嚙齒類實驗動物墊料的研究進展

李樹梅 胡建武

(北京實驗動物研究中心，北京 100012)

墊料是實驗動物飼養與使用過程中緊密接觸的基礎材料，是國際公認的關系到實驗動物身體健康和動物福利，影響實驗動物的生理活動、動物實驗結果準確性的重要環境因素。李超等[1]于2014年10月對北京市15家實驗動物單位的健康嚙齒類實驗動物進行病理學抽檢發現肺臟病變表現為淤血、滲出及間質性肺炎，肺臟病變檢出率豚鼠為15. 5%。作者指出肺臟病變主要反映飼養環境情況，普通級動物的墊料及飼養籠具內空氣有待于進一步改善，而環境控制程度越高，在該環境中的實驗動物標準化越高，實驗結果也就更趨于穩定一致。墊料的主要作用是滿足動物筑巢需求、保溫、降低飼養籠內的氨氣濃度、濕度，吸附動物的日常排泄物，從而維持飼養籠具和實驗動物自身的清潔衛生。實驗動物墊料一般分為接觸性墊料和非接觸性墊料兩種。嚙齒類實驗動物在生產、科研中使用數量巨大，其使用的主要是接觸性墊料。本文就嚙齒類實驗動物墊料的種類、質量控制以及應用等方面的研究進行如下綜述。

1 嚙齒類實驗動物墊料種類

墊料為實驗動物生長繁育提供適宜的生存環境，選擇合適的墊料種類，可以改善實驗動物的生活環境，使動物行為和生理需求得到部分滿足和改善。但在任何管理和實驗條件下，都沒有對某種動物最理想的墊料，更沒有對各種動物都理想的墊料[2]。自上世紀60年代，發達國家就開始實驗動物墊料的相關研究，目前實驗動物墊料已經商品化并得到普遍應用。我國相對起步較晚，對于實驗動物墊料的開發和研究也一度成為諸多科研工作者的研究熱點，目前常用的接觸性墊料種類有木材墊料(刨花、木屑)、玉米芯、秸稈、再生紙、新型墊料等，其中木材刨花、玉米芯墊料已經形成商品化，并在實驗動物生產與使用單位大力推廣使用。

1.1 木材墊料(刨花、木屑)

木材墊料是目前最常用的接觸性墊料，商品化的墊料產品主要有木屑和刨花兩種。相對來說，刨花墊料以其質地柔軟、舒適性和吸水性好、粉塵率低、更適宜筑巢、不易粘附在動物皮毛上影響美觀等優勢備受青睞。木材墊料資源豐富，價廉易得，但在制作木材墊料時，需要嚴格控制原材料的種類，避免使用含有芳香氣味的松木和雪松材料?！秾嶒瀯游锕芾砼c使用手冊》中指出嚙齒類動物(大鼠、小鼠、地鼠、沙鼠)的墊料選擇上在實驗中切忌用針葉木(松、檜、杉)刨花做墊料，這類刨花散發出來的芳香味揮發性物質可誘導肝微粒酶活性，對肝細胞產生損害，使藥理和毒理方面的動物實驗受到極大干擾[2]。研究表明，這類材料含有的氣味可以引起免疫介導反應、引發哮喘和其他呼吸道疾病，還會造成氣管和支氣管上皮細胞脫落、壞死等[3]。王艷蓉等[4]研究發現松木墊料對小鼠的體質量有明顯減輕趨勢，與楊木組動物相比較，松木組動物的肺臟、肝臟質量增加；大鼠腎臟、腦和前列腺質量增加明顯，乙醇脫氫酶顯著升高，這說明松木中可能存在某些毒性物質，刺激動物肝臟增大，引起乙醇脫氫酶升高，總超氧化物歧化酶活性降低，減緩動物的生長速度。上述實驗結果與前期文獻報道的結論一致。細小的硬刨花、片屑、鋸末可粘在豚鼠生殖器黏膜上影響交配，致使豚鼠不孕。豚鼠的墊料除進行營養方面研究時可選用干草或稻草，一方面可以在豚鼠受驚奔逃時藏身，另外也可以讓其啃咬補充纖維素。鑒于我國實驗動物墊料標準化水平仍需進一步提高，以及目前使用的墊料多為木材加工廠廢棄的下腳料，造成生產出來的墊料質量參差不齊。另外，考慮到保護林木資源和環境可持續發展等資源保護與利用等問題，目前實驗動物科研人員也在積極開發探索新型實驗動物墊料。

