肌球蛋白輕鏈激酶介導腸黏膜上皮屏障功能變化的研究進展

王夢雅 高 民 徐 明 胡紅蓮*

(1.內蒙古農業大學動物科學學院，呼和浩特010018；2.內蒙古農牧業科學院動物營養與飼料研究所，呼和浩特010031)

腸道是動物機體消化吸收營養物質的主要場所，而黏膜作為腸道上皮的重要屏障，可有效阻擋腸道內微生物及其毒素向體內其他組織器官和血液循環擴散[1]，在侵襲與抗侵襲過程中保持動態穩定[2]。腸黏膜上皮屏障的完整性對于維持消化系統甚至整個動物機體的健康具有重要作用，當其遭到破壞或功能失調會促進腸道感染性疾病的發生，嚴重時會導致全身性炎癥反應或多器官功能衰竭[3-4]。肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)是腸黏膜上皮屏障功能變化最主要的鈣調素激酶，隨著對其結構和功能的深入研究，MLCK在介導腸黏膜上皮通透性改變中所起的作用受到眾多學者的廣泛關注，近年來已成為分子生物學和細胞生物學領域的研究熱點之一。因此，了解MLCK介導腸黏膜上皮屏障功能變化的調控機制對動物營養學研究具有重要意義。

1 MLCK的結構及生物學功能

1.1 MLCK的基本結構

MLCK是第1個被發現的依賴于鈣調蛋白(calmodulin,CaM)的絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，在真核生物的肌細胞以及哺乳動物的非肌細胞中動態調節肌動球蛋白重組和細胞收縮[5]。MLCK在哺乳動物中主要有mylk1和mylk2 2種基因編碼[6]，分為橫紋肌型MLCK(skeletal muscle MLCK,skMLCK)和平滑肌型MLCK(smooth muscle MLCK,smMLCK)，二者分別位于不同的染色體上，其中skMLCK僅限于在骨骼肌組織中表達，其基因編碼1個催化結構域以及由自動抑制區和Ca2+/CaM結合序列組成的調節區域[7]。但由于啟動子的不同，smMLCK以細胞特異性方式表達出3種轉錄本。其中分子質量為130 ku的稱為短鏈MLCK(S-MLCK)，在機體的大多數組織中都有表達，其在胃腸道基本緊張狀態的維持、胃排空以及小腸推動等基本動力方面發揮重要的調節作用[8]；而分子質量為220 ku的稱為長鏈MLCK(L-MLCK)，主要分布于胚胎組織、體外培養細胞、上皮細胞和非肌細胞中[9]。研究發現，在腸上皮細胞中，肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)發生磷酸化主要是由L-MLCK表達所引起[10]。smMLCK基因的第3種轉錄本編碼的是C末端的免疫球蛋白T(lgT)樣結構。

Feng等[11]研究發現，哺乳動物smMLCK保守結構域如圖1所示。smMLCK N末端的肌動蛋白結合位點由3個DFRxxL基序組成，且能與純化的F肌動蛋白結合，將酶鎖定在收縮裝置內[12-13]。免疫球蛋白(Ig)1和Ig2 2個結構域也與肌動蛋白結合[14]，而IgT結構域與C末端的平滑肌肌球蛋白(smooth muscle myosin,SMM)結合，該結構蛋白對于維持平滑肌細胞中肌球蛋白纖維的穩定性具有重要作用[15]。中心激酶結構域作為MLCK、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)以及調節性肌球蛋白Ⅱ輕鏈(regulatory myosin Ⅱ light chain,RLC)結合位點的催化部位，可將ATP上的磷酸轉運到底物上[16]。

DFRxxL：D、F、R和L分別為天冬氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和亮氨酸，x為任意氨基酸；Actin binding：肌動蛋白結合位點；CaM binding：鈣調蛋白結構域；Proline rich repeat：富脯氨酸重復序列；Function unknown：功能未知；Ig1：免疫球蛋白1；Ig2：免疫球蛋白2；Fn：纖維蛋白3型結構域；Catalytic：催化；Kinase：激酶結構域；RLC and ATP binding：調節性肌球蛋白Ⅱ輕鏈和三磷酸腺苷結合位點；Autoinhibitory：自抑制作用；IgT：免疫球蛋白T；Myosin binding：肌球蛋白結合位點；Telokin Ig：免疫球蛋白超級家族Telokin蛋白。

圖1哺乳動物smMLCK結構域

Fig.1 Domain structure of smMLCK of mammalian[11]

除此之外，在非脊椎動物中也發現了與MLCK有關的激酶。在果蠅中，1個有復雜啟動子的基因會產生多個具有相同末端的轉錄本[17]，較小的轉錄本(3.2～5.2 kb)編碼的蛋白質與哺乳動物的MLCK大小相似；而較大的轉錄本(13～25 kb)編碼的蛋白質類似于哺乳動物的蛋白質titins；最大的轉錄本(25 kb)編碼1個926 ku的stretchin MLCK。另外，在線蟲和海兔中表達的MLCK相關激酶為twitchin，其也有1個結合到催化結構域上的自動抑制區，但不含有Ca2+/CaM結合序列，是由Ca2+結合蛋白S100A12激活[18]。在盤基網柄菌中表達的MLCK只含有催化結構域和被磷酸化以激活的調節區域，是結構最為簡單的一種[19]。

