酮體抑制大鼠海馬神經元酸敏感通道的開放

朱飛 徐秦嵐 郭安臣 王群

癲癇是一種常見的神經系統慢性疾病，患病率為4‰～7‰，目前全球約有5 000萬癲癇患者，我國癲癇患者人數約900萬。臨床上大約有70%的癲癇患者可以通過藥物控制發作，但是仍有約30%的患者為藥物難治性癲癇。對于難治性癲癇患者來說，盡管經過長期抗癲癇藥物治療仍然發作頻繁，長期癲癇發作會嚴重影響患者的日常生活和學習、工作能力，損害患者的認知功能，導致患者出現嚴重的精神、心理障礙[1]。難治性癲癇的控制已經成為一項重要的公共衛生問題，基于新靶點的抗癲癇藥物研發有重要的臨床意義。

生酮飲食是一種高脂肪、低碳水化合物飲食，其治療難治性癲癇療效確切[2-3]，然而作用機制尚不十分明確。長期生酮飲食患者不易耐受，并引發諸多不良反應，例如兒童生長發育延遲、成人動脈粥樣硬化風險增加等[3-4]，所以明確生酮飲食的作用機制，并應用于新藥研發有重要意義。生酮飲食中多余的脂肪被分解代謝為酮體，包括乙酰乙酸、β羥丁酸和丙酮，目前有研究認為給動物急性注射酮體可以抑制癲癇發作[5-7]，然而具體機制尚不明確。因為酮體是一種酸性物質，而酸敏感通道是一種酸性條件下激活的H+門控通道，據此推測酮體和酸敏感通道之間可能存在一定相關性。所以，本研究針對難治性癲癇的治療新方法進行研究設想，利用膜片鉗技術探討三種酮體對于海馬神經元表面酸敏感通道電流的影響，為基于“酮體—酸敏感通道”的抗癲癇新藥靶點提供一定的理論基礎。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取出生24 h內的Wistar乳鼠(由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供)，原代培養大鼠海馬神經元。

1.2 主要試劑及儀器設備

1.2.1 主要試劑 乙酰乙酸鋰、β羥丁酸、丙酮、多聚賴氨酸、左旋谷氨酰、胰酶、谷氨酸、葡萄糖(以上試劑購自sigma)，B27補充劑、胎牛血清、DMEM、神經元培養基(以上試劑購自gibco)，青霉素/鏈霉素(Hyclone)，HEPES(santa cruz)，PBS(TaKaRa)。

1.2.2 主要儀器設備 EPC10膜片鉗放大器Heka(Germany)，數據獲取軟件Heka(Germany)，微電極拉制儀(P97，Sutter Instruments)，分析軟件Molecular Device(USA)，二氧化碳細胞培養箱Esco(Singapore)，倒置顯微鏡Motic(IX71，Olympus)，微操縱器(MP285，Sutter Instruments)，毛細玻璃管(BF150-86-10，Sutter Instruments)，移液器Eppendorf(Germany)。

1.3 實驗步驟

1.3.1 原代培養大鼠海馬神經元 新生鼠迅速斷頭，剝離大腦放入冰的PBS中，等待2 min；把腦取出放入一倒有冰PBS的平皿中，將海馬取出，放置于10 mL含冰PBS離心管中；將海馬放入冰的PBS中洗1～2次；吸干PBS，加入胰蛋白酶，37 ℃培養箱中20 min，每隔5 min搖晃一下；取出酶消化后的組織，吸去酶液，加入冰的PBS終止反應，洗2～3次；靜置2 min，去掉上層液體；加入1 mL的DMEM進行吹打，15次后靜置2 min，收集上清液，放入離心管中；再加入1 mL DMEM，繼續吹打10次，再收集上清液入同一皿中；第3次再加1 mL，重復操作，3次后未消化的組織棄掉；將收集到的上清液放入預先鋪好的板中搖勻；4小時后輕搖幾下，把死細胞和碎片吸走，再用DMEM清洗1次后換neurobasal+b27+L-Glu培養液；第2 d，半數換液；隔2 d換1次。

