羊胚胎移植技術及其應用

瞿靜雯　尹修遠　李擁軍

摘要 胚胎移植，又稱借腹懷胎、受精卵移植，是通過超數排卵技術獲得品種優良母畜的早期胚胎，同時對受體母畜進行同期發情處理，使其處于發情期的同一階段，將早期胚胎移植到生理狀態相同的受體母畜生殖道或子宮內，使之繼續發育成獨立個體的生物繁殖技術。胚胎移植是繼人工授精技術之后的又一項加快家畜擴大繁殖的先進技術，幾十年來在羊純種繁殖和快速擴繁等生產中得到了廣泛的應用。本文就羊胚胎移植中的技術環節及其應用現狀進行討論，以期對該項技術在生產中的規范應用提供一定的理論指導。

關鍵詞 胚胎移植；羊；技術環節；應用現狀

中圖分類號 S814.8 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）16-0205-03

Technology and Application of Sheep Embryo Transfer

QU Jing-wen 1，2 YIN Xiu-yuan 1，2 LI Yong-jun 1，2 * GUO Hai-yan 1，2 WANG Qiang 1，2

（1 Animal Science and Technology College，Yangzhou University，Yangzhou Jiangsu 225009； 2 Key Laboratory for Animal Genetic，Breeding，Reproduction and Molecular Design of Jiangsu Province）

Abstract Embryo transfer，which called abdominal pregnancy and transplant fertilized eggs，is the early embryo of superior female by superovulation technology.At the same time，the recipient females are processed to make them in the same stage of estrus.The early embryos are transplanted to the genital tract or womb of the same receptor female in the same state physiological status，allowing them to continue to develop into individual.Embryo transfer is another advanced technology that accelerates the expansion of livestock after artificial insemination technology，which has been widely used in sheep breeding and rapid propagation in the past decades.This paper discussed the technical process of sheep embryo transfer and its application status，so as to provide some theoretical guidances for the standardized application of the technology in production.

Key words embryo transfer；sheep；technical process；application status

胚胎移植技術是基于人類對哺乳動物個體發生、發育、繁殖規律的認識，通過大量的試驗研究和生產應用，逐漸發展起來的一項先進的生物技術[1]。早在1890年，Walter Heape教授在英國劍橋大學首次通過胚胎移植成功使比利時母兔產出了安哥拉仔兔[2]，這一舉措引起了廣泛關注。隨后，以家兔、鼠為研究對象的胚胎移植技術得到廣泛應用，但以牛、羊等草食性動物為研究對象的胚胎移植技術起步較晚。

我國胚胎移植技術的研究和應用起步較晚，很長一段時間內，我國胚胎移植技術都處于試驗階段。直到20世紀60年代，家兔胚胎移植技術才獲得成功，隨后這一技術在豬、馬、牛、羊等中大型家畜上應用也成功獲得后代，這對加快良種化進程、加速擴繁、品種選育和品種培育等繁殖技術起到重要作用[3]。隨著社會經濟的發展，肉羊產業呈現出欣欣向榮的景象，社會需求量的增加，對優質種羊的需求也進一步增加，少量進口的優質種羊難以滿足市場的需要。因此，胚胎移植技術亟須得到廣泛應用。

本文闡述了羊胚胎移植過程中的技術環節及應用現狀，以期為提高母羊繁殖力提供一定的借鑒，使我國的肉羊產業更快地向商業化方向邁進。

1 技術環節

1.1 供體羊和受體羊的選擇

1.1.1 供體。選擇的供體羊應具有品種優良、生產性能好、遺傳性穩定及無不良遺傳疾病和傳染性疾病等優點。此外，供體羊應選擇繁殖機能正常，已證明對超數排卵反應較好的母羊，年齡以2～5歲為宜，青年羊應在8月齡以上[4]。

1.1.2 受體。選擇的受體羊應健康、繁殖性能良好、無不良遺傳或傳染性疾病、母性好、產奶量高、體型較大的母羊，年齡1～5歲，以產過1～3胎為宜。受體羊的年齡應與供體山羊較為接近，相差1歲之內為宜，供體羊與受體羊的比例為1∶15～20。