1.2 玉米芯

玉米芯是玉米脫除玉米粒后的副產物，是一種產量巨大的農副產品(年產0.4億t)。數據表明：干玉米芯中含有機質91.3%(wt，質量分數，下同)、水分8.7%，其中半纖維素37.2%、粗纖維28.2%、木質素21.2%、粗灰分2.0%、粗脂肪0.7%、粗蛋白2.0%。玉米芯中纖維素分子含有大量親水基團，纖維素的纖維內部有許多毛細管，表面積較大，可吸收自重4倍的液體，可開發成吸水材料和活性炭資源[5]。此外，玉米芯在自然界中可生物降解、無毒性、不會造成環境污染。詹紅微等[6]對楊木刨花、紙屑、玉米芯的物理性狀、微生物含量及毒性等進行比較，發現玉米芯具有吸水性、干燥性、吸氨性、保溫性、動物適應性好，常規消毒后無細菌和真菌殘留，對小鼠無毒，不含可以維持小鼠生命的營養物質，粉末率極低等優點，玉米芯在所有檢測項目中均符合墊料標準，是一種較理想的SPF小鼠墊料。目前玉米芯已經成為商品化的實驗動物墊料，并被大力推廣使用。但在市場上常見的幾種商品化墊料中，相對于白楊墊料來說，不管是大鼠還是小鼠都不是很喜歡玉米芯墊料[7]。在玉米芯墊料的研究中，文獻報道玉米芯墊料對某些類型的研究結果有影響。王艷蓉等[4]在觀察楊木、玉米芯、松木三種墊料物質對大、小鼠體質量、血生化、臟器及臟器系數的影響時發現玉米芯墊料可促進動物體質量增加，血清學檢測發現堿性磷酸酶和總超氧化物歧化酶活性增加，大鼠肝臟質量及臟器系數極顯著性升高。這說明，雖然玉米芯可以作為實驗動物接觸性墊料使用，但使用時還應考慮不同的實驗要求。玉米芯中含有具有雌激素性質的四氫呋喃二醇，亞油酸衍生物，這對大鼠的交配行為和神經內分泌研究有一些干擾作用[8]。此外，在商品化的玉米芯墊料中發現有霉菌毒素，這會導致延遲小鼠的發情周期[9]。

1.3 秸稈墊料(玉米秸、麥秸)

中國作為農業大國，農作物秸稈資源豐富?！丁笆濉鞭r作物秸稈綜合利用實施方案》顯示，2010年全國范圍內秸稈的理論資源量為8.4億t，可收集資源量約為7億t。秸稈是一種寶貴的生物質資源，其綜合利用，不僅能保護農產品產地環境、減少秸稈焚燒所帶來的社會、經濟、環境等問題，而且可以實現農業生產系統中的物質和能量高效循環利用，保障農業的可持續發展。秸稈的綜合利用通過秸稈肥料化、飼料化、基料化、原料化以及燃料化五種途徑表現出來[10]。劉軍須等[11]對玉米秸(2.01±1.29)cm、刨花(0.91±0.64)cm、麥秸(1.53±0.94)cm所制成的墊料進行了物理性狀、化學污染物含量及攜帶的微生物數量的比較研究。結果顯示采用預真空高壓滅菌器脈動3次、132℃滅菌5min、干燥8 min后墊料的化學污染物指標均低于我國相關標準的要求。3種墊料刨花、麥秸、玉米秸的含水量分別為(7.52±0.15)%、(7.60±0.13)%、(7.28±0.13)%，吸濕性分別為(290.94±62.58)%、(414.44±81.21)%、(325.84±78.11)%。數據顯示：麥秸和玉米秸墊料的吸濕性高于刨花墊料。劉軍須等[12]使用玉米秸墊料飼養SD大鼠6個月，結果顯示玉米秸墊料雖然有細胞毒性作用，但其毒性顯著低于松木，使用玉米秸墊料對SD大鼠的血液生化指標沒有顯著影響，組織切片觀察未見異常病理改變。因此，玉米秸墊料在實際應用中是安全的。

