4]。

1 現有獸用疫苗效力檢驗和安全性檢驗中的替代技術

效力檢驗的目的是確保疫苗在接種后可誘導足夠的保護性免疫。 現有獸用疫苗效力檢驗的替代技術包括活病原滴定、體外定量試驗[5-6]如酶聯免疫吸附劑測定(ELISA)[7]，血清學方法(體內到體外)，宿主動物(魚、家禽)或實驗動物(如倉鼠、小鼠)的體內接種-感染試驗。列舉如下：

(1)菌落形成單位(Colony-Forming Units，CFU)計數法 將菌液或疫苗適當稀釋后，接種于適宜本菌生長的瓊脂培養基，在一定條件下培養，所得細菌菌落數乘以稀釋倍數，即為其活菌數。例如流產布魯氏菌疫苗。

(2)間接免疫熒光抗體實驗(Indirect fluorescent antibody，IFA) 間接免疫熒光抗體試驗是將含有活病毒的疫苗接種體外細胞系，利用該病毒特異性血清抗體與細胞孵育結合，再利用標記有熒光素分子的抗一抗抗體與細胞孵育結合，在熒光顯微鏡下暗視野觀察。例如豬圓環病毒[8]、貓泛白細胞減少癥和犬細小病毒疫苗。

(3)蝕斑形成單位(Plaque forming unit，PFU)有破壞宿主細胞能力的病毒感染致密單層細胞，經過一定培養時間，每個感染細胞周圍的細胞逐漸感染崩潰，形成肉眼可見的空斑。理論上，一個病毒粒子形成一個空斑。此方法只限于用在有產生空斑能力的病毒。例如貓杯狀病毒、貓鼻氣管炎病毒和馬立克氏病毒疫苗[9]。

(4)細胞培養物的細胞病變(cytopathic effect, CPE) 噬菌斑形成單位指在培養于瓊脂培養基上的細菌，或在單層培養的動物細胞上形成一個噬菌斑的病毒數。以細菌為寄主的噬菌體，在標準條件下，1個噬菌斑形成單位大體相當于1個病毒粒子。動物病毒則通常由100～1000個病毒粒子形成一個噬斑。例如豬傳染性胃腸炎、豬輪狀病毒、犬傳染性肝炎、犬腺病毒、犬瘟熱[10]、雞傳染性法氏囊病疫苗。

(5)胚絨毛尿囊膜的病毒噬斑計數(水貂犬瘟熱病毒疫苗,貓衣原體疫苗)、胚半數感染劑量(Median Egg infective dose, EID 50)(新城疫病毒[11]、傳染性支氣管炎病毒疫苗)

活疫苗的效力主要是通過細菌計數或病毒含量測定來確定，幾乎全部采用體外檢驗。滅活疫苗的效力檢驗通常是檢測對動物直接或間接的保護效果，比如免疫攻毒試驗和毒素中和試驗，利用ELISA檢測疫苗批次中的關鍵保護性抗原對特定抗體的結合活性，是經典的定量檢測體外抗原替代動物試驗的方法[12]。

2 國內、外獸用疫苗已被批準的效力檢驗替代技術

由于國際和國家管理機構制定的檢驗規程具有產品特異性，在不同的管理系統中可能存在地區差異。例如美國農業部(USDA)允許使用ELISA方法評價滅活豬丹毒疫苗(丹毒絲菌)的效力，而歐洲藥品質量和健康管理局則規定要采用小鼠血清學試驗。 表1列舉了部分機構在獸用疫苗效力檢驗中采用的替代方法。

表1 不同動物用疫苗效力檢驗的替代方法、傳統方法及被認可情況Table 1 Approved alternative and traditional methods of various animal vaccines efficacy

注:a美國監管當局接受。b在歐洲藥典公布。c歐洲藥典規定，血清學試驗后，可以采取免疫化學法或細胞培養中和法。d內部(特定產品)驗證后適用。e在歐洲藥典中不再列出。f歐洲藥典規定的終點是疾病的“癥狀”，而不是殺傷力。g歐洲藥典規定，采用牛做許可前試驗，而豚鼠血清學方法是常規批次批簽發測試。h不作常規批量批簽發測試(歐洲藥典)。

Note:aAccepted by regulatory authorities of America.bPublished in the European Pharmacopoeia.cIn the European Pharmacopoeia，immunochemistry or cell culture neutralization can be used after serological testing.dAvailable after internal verification(for unique products)。eNo longer list in the European Pharmacopoeia.fThe end point described by the European Pharmacopoeia is the “symptoms” of the disease, not the lethality.gIn the European Pharmacopoeia, cow uses in pre-licensed tests, while serological tests of guinea pig are routine lot release tests.hNo routine batch lot release tests in the European Pharmacopoeia.

安全性檢驗可以利用分子生物學方法如聚合酶鏈式反應(PCR)替代檢測禽疫苗中的外源因子。也有人提出為了減少安全性測試所需的動物數量，使用磁共振成像(MRI)來檢測和量化體內疫苗接種后可能出現的局部反應[13]。

3 國內、外獸用疫苗中替代技術的使用情況比較

我國動物試驗替代方法研究起步較晚，與國外相比存在較大差距，見表2[14-15]。

我國2010年獸藥典和2015年獸藥典中關于獸用疫苗效力檢驗和安全檢驗的替代方法也在發生著變化，部分疫苗效力檢驗和安全檢驗中的本體動物逐漸被小鼠、豚鼠、兔等實驗動物替代，見表3[3,16]。

表2 國內外獸用疫苗中替代方法使用情況比較Table 2 Comparison of alternative methods used in veterinary vaccines at home and abroad

表3 中國獸藥典2010版和2015版中部分疫苗變化Table 3 Part of the vaccine changes of Chinese veterinary Pharmacopoeia 2010 and 2015 version

4 展望

適合優先開發替代方法的疫苗應具有以下特點：(1)疫苗的產量大，批次多，在疫苗生產過程中需要進行大量的動物試驗，比如狂犬病疫苗和禽疫苗[17]。(2)一些疫苗試驗會引起動物明顯疼痛和痛苦。(3)某些已確定保護性抗原的疫苗，可以通過抗原定量方法進行評價，如梭狀芽孢桿菌有ELISA替代方法[18]。(4)某些疫苗涉及外來動物或人畜共患病，存在生物安全風險，如口蹄疫疫苗感染試驗涉及烈性活病毒，潛在危害實驗室人員、家畜、寵物和野生動物[19]。(5)某些動物疫苗易于擴散到野生動物，具有潛在的生物安全問題，需要優先考慮使用替代方法進行疫苗的檢驗[20]。

在發達國家，獸用生物制品生產商和多個國際組織都致力于動物試驗替代方法的建立和標準化，包括理化、生化技術(電泳、色譜和層析)，免疫學技術(ELISA)或生物傳感分析以及體外功能分析。我國動物試驗替代方法的進展相對緩慢[21]，需要更多的驗證性試驗和經費資助來開展系統性的研究。隨著我國動物福利理念的廣泛傳播，替代技術將得到政府部門和科研人員的重視，將推動動物試驗替代技術在獸用生物制品研制、生產和檢定中的使用。