1.2 供體的超數排卵

在母畜發情的適當時期，一般在發情后期，通過注射外源促性腺激素，使母畜卵巢比自然發情時有更多的卵泡發育并排出的過程，稱為超數排卵。羊一般通過以下幾種方法進行超數排卵。

1.2.1 FSH+LH法。發情周期的14～16 d任意一天開始，連續3 d，每天2次，間隔12 h，遞減肌肉注射FSH，最后一次注射FSH后12 h肌肉注射LH，24 h后試情配種。有研究表明，FSH總劑量在7.5～11.5 mg/只、LH劑量在200 IU/只時超排效果較好[5]。

1.2.2 FSH+PG法。發情周期的14～16 d任意一天開始，連續3 d，每天2次，間隔12 h，遞減肌肉注射FSH，總劑量為7.5～11.5 mg/只，最后一次注射FSH的同時注射PGF2α 2 mL，注射FSH后1～2 d即發情排卵。試情配種或輸精2次，每次間隔12 h，同時注射LH 100～150 IU，增加受精率[6]。

1.2.3 FSH+CIDR法。在發情周期14～16 d的任意一天給供體羊使用進口CIDR陰道埋置，以此日為第1天，從第14天開始連續3 d，每天2次，等量注射FSH，每次2 mL，在最后一次注射FSH時取出CIDR，取出后1～2 d即發情排卵。試情配種或輸精2次，每次間隔12 h，在第0天和最后1 d配合注射孕酮2 mL[7]，增加受精率。

1.3 受體的同期發情

綿羊和山羊同期發情方法相同，只是劑量上存在差別。同期發情的方法包括延長黃體期和縮短黃體期2種方法。其中，延長黃體期法是孕激素通過抑制卵泡期的到來而延長黃體期，在合適的時間同時停止使用外源激素，而達到同期發情的效果。處理方法有皮下埋植、孕激素陰道栓法、口服法等。而縮短黃體期法是前列腺素通過溶解黃體降低孕酮水平，人為終止黃體期，使受體母羊提前發情排卵而達到同期發情的效果[7]，發情同步差在24 h之內。

1.3.1 皮下埋植。將3 mg甲基炔諾酮裝入多孔的塑料細管中，利用套管針或專門的埋植器埋于母羊耳背皮下，可在埋植之前注射2～4 mg雌二醇加速自然黃體的消退，經過數天后取出，過2～3 d即可發情[8]。皮下埋植法操作簡單、高效、成本低。

1.3.2 孕激素陰道栓法。羊同期發情中以陰道栓法最為常見。取3 mg甲基炔諾酮溶解于色拉油中，用海綿浸潤，在發情周期的任意一天，利用陰道擴張器，將浸入孕激素溶液中的海綿送入陰道，細繩暴露在陰門外，14～16 d后拉住細繩將海綿栓取出，2～3 d后即可發情排卵。為了提高發情率，取出海綿栓后肌肉注射一定量前列腺素[9]。

1.3.3 口服。每日將12 mg甲地孕酮均勻拌于每頭發情母羊所食用的飼料中，保證采食后連續投喂數天，綿羊14～16 d，山羊18～20 d，停藥不久即會發情[10]。

1.3.4 前列腺素法。前列腺素法為最簡單的同期發情方法，在繁殖季節使用效果最佳。肌肉注射進行同期發情，使用二次注射法，每次劑量為10～20 mg，2次間隔時間為11～12 d。大量研究表明，一次注射法同期發情效果不明顯[11]。生產上常使用氯前列腺烯醇進行發情處理。

1.4 胚胎的收集

胚胎的采集是胚胎移植的關鍵環節技術之一，羊胚胎移植通常在桑葚胚至囊胚期進行胚胎收集和移植。胚胎收集時間要根據胚胎發育情況來確定，一般在配種后3～4 d發育至桑葚胚，6～7 d發育至囊胚期。胚胎收集分為手術法和非手術法2種。在綿羊、山羊中，由于試驗動物子宮角特殊的解剖結構，常使用手術法進行采胚。