1.4 再生紙墊料

再生紙墊料是將廢紙經過一系列的重新處理、軟化，切成碎片、紙條或者加工成紙團，制成墊料后使用。早期回收報紙應用到大動物和小動物行業時，管理人員發現回收報紙存在使用后易結塊、堵塞設備和排水管道、生產過程中極易產生大量粉塵，以及儲存和使用過程中存在火災風險。有科研人員將加工后的報紙和小麥秸稈、刨花進行化學和物理特性的比較發現，三種材料均易燃，其中刨花墊料燃燒時間最長，但顆粒狀報紙并沒有點燃?；厥請蠹埥浨兴楹椭瞥深w粒狀后比秸稈墊料擁有更高的持水性(持水量分別為>400%、 200%)[13]。來源低毒的再生紙墊料以其優越的吸水性應用于日本的實驗動物設施內，但考慮到其來源以及生產成本，目前國內科研工作者大多將其作為輔助性墊料與其他商品化墊料共同使用以改善嚙齒類實驗動物福利。有研究顯示：野生型小鼠有筑巢的自然特性，但在實驗室飼養設施內該特性表現并不明顯。為此，有科研人員[14]將山楊墊料作為底料，在此基礎上分別加入三種不同的材料(面巾紙、商業化的壓縮棉、碎紙條)測試C57小鼠是否可以用上述材料筑巢，并比較其對改善小鼠居住環境的影響。研究發現相對于其他材料，小鼠使用碎紙片可以建造起較高質量的巢穴，面巾紙材料筑巢居中，壓縮棉與對照組相差不大，評分最低。該結果顯示給予適當的筑巢材料，C57小鼠可以建造出與野生型小鼠相似的巢穴。

1.5 凹土玉米芯墊料

坡縷石又名凹土或凹凸棒石，是一種水合鎂鋁硅酸鹽非金屬礦物，土質細膩，有油脂滑感，吸水性強，具有特殊的纖維結構和吸附性能，有廣泛的應用領域。2011年—2014年期間，張延英等[15-17]以KM小鼠為實驗對象，將凹土和玉米芯為原料加工成約 2 cm×2 cm×0.5 cm的新型實驗動物墊料凹土玉米芯片，并對其物理特性和應用進行了相關研究。結果表明：凹土玉米芯的吸水性能較好，與普通刨花和玉米秸相比較，差異顯著(P<0.01) ，60Co輻照滅菌和高壓蒸汽脈動滅菌后的3種墊料均無細菌生長，動物(孕鼠、乳鼠、青年鼠)適應性較好；將凹土玉米芯、玉米秸、普通刨花墊料物質的丙酮提取物分別加到小鼠成纖維細胞、小鼠S180-S2D9細胞、H22-H2D8 細胞中進行體外培養，凹土玉米芯的細胞毒性最小，普通刨花的細胞毒性最大。綜上所述，凹土玉米芯墊料作為新型實驗動物墊料，是比較理想的實驗動物接觸性墊料，可以長期使用。

1.6 其他新型實驗動物墊料

稻殼是稻米加工期間除去的外殼，占稻米質量的20%。盡管稻殼被作為生物燃料和家畜墊料用于一些工業用途，但稻殼卻是稻米行業價值相對偏低的一個副產品[18]。盡管在印度稻殼被當做墊料用于嚙齒類寵物和實驗動物設施，但很少有文章發表描述該產品。一項墊料調查顯示：稻殼是無細胞毒性的，可以適度誘導肝癌細胞系肝細胞色素p450酶中的Cyp1a1產生，這一結果顯示稻殼可能會對涉及到肝臟藥物代謝的研究結果有一定影響[19]。與此同時，相對于玉米芯來說，稻殼吸水性相對較差，這有可能會阻礙稻殼墊料的廣泛應用。

