流式熒光法檢測胃蛋白酶原Ⅰ與Ⅱ的評價及應用分析*

何忠發,駱安德,盧彥蕙,陳耀良,蒙順武,羅雪林,覃 聰

(1.廣西壯族自治區來賓市人民醫院檢驗科 546100;2.廣西壯族自治區來賓市中醫醫院檢驗科 546100)

胃癌組織分泌物中含有胃蛋白酶原Ⅰ、Ⅱ(PGⅠ、Ⅱ)，測定PG有助于分析胃的分泌能力。血清PGⅠ、PGⅡ水平的變化可以反映胃黏膜的功能，因此對其準確的測定在胃癌早期的篩查與療效監測上具有重要意義。流式熒光法是基于熒光編碼微球和流式技術的一種臨床應用型高通量發光檢測技術，具有通量高、配套試劑多、應用領域廣、重復性好，既能檢測蛋白質又能檢測核酸等優點[1]。因此，流式熒光法被廣泛應用于胃部疾病的檢查?；瘜W發光法也是臨床常用檢測方法之一。有研究顯示，流式熒光法與化學發光法檢測PGⅠ、PGⅡ的結果在中等濃度方面基本一致[2-3]。但是對低濃度檢測的研究也是分析該方法的重要方面，本研究對流式熒光法檢測PGⅠ、PGⅡ的方法學進行評估，并與化學發光法檢測的結果進行對比分析，探討兩種檢測方法檢測PGⅠ、PGⅡ上的差異。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年12月至2015年9月來賓市人民醫院收治的胃疾病患者155例(患者納入例數參考文獻[4])，其中淺表性胃炎44例，萎縮性胃炎42例(幽門螺桿菌感染29例，無幽門螺桿菌感染13例)，胃癌69例(早期39例，晚期30例)；年齡22～79歲，平均(39.9±22.9)歲。選取同期在來賓市人民醫院體檢健康者145例，年齡23～80歲，平均(40.3±12.6)歲，無胃部疾病。兩組研究對象一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2儀器與試劑 PGⅠ、PG Ⅱ流式熒光定量測定試劑盒(上海透景生命科技有限公司)，Luminex 200多功能流式點陣儀(上海透景生命科技有限公司)；PGⅠ、PGⅡ化學發光微粒子免疫測定試劑盒(美國Abbott公司)，i-2000全自動化學發光免疫分析儀(美國Abbott公司)。

1.3方法

1.3.1PGⅠ、PGⅡ檢測 流式熒光法嚴格按照流式熒光定量測定試劑盒的說明書進行操作，采用Luminex 200多功能流式點陣儀進行PGⅠ、PGⅡ定量測定；化學發光微粒子免疫檢測法按Abbott公司試劑盒說明書操作。

1.3.2標準曲線的制作 測定0.4、1.0、5.0、10.0、50.0、200.0 ng/mL PGⅠ、PGⅡ混標液中PGⅠ、PGⅡ水平，建立回歸方程，計算回歸方程及相關系數(r)。

1.3.3流式熒光法檢測PGⅠ、PGⅡ的評價試驗 取10 ng/mL PGⅠ、PGⅡ混標溶液進行重復性試驗，根據峰面積計算PGⅠ、PGⅡ檢測結果的相對標準偏差(RSD)[5]；取9份淺表性胃炎患者血清樣本進行回收試驗，參考王紹亮等[6]的回收試驗方法，計算9個樣本PGⅠ、PGⅡ的水平，以平均值表示樣品中PGⅠ、PGⅡ的初始水平；取同一胃炎患者血清樣本4份分別加入0.4、10.0、200.0 ng/mL的PGⅠ、PGⅡ混標液，然后測定PGⅠ、PGⅡ的水平，計算回收率=[(測定待測回收樣本濃度均值-測定基礎樣本濃度均值)/加入濃度]×100 %；在不同水平的PGⅠ、PGⅡ中加入干擾劑三酰甘油200 mg/mL、膽紅素20 mg/mL、血紅蛋白 20 mg/mL，計算回收率以分析抗干擾能力。

1.3.4靈敏度和特異度實驗 以胃鏡和病理診斷作為金標準，對兩種方法的靈敏度、特異性進行比較，靈敏度=真陽性人數/(真陽性人數+假陰性人數)×100%，特異度=真陰性人數/(真陰性人數+假陽性人數)×100%。

2 結 果

2.1流式熒光法檢測PGⅠ、PGⅡ基本參數分析 流式熒光法檢測PGⅠ、PGⅡ線性回歸方程為Y=62.49X+1.61和Y=41.18X+2.85，r=0.998 5、0.998 8，線性范圍為0.35～190.00 ng/mL和0.32～200.00 ng/mL檢出限為0.02 ng/mL和0.04 ng/mL。