1.4.1 手術法。供體母羊沖胚前禁水、禁食12～24 h[12]。手術在手術室進行，維持手術室溫度在20 ℃左右，肌肉注射2%靜松靈0.5～0.8 mL進行麻醉[13]，所有手術器材都應進行無菌處理。將供體羊仰臥保定，使之呈前低后高的狀態，沿腹中線兩側離乳頭2.5 cm左右處進行刮毛處理，用碘酒棉球進行術部消毒后做一切口，切口大小以能拉出子宮角和輸卵管為宜[14]。

當確定受精卵還處于輸卵管時，用帶有磨鈍針頭的無菌注射器刺入子宮角尖端，每側輸卵管沖胚液用量10 mL左右，從輸卵管傘部接取胚胎液。當確定所有受精卵已進入子宮角內時，用止血鉗在子宮角基部穿孔，插入沖胚管，注入適當空氣，使氣囊封阻子宮腔為宜；然后用無菌注射器注入沖胚液30～50 mL，再由此導出胚胎液，兩側子宮角沖胚完畢后，放出一部分氣體，將沖胚管抽至子宮體內，用10 mL無菌注射器注入溶解有320萬IU青霉素和100萬IU鏈霉素的生理鹽水10 mL，沖胚完畢后逐層縫合，將子宮體送入腹腔，防止發生子宮黏連。沖胚后2 d肌肉注射前列腺素0.4～0.6 mg以溶解卵巢上的黃體，以便下次發情周期的發生[15]。

1.4.2 非手術法。將供體羊伏臥保定在保定架上，使之呈前低后高的狀態，于外陰部周圍剪毛、洗凈、消毒，用0.05%新潔爾滅溶液沖洗陰道，排凈洗液（其他所用器械均按常規消毒）。借助開腟器，用人醫用的子宮頸鉗夾住子宮頸口的凸起皺褶，將子宮頸緩慢向外牽引至陰門附近，由助手固定子宮頸鉗，術者將左手食指深入陰道，右手持預先套好導管的探針（導管由獸用中號套管針改制，探針由人醫用子宮探針或膽囊探針改制），使前端稍呈彎曲，在左手食指輔助下，沿著子宮頸管螺旋形的內腔緩慢向深處插入。套有導管的探針通過整個子宮頸管后（深5～8 cm，阻力消失），即將探針略偏向一側繼續推進2～3 cm。拔出探針，從導管內插入采卵管（用人醫小兒胃管改制），采卵管即達該側子宮角頂端（深約30 cm）。隨后用10 mL無菌注射器吸取加溫至38～39 ℃的1×PBS（磷酸鹽緩沖液）6～8 mL，自采卵管注入子宮角，立即回收沖胚液?；厥諘r微微前后轉動采卵管，以防孔道被子宮黏膜堵塞。如此反復沖洗3次[16]。

1.5 胚胎的檢查和評定

沖胚液回收之后，盡快在20 min內置于體視鏡下檢查收集到的胚胎，并用檢胚細管將胚胎移至新鮮培養液滴中，移胚時注意動作緩慢，防止胚胎跑飛。通過體視鏡來對胚胎形態進行質量分級鑒定，即將體視鏡調至80～100倍，觀察胚胎形態、卵裂球的大小與均勻度、透明帶的間隙、變性等情況，只有形態、結構正常的胚胎才能進行移植[17]。一個理想的胚胎，其發育階段應與回收時達到的胚齡保持一致，胚胎大小均勻，結構緊湊，透明帶均勻一致，胚內細胞間的界限清晰可見，沒有不規則分布的空泡，無細胞碎片。

1.6 胚胎的移植

胚胎的移植是胚胎移植技術的最后一個關鍵技術環節。胚胎的移植技術決定移入受體的早期胚胎能否順利發揮其遺傳潛能而發育成一個完整后代。與采胚方法相同，羊胚胎移植也分為手術法和非手術法2種。移植時注意觀察受體羊兩側卵巢的紅體（排卵點）的分布情況，卵巢上無紅體或紅體發育不健全的受體羊不作為羊胚胎移植受體。