1.3.2 膜片鉗技術檢測酮體對大鼠海馬神經元酸敏感通道開放狀態的影響用微電極拉制儀將毛細玻璃管拉制成記錄電極，電極填充內液，在倒置顯微鏡下操縱微電極操縱儀，將記錄電極接觸到細胞上，給予負壓抽吸，形成GΩ封接；形成GΩ封接后進行快速電容補償，然后繼續給予負壓，吸破細胞膜，形成全細胞記錄模式；然后進行慢速電容的補償并記錄膜電容及串聯電阻；電壓鉗模式下-70 mV穩定5 min后-80 mV下進行酸敏感通道記錄。所得數據Clampfit進行線下分析。

1.4 統計學處理

2 結 果

乙酰乙酸、β羥丁酸和丙酮均可以顯著抑制大鼠海馬神經元表面酸敏感通道的開放。在pH6.0條件下分別向細胞外液中加入三種酮體后酸敏感通道的電流波幅均顯著降低，抑制率分別為92、47、77%(圖1～3，表1～3)。

圖1 乙酰乙酸可以顯著抑制大鼠海馬神經元表面酸敏感通道的開放

3 討 論

癲癇是神經系統第二大疾病，患病率為4‰～7‰，目前全球約有5 000萬癲癇患者，我國癲癇患者人數約900萬。癲癇是一種慢性病，給個人、家庭和社會帶來嚴重的負面影響，無論在發達國家還是在發展中國家癲癇都已經成為一個重要的公共衛生問題。目前臨床上大約70%的癲癇患者可以通過藥物控制發作，但是仍有約30%患者為藥物難治性癲癇。對于藥物難治性癲癇患者來說，盡管經過長期正規抗癲癇藥物治療仍然發作頻繁。長期癲癇發作會嚴重影響患者的日常生活和學習、工作能力，損害患者的認知功能，并引發患者出現嚴重的精神、心理障礙[1]，所以對于難治性癲癇的控制顯得尤為重要?；谛掳悬c的抗癲癇藥物研發有重要意義，可能帶來巨大的社會效益和經濟效益。

表1 乙酰乙酸對大鼠海馬神經元酸敏感通道電流的抑制作用

注：與對照組比較，*P<0.05

圖2 β羥丁酸可以顯著抑制大鼠海馬神經元表面酸敏感通道的開放

表2 β羥丁酸對大鼠海馬神經元酸敏感通道電流的抑制作用

注：與對照組比較，*P<0.05

圖3 丙酮可以顯著抑制大鼠海馬神經元表面酸敏感通道的開放

表3 丙酮對大鼠海馬神經元酸敏感通道電流的抑制作用

注：與對照組比較，*P<0.05

難治性癲癇發作頻繁，迫切需要新的抗癲癇藥物治療靶點。生酮飲食是一種高脂肪、低碳水化合物飲食，治療難治性癲癇效果確切，但機制尚不明確。長期生酮飲食患者不易耐受，如能明確其作用機制并應用于新藥研發將有重要意義。在生酮飲食中過多的脂肪被分解代謝為酮體(包括乙酰乙酸、β羥丁酸、丙酮)，有研究表明給動物急性注射酮體可以抑制癲癇發作，說明生酮飲食可能通過酮體來發揮作用，但具體機制尚不明確。因為酮體是一種酸性物質，而酸敏感通道是酸性條件下開放的通道，所以本研究設想酮體可能通過調節酸敏感通道來發揮作用。

生酮飲食是一種高脂肪、低碳水化合物飲食，對于難治性癲癇的療效確切[8]，但具體機制尚不明確。長期生酮飲食患者不易耐受，并引發諸多不良反應，如嚴重胃腸道反應、兒童厭食癥、營養元素缺乏、生長發育遲滯以及成人動脈粥樣硬化風險增加等[3-4]。所以，明確生酮飲食的抗癲癇作用機制，應用于新藥研發，保留其主要抗癲癇效果，同時避免長期高脂飲食的痛苦，將有重要的臨床意義。

在生酮飲食中多余的脂肪酸在肝內進行β-氧化產生乙酰輔酶A，之后被分解代謝為酮體，包括乙酰乙酸、β-羥丁酸和丙酮。有研究認為生酮飲食的抗癲癇作用與酮體有關，急性給予酮體在多種動物癲癇模型中均能夠有效控制癲癇發作[5-6]，但是具體機制尚不十分明確，有研究認為酮體可能通過作用于K+ATP通道、NMDA或GABA通道來發揮作用[9,10]。