另外，美國科研工作者研究出一種適用于大家畜動物和小鼠、沙鼠和倉鼠等小動物的新型墊料，該墊料是由刨花木材、紙質材料、墊料質量1～5%的表面活性劑以及20%～40%的皂土混合制成的顆粒狀、薄片狀復合物，它可以增加4～5倍體積的持水性。該墊料已經申請發明專利，其優勢在于其擁有較大的表面積和高持水性，可以增強對動物排泄物的吸收[20]。此外，還有專利顯示美國科學家研究出一種兼顧吸收動物排泄物和具備心理刺激性能的墊料。該墊料包括多個墊料顆粒組分形成的吸尿性顆粒和多個聚合物圓柱體組分構成的展開的聚合圓柱體并與吸尿性顆粒相混合。聚合物圓柱體具有1～30 mm的平均柱高，1∶1～12∶1的柱高與圓柱體直徑的比率，以及大于10∶1的條帶長度與柱高比。墊料顆粒組分相對于圓柱體的體積比是1∶1～25∶1。墊料對籠內的動物起到精神鼓舞和減少厭倦情緒的作用[21]。

2 嚙齒類實驗動物墊料的質量控制

我國實驗動物國家標準(GB 14925—2010)實驗動物 環境及設施中規定：墊料的材質應符合實驗動物的健康和福利要求，滿足吸濕性好、無異味、塵埃少、無毒性、無油脂、耐高溫高壓等條件；墊料必須經滅菌處理后方可使用。目前國內外學者圍繞著不同墊料的物理性狀、滅菌方法及保質期等開展了相關研究。

2.1 不同材質墊料物理特性的研究

墊料的物理特性應穩定、統一規格，具體的評估指標詳見表1。

Kaliste等[22]比較了山楊墊料(Tapvei 4HP、Beekay)、杉木墊料(LIGNOCEL?3-4、LIGNOCEL?8-15)、秸稈墊料(Beekay)、樺木墊料(LIGNOCEL?HBK1500-3000)經大小鼠使用前后吸水性和粉塵濃度的變化。山楊墊料使用后粉塵含量與干凈狀態時一致，但大鼠使用后粉塵則有所增加；杉木墊料在大小鼠使用后粉塵含量均有所下降，但大小鼠增重效果最好。秸稈墊料在小鼠使用后粉塵含量有所增加，但大鼠使用后卻沒有增加。樺木墊料使用后，粉塵含量下降最為明顯。小鼠使用后的樺木和秸稈墊料產生的粉塵濃度均高于大鼠。張志等[23]在尋找新型實驗動物墊料時對松木刨花、楓木刨花、稻草、紙皮4種材料的物理性狀及動物適應性進行比較，結果顯示楓木刨花保溫性能最好。李保文等[24]通過測定墊料的吸濕性、飼養籠具內氨濃度值、墊料和動物皮毛潔凈度評分等指標，評估玉米芯墊料和刨花墊料對SD大鼠和ALB小鼠排泄物的吸收程度。研究發現在使用相同體積(厚度)墊料的情況下，使用玉米芯墊料可以減少墊料更換頻率。孫永梅等[25]比較研究了刨花、玉米棒芯、蒲草葉墊料的吸水、吸氨及保暖等性能，結果顯示蒲草墊料的吸水能力最高，刨花墊料次之；小鼠飼養換籠后第4天及第7天籠內氨濃度，蒲草墊料顯著低于玉米棒芯墊料(P<0.01)；在(14.4± 2.1)℃室溫下，檢測小鼠離巢后5、10、15min巢內余溫，結果顯示蒲草墊料具有較好的保溫性。劉繼超等[26]在鼠盒內添加同體積墊料，通過吸水試驗、干燥試驗、保溫試驗、粉末率測定，比較兩種玉米芯(大顆粒和小顆粒)和楊木刨花3種材料的物理性狀，結果顯示相同體積的墊料中楊木刨花的質量最輕；大顆粒的玉米芯吸水率為最高，其次為小顆粒玉米芯，楊木刨花吸水性最低；楊木刨花的干燥速度、保溫性能均優于玉米芯，但粉末率高于玉米芯。Koontz等[27]比較IVC系統中使用玉米芯墊料和α-纖維紙墊料的吸氨性，觀察鼠群并且記錄21d中氨水平的日常測量值，數據表明，在IVC系統中玉米芯墊料的使用期限是α-纖維紙墊料的近乎2倍。