2.2流式熒光法檢測PGⅠ、PGⅡ評價試驗 流式熒光法檢測10 ng/mL的PGⅠ、PGⅡ結果分別為9.3、9.1、9.5、9.8、9.2 ng/mL和9.5、9.0、9.2、9.9、9.3 ng/mL，相對標準偏差為2.96%和3.65%；流式熒光法檢測PGⅠ、PGⅡ在基礎濃度4.51 ng/mL和2.74 ng/mL，加入濃度為0.4、10.0和200.0 ng/mL的平均回收率為98.3%～100.1%和95.8%～100.0%；流失熒光法在PGⅠ和PGⅡ基本濃度為15.66、22.65、23.69 ng/mL和5.69、5.50、5.68 ng/mL，三酰甘油、膽紅素和血紅蛋白水平為200、20、20 mg/mL情況下，回收率分別為99.1%、98.7%、97.0%和91.2%、96.5%、103.5%。

2.3流式熒光法檢測PGⅠ、PGⅡ靈敏度和特異度分析 流式熒光法檢測PGⅠ、PGⅡ靈敏度和特異度分別為74.85%，79.02%，而化學發光法檢測PGⅠ、PGⅡ靈敏度和特異度分別為63.81%，63.75%，差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 兩種方法檢測PGⅠ、PGⅡ靈敏度和特異度比較

2.4不同胃部疾病PGⅠ、PGⅡ結果分析 不同胃部疾病患者PGⅠ、PGⅡ結果見下表2和圖1，胃癌患者PGⅠ、PGⅡ水平與其他胃部疾病患者比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.5流式熒光技術與化學發光法檢測結果比較 兩種方法線性回歸方程PGⅠ為Y=0.548 5X+2.241，r=0.988 2；PGⅡ為Y=0.558 7X+1.005，r=0.987 6。PGⅠ/PGⅡ為Y=0.624 1X+0.325 0，r=0.984 6，見表3。

表2 不同胃部疾病患者PGⅠ、PGⅡ檢測結果

注：*P<0.05，與其他類型比較，HP為幽門螺桿菌

圖1 不同胃部疾病PGⅠ、PGⅡ檢測結果表3 流式熒光法與化學發光法檢測PGⅠ、PGⅡ結果比較

疾病類型n流式熒光法PGⅠPGⅡ化學發光法PGⅠPGⅡtPPGⅠtPPGⅡ淺表性胃炎444.51±0.322.74±0.214.51±0.322.74±0.21122 20.652122 20.652HP感染萎縮性胃炎296.11±0.454.02±0.264.51±0.322.74±0.21無HP感染萎縮性胃炎134.56±0.782.99±0.086.11±0.454.02±0.26早期胃癌398.39±0.696.21±1.024.56±0.782.99±0.08晚期胃癌305.89±1.06*4.89±1.04*3.39±0.691.21±1.02

注：HP為幽門螺桿菌

3 討 論

胃癌是比較常見的惡性腫瘤。目前對胃癌的診斷依然采用胃鏡活檢組織病理學進行檢查，也是確診胃癌的金標準，但是該方法在使用過程需要花費的人力及經濟成本比較高，而且對患者也會造成比較大的痛苦，不少人便放棄了對胃部疾病的檢查[6]。PG流式熒光技術因其具有高通量、檢測效率高的特點，在臨床上常用于胃癌的篩查。此方法對患者造成的痛苦比較小，而且準確性比較高，受到了廣大患者及學者的關注。PG是胃液中胃蛋白酶的非活性前體，在免疫原性上分為PGⅠ、PGⅡ 2 種，PGⅠ由胃底腺分泌，PGⅡ由胃底腺、賁門腺、幽門腺和十二指腸的Brunner，S腺分泌，胃底腺黏膜萎縮過程中，分泌PGⅠ的主細胞減少，分泌PGⅡ的幽門腺細胞增多，PGⅠ/ PGⅡ比值降低[7-8]。

檢測PG的方法目前報導的有酶聯免疫吸附試驗 (ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、乳膠增強免疫比濁法(PETIA)、時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)[9-10]、光激化學發光免疫分析法(LICA)及化學發光法(CLIA)，檢測PG的參考方法是化學發光免疫分析法[10]。本研究的PG流式熒光發光免疫測定方法，其分析血清中PG的精密度、準確度、檢出限、線性，和參考方法Abbott公司化學發光法相關性良好，兩法測定的結果具有一致性[10]。本研究通過流式熒光法檢測PGⅠ、PGⅡ靈敏度和特異度為74.85%、79.02%，而化學發光法檢測PGⅠ、PGⅡ靈敏度和特異度為63.81%、63.75%，流式熒光法檢測靈敏度和特異度高。本研究通過試驗，結果發現采用流式熒光技術檢測PGⅠ、PGⅡ的線性范圍分別為0.65～190.00 ng/mL和0.22～110.00 ng/mL，和其他研究的結果基本一致[11]?？赡苡捎趦煞N檢測方法的原理不同，靈敏度和特異度的差距等，導致兩種檢測方法的線性范圍差別較大。而且流式熒光法精密度和回收率均比較好，可以準確測定標本中的PGⅠ、PGⅡ。與化學發光法進行對比分析，兩種方法檢測PGⅠ、PGⅡ、PGⅠ/PGⅡ相關性良好，存在較好的可比性。

綜上所述，流式熒光技術檢測PGⅠ、PGⅡ的方法學性能比較好，與化學發光法具有良好的相關性，可在臨床上推廣應用。