因為酮體是一種酸性物質，而酸敏感通道是一種酸性條件下激活的H+門控通道，所以本研究推測酮體與酸敏感通道可能有一定相關性，因此利用膜片鉗技術檢測酮體對海馬神經元表面酸敏感通道電流的影響，結果發現三種酮體均可以顯著抑制海馬神經元酸敏感通道的開放，抑制率分別為92、47和77%。據此本研究推測生酮飲食可能是通過其代謝產物酮體抑制酸敏感通道從而發揮抗癲癇作用。

目前已知酸敏感通道(ASICs，Acid-sensing ion channels)，也稱作H+門控離子通道，是一類被質子激活的陽離子通道，屬于退化素/上皮鈉離子通道(degenerin/epithelial Na+ channels,DEG/ENaC)家族，因為H+是ASICs通道激動劑，所以ASICs又可以被看成配體調控的通道家族。ASIC家族成員包括4種基因(Asic1,Asic2,Asic3,Asic4)，到目前為止，已經克隆出ASICs的6個亞單位ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3、ASIC4。組織酸化是激活ASICs的必要條件，ASICs的激活有賴于pH值快速(<1 s)且顯著的下降[11-13]。

目前ASICs被視為是酸毒性損傷的重要治療靶點，并得到了廣泛的研究[14-15]。Xiong等[16]的研究顯示，腦缺血中腦細胞無氧代謝增強，pH嚴重下降，導致嚴重酸中毒而致ASIC1a激活，鈣離子大量內流，細胞鈣超載后大量死亡。應用特異性ASIC1a受體阻斷劑PcTX或非特異性的ASICs受體阻斷劑阿米洛利后發現，不論是體內還是體外實驗酸中毒所致的神經元損傷都有顯著的減輕，腦梗死的范圍也大大下降，提示ASIC1a介導了腦缺血過程中酸中毒所致的神經元死亡。因為癲癇發作，尤其是癲癇持續狀態也是一種嚴重的傷害性刺激，所以本研究推測嚴重癲癇發作后也可能會產生酸敏感通道介導的腦組織酸毒性。又因為酮體可以抑制酸敏感通道開放，所以推測酮體可以通過抑制酸敏感通道介導的腦組織酸毒性，起到一定的神經保護作用。這一假說有待于進一步研究證實。

目前有關酸敏感通道和癲癇關系的研究主要集中在癲癇發作后體內某些酸敏感通道亞單位的表達變化以及某些拮抗劑對癲癇發作的直接作用上。Wu等[17]研究發現給大鼠腹腔注射ASICs拮抗劑阿米洛利能減少大鼠出現RACINE 4級癲癇的比例。癲癇持續狀態后ASIC1a/ASIC2a異聚體在梨狀皮層急性期表達減少，而在之后的慢性自發性癲癇期增多。Jingjing Liang等[18]給大鼠腹腔注射ASICs拮抗劑阿米洛利后觀察大鼠EEG，發現阿米洛利顯著減少大鼠匹羅卡品誘發的放電頻率，同時發現癲癇持續狀態后ASIC1a和ASIC3表達增多。O.Ievglevskyi等[19]利用膜片鉗技術觀察非選擇性ASICs抑制劑5p對海馬腦片放電的影響，發現抑制ASICs后自發性抑制性突觸后電位放電頻率增強，抑制ASICs能夠減弱無鎂模型和KA模型誘發的癲癇樣放電。綜上所述，非選擇性ASICs受體拮抗劑可以抑制癲癇發作。因為本研究發現酮體可以抑制酸敏感通道，據此推測酮體可以通過抑制酸敏感通道來減弱神經元興奮性，發揮抗癲癇作用。

綜上所述，酸敏感通道某些拮抗劑可以抑制癲癇發作，并且酸敏感通道介導了機體酸毒性作用，而酮體可以抑制酸敏感通道，所以本研究推測酮體可能通過兩條途徑來發揮抗癲癇作用，一方面可以直接抑制酸敏感通道來減弱神經興奮性；另一方面可以抑制酸敏感通道介導的酸毒性作用，在癲癇發作過程中起到神經保護作用?！巴w—酸敏感通道”有望成為難治性癲癇藥物治療新靶點，基于“酮體—酸敏感通道”的抗癲癇機制研究有重要的臨床意義。