表1 墊料的物理特性Table 1 The physical properties of bedding materials

2.2 墊料消毒滅菌條件及保質期

墊料使用前，都應對其進行嚴格的消毒滅菌，目前常用的消毒滅菌方法是高溫高壓滅菌法和60Co射線輻照滅菌法。前者滅菌條件通常是經121℃滅菌30min，但該法在一定程度上影響墊料的吸濕性；后者的滅菌條件通常是輻照強度為20～25 kGy，適用于一次性處理大量墊料，但輻照滅菌后失真空的墊料不能投入使用。墊料應保存在陰涼、干燥、遠離污染源的單獨儲藏間，嚴格防控野鼠污染[28]；滅菌后的墊料需要在保質期內使用，過期墊料應再次滅菌后方可投入使用。阿娜古麗·馬合木提等[29]實驗研究表明在 SPF 級屏障環境下，裝桶高壓滅菌墊料保存時間最好不要超過 15d、未裝桶的墊料保存時間不得超過 5 d。劉建琪等[30]對國內5 省24 家墊料生產企業、動物實驗使用單位的混合型刨花(來自北京、上海、湖南)、杉樹墊料(湖南9 個地市縣)、玉米芯墊料(北京、上海、遼寧)、樺木墊料(遼寧、新疆)、泡桐墊料(湖南9 個地市縣)進行了菌落總數、大腸桿菌、霉菌及沙門菌監測。不同材質的墊料在121 ℃、30 min 的條件下具有最佳滅菌效果，各項微生物指標均合格；墊料使用1 d 后的菌量可達104 CFU/g，細菌及霉菌含菌量按天數逐步遞增；實驗證明墊料宜每周更換2～3次，方可保持動物籠內的微環境。陳霆等[31]分別用三種方法高壓滅菌動物籠具和商品化的玉米芯墊料，用壓力蒸汽滅菌化學指示卡和嗜熱脂肪芽孢桿菌( ATCC 7953) 3M壓力蒸汽滅菌生物指示劑做為指示高壓滅菌效果的指標。其結果顯示整包玉米芯墊料經132 ℃滅菌15 min，抽真空3次，干燥5 min高壓后，其干燥效果較差，且使用潮濕的墊料不符合動物福利的規定；按照實際使用量直接分裝到籠具中經121 ℃滅菌6 min，干燥3 min高壓后，化學指示劑測試合格，但生物指示劑顯示培養48 h后有菌生長，滅菌效果不穩定；單獨高壓整包墊料后，再按實際使用量鋪放在籠具里進行再次滅菌的方法效果最好，且墊料干燥。

3 墊料對嚙齒類實驗動物和動物實驗結果的影響

飼養環境對實驗動物的健康以及實驗結果均有一定影響，保持良好的飼養環境條件可以提高動物實驗結果的可信度和可重復性。墊料對嚙齒類實驗動物的影響主要體現在實驗動物對不同墊料材質的喜好不同，以及不同的墊料類型可能會影響某些類型動物實驗的結果。