1.6.1 手術法。常使用含5%胎牛血清的D杜氏磷酸緩沖液移植[18]。同期發情處理后的受體母羊限水、禁食24 h進行，手術前對手術部位剪毛、剃毛、消毒。肌肉注射2%靜松靈0.5～0.8 mL進行麻醉，手術器械等用0.1%新潔爾滅液浸泡30 min常規消毒，烘干待用。移植方法同胚胎采集方法。為了使胚胎發育階段與其應所處的生理狀態一致，應將16-細胞之前的細胞移入輸卵管，而桑葚胚以后的胚胎移入子宮角前1/3，提高胚胎成功附植到受體子宮而發育成完整個體的可能性[19]。

1.6.2 非手術法。在受體發情后6～12 d，通過人醫用的子宮探針或膽囊探針作導管的引子，使探針前端稍彎曲，導管便能順著子宮頸螺旋形管道前進，把胚胎注入子宮頸內[16]。此法操作技術繁瑣復雜，需反復實踐練習。

2 羊胚胎移植的應用現狀

胚胎移植技術是繼人工授精之后最具有應用價值的生育繁殖技術，能夠大大提高繁殖效率，充分發揮良種母羊的繁殖能力，保證優良品種的大量擴繁。近年來，我國普遍從國外進口優質胚胎來解決我國優質種羊品種短缺問題，各級畜牧獸醫技術推廣部門及畜禽生產公司從澳大利亞、新西蘭、德國等畜牧業發達國家引進大量優質羊胚胎，用于擴繁優良品種種群體系，收效顯著。我國國家科技攻關項目“肉羊舍飼、半舍飼養殖關鍵技術研究與產業化示范”將羊的胚胎移植作為關鍵技術之一，進行了產業化試驗與示范；同時，“十五”期間，在內蒙古等地還實施了綿羊的“萬枚胚胎工程”項目。這些項目的實施和完成，為我國肉羊產業的發展作出了突出性貢獻。但是，目前我國羊胚胎移植應用現狀與發達國家相比，還不夠成熟，主要體現在以下幾個方面。

（1）胚胎移植是一項比較復雜的生物繁育技術，要求項目管理人員及操作人員具備相當高的理論知識水平以及豐富的實踐操作經驗。目前，我國掌握高水平羊胚胎移植技術的專業人員非常匱乏，除了高校、科研院所及專業移植公司有少量專業人員掌握該項技術外，基層畜牧推廣單位及人員很少具備此項技能，限制了羊胚胎移植技術的推廣和應用。因此，加強基層專業技術人員的培訓力度，讓更多的基層人員掌握胚胎移植技術，使胚胎移植技術在優秀種羊的引種、擴繁、品種改良與育種等方面發揮關鍵作用[20]。

（2）羊在胚胎移植后，營養水平不精細、飼養條件粗放、環境衛生不達標，是導致成功率低的主要因素。因此，應加強對飼養人員的技術指導，培養飼養員科學的飼養管理意識，保證羊胚胎移植后飼養環境清潔、舒適，并設計科學的飼養配方，給予充足的營養，提高胚胎發育成完整個體的潛力，從而提高移植率和產羔率。

（3）胚胎移植花費較高，整個流程耗費大量的人力物力財力，主要包括購買試劑耗材、大型實驗儀器、供體羊受體羊的購置及相關人員的培訓指導費。因此，國家有關部門及地方政府進一步加大胚胎移植技術方面的財政補貼補助，落實支持畜牧業發展的項目規劃，將有利于此項技術的推廣和應用，推動羊品種改良進程[20]。

（4）隨著肉羊產業的迅速發展，胚胎移植技術在種羊生產上的應用不斷推進，目前，有不少地方對胚胎移植市場的監管不到位，導致品種惡意炒作、假冒偽劣現象屢有發生。因此，國家畜牧獸醫行政主管部門應肩負起責任，加強市場監管，制定相關規定，嚴厲打擊假冒偽劣品種，使羊胚胎移植市場能夠健康、高效、持續地發展。

3 結語

隨著我國居民生活水平不斷提高，傳統的肉羊飼養和繁育模式難以滿足人民對肉羊需求。羊胚胎移植技術的誕生和廣泛應用，改變了傳統的繁殖和生產方式，提高了養羊業的生產效率，推動了現代化畜牧業的發展，保障了優質、足量的羊肉供應。羊胚胎移植技術的規范應用，必將對我國肉羊生產的持續發展產生深遠的影響。

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