3.1 墊料對實驗動物的影響墊料作為嚙齒類實驗動物生活環境中的重要組成部分，其原料材質、形狀、大小等因素均對實驗動物有不同程度的影響。早在1968年，就有報道[32]稱在木屑和除臭纖維素材料這兩種不同材質構成的墊料中，孕鼠更傾向于選擇前者。Blom等[33]在研究墊料材料對實驗動物舒適性的影響時發現，大、小鼠優選由大顆粒組成的墊料，van de Weerd等[34]報道，相對于木質材料構成的墊料，小鼠更傾向于紙質材料構成的墊料，不同的墊料和筑巢材料類可誘發小鼠幾個生理和行為學上的改變。Kawakami等[35]對比了四種類型的墊料對小鼠身體健康和福利的影響，根據小鼠在飼養籠內停留的時間長短來判斷對所用墊料材質的喜好。結果表明，小鼠更喜歡源自布料的墊料和筑巢材料。王剛等[36]發現使用不同墊料對小鼠進攻行為有影響，如選用柔軟的玉米芯和谷物殼類墊料，可降低小鼠的好斗的行為。Tanaka[32]等比較了由美國杉木制成的木屑(Clean Chip)和Shepherd Specialty Papers(SSP)生產的紙漿(ALPHA-dri?)研究表明，在運動能力方面，墊料的類型影響了F1代小鼠的探索行為。紙漿組F1代雄性成年小鼠表現出水平活動數量顯著下降，而自發行為明顯增多。相比之下，雌雄成年小鼠則沒有表現出顯著變化。因此，墊料材質只影響雄性小鼠的探索和自發行為。

3.2 墊料對動物實驗結果的影響

墊料的類型可能會影響某些實驗的結果，例如涉及酶誘導，細胞毒性。王春梅等[37]采用小鼠成纖維細胞、小鼠H22_H2D8細胞和S180_S2D9細胞，比較觀察了它們對松木刨花、麥秸、玉米秸、玉米芯、芬蘭產商品化白楊墊料的細胞毒性反應和上述細胞應用于墊料細胞毒性研究的可行性。鄺少松等[38]對松木刨花、楓木刨花、紙皮、稻草的水提取物對NIH小鼠進行急性毒性試驗和骨髓嗜多染紅細胞微核試驗，4 種墊料的水提取物對小鼠無明顯的毒性，均無誘導小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核生成的作用。

Tanaka[32]等報道不同的飼養條件可能會導致與性別相關的能力和行為發生顯著變化(如迷宮學習和探索行為)，并且可以明顯地影響大鼠知覺的敏感性。墊料的類型會影響小鼠的繁殖性能，尤其是其出生后的前 4 d。Yildirim等[39]發現珍珠巖墊料對SD大鼠體質量無影響，但對大鼠皮膚、壓力參數有負面影響，當把珍珠巖與刨花墊料混合使用時，其效果優于單獨使用珍珠巖墊料。在實驗動物飼養管理過程中，使用玉米芯墊料時經?？梢娦∈蟛墒秤衩仔镜默F象，Ambery等[40]通過為期四周的高、低脂飼喂實驗發現，高脂飼喂的玉米芯墊料組C57BL/6J小鼠在飼料轉化率和平均增重上均低于紙質墊料組，而低脂飼喂的C57BL/6J小鼠在使用上述兩種墊料時飼料轉化率、增重情況、飼料日均消耗量上均沒有差異。由此可知，玉米芯墊料可降低高脂飲食誘導的C57BL/6J小鼠糖尿病前期動物模型的飼料轉化率，在該模型使用時應選擇其他類型的墊料。在使用CD-1小鼠生產轉基因小鼠時，Helppi等[41]比較了新型墊料(棉布)和山楊墊料對胚胎移植后的代孕鼠CD-1小鼠繁殖性能(妊娠率和產仔率)的影響，結果發現棉布材料組CD-1小鼠妊娠率(19%)低于山楊墊料組(43%)。墊料中含有的某些化學物質有可能會干擾內分泌系統，進而影響機體的生長發育。Kang等[42]使用野生型SD大鼠評估刨花墊料和玉米芯墊料對其生長和發情周期的影響，結果發現兩種墊料對大鼠體質量影響差異不顯著，玉米芯組gh1基因的平均相對表達量低于刨花組(P=0.768)，而刨花組血清生長激素(GH)和雌二醇水平升高，玉米芯組第一次發情的時間和發情周期的長度增加，正常發情周期的比例也有所下降。因此在開展內分泌相關研究時應考慮選用合適的墊料。綜上所述，在使用實驗動物開展研究工作時應根據研究需求選擇適宜的墊料，降低墊料對動物實驗結果的干擾作用。