1.2 MLCK的生物學功能

MLCK是細胞收縮的關鍵調控因子，其主要功能是介導MLC發生磷酸化[20-21]，研究表明，Ca2+/CaM是MLCK活性最重要的調節器。當外來不同信號刺激時，細胞內游離的Ca2+濃度升高，Ca2+首先與CaM結合形成Ca2+/CaM復合體，MLCK能夠與Ca2+/CaM復合體結合解除MLCK的天然抑制序列，形成激活的p-MLCK[7,11]。而p-MLCK使MLC上第18位蘇氨酸(Thr18)和第19位絲氨酸(Ser19)殘基的磷酸化水平升高，改變MLC的空間構象[22]。磷酸化的MLC可活化肌球蛋白重鏈頭部的ATP酶，所產生的能量使肌動蛋白與肌球蛋白相互作用，介導肌動蛋白發生收縮。Ca2+/CaM也可與DFRxxL結合導致肌動蛋白結合減弱[23]，使細胞骨架肌動蛋白微絲滑動，引起細胞骨架重排，細胞發生向心性收縮，細胞間的緊密連接(tight junction,TJ)被破壞，直接催化MLC從非磷酸化型向磷酸化型轉變，導致細胞黏膜通透性增加[24]。此外，Kamm等[7]和Simard等[25]研究發現，MLCK不僅可以調節細胞收縮，而且對細胞遷移、運動以及細胞凋亡具有調控作用。

2 MLCK介導腸黏膜上皮屏障功能變化的信號轉導機制

機械屏障作為腸黏膜屏障的重要組成部分，主要由腸上皮細胞和相鄰細胞間的連接構成。而細胞要協調發揮各種功能，則有賴于細胞黏著和細胞連接。細胞的連接方式主要分為TJ、黏著連接(adhesion junction,AJ)、間隙連接(gap junction,GJ)和橋粒連接(desmosome junction,DJ)[26]，其中TJ是腸上皮細胞間最重要的連接方式，調控著水和溶質等小分子物質的跨上皮轉運，是決定細胞間通透性的關鍵因素[27]，在腸黏膜上皮屏障功能的維護中起著舉足輕重的作用。TJ的結構蛋白主要由跨膜蛋白家族(包括緊密連接蛋白Claudin、Occludin)和外周支架蛋白(緊密連接蛋白ZO)構成。Blair等[28]研究發現，MLCK通過調節Claudin、Occludin及ZO的蛋白質表達，可引起腸黏膜通透性增加，由此可知，MLCK在TJ通透性動態調節過程中發揮重要作用[29]。研究表明，上皮細胞收縮性改變是不同原因引起腸黏膜通透性增加的共同通路，主要受骨架蛋白中肌球蛋白和肌動蛋白的影響，肌球蛋白的主要作用是調控細胞骨架結構并參與細胞的多種生理活動，而這些主要是通過MLC的磷酸化與去磷酸化來實現。MLC發生磷酸化是生物屏障通透性增加的分子基礎[30-31]，是腸上皮TJ屏障功能障礙的關鍵所在。多種細胞因子、炎癥介質等神經及體液介質均可通過MLC磷酸化而引起黏膜通透性增加[32-33]。因此，在MLCK介導的腸黏膜上皮細胞通透性增加中，效應分子MLC磷酸化是關鍵環節，而MLCK的激活可通過下列途徑進行調控。

2.1 促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路

MAPK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，由Sturgill等[34]首次從3T3-L1脂肪母細胞中純化出來。研究證實，MAPK存在于所有生物體的大多數細胞內，是真核生物細胞重要的信號轉導系統之一，可將細胞外信號刺激傳導至細胞及其核內部。MAPK通過影響基因轉錄和調控，進而影響細胞的生物學功能[35]。MAPK信號轉導通路在細胞內具有生物進化的高度保守性。目前發現，MAPK信號系統主要包括細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、p38 MAPK和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)，其中ERK在維持細胞形態和構建細胞骨架方面發揮重要作用。研究表明，ERK1/2的激活可促使下游轉錄激活因子ETS樣蛋白1(Elk-1)的激活并遷移到細胞核內，與位于最小啟動子區域(-310～-296)內的順式結合位點相結合，觸發MLCK基因活化以及MLC磷酸化，導致腸上皮細胞TJ受損，黏膜通透性增加[36]。另有研究表明，同型半胱氨酸通過促進絲裂原活化細胞外信號調節激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase,MEK)-ERK-MLCK蛋白磷酸化影響結腸炎大鼠的腸黏膜通透性，進而加重腸道的炎癥過程[37]。而Al-Sadi等[36]發現，白細胞介素-1β(IL-1β)誘導的腸上皮細胞TJ通透性增加是通過ERK1/2信號轉導途徑調節MLCK基因表達來介導的，在敲除ERK1/2或使用ERK1/2抑制劑后能有效抑制MLC磷酸化。因此，ERK在MLCK誘導的腸黏膜上皮細胞通透性增加中起到重要作用。

在燒傷引起的小鼠腸道屏障功能損傷中，p38 MAPK信號通路可激活MLCK，導致腸黏膜組織形態發生改變，上皮細胞間TJ通透性增加。注射p38 MAPK抑制劑后會降低p38 MAPK磷酸化水平和MLCK基因表達水平。由此可見，MAPK信號通路在MLCK介導的腸黏膜上皮屏障功能紊亂及細胞通透性改變中占據重要地位。

2.2 MLCK介導的MLC磷酸化信號通路

腸黏膜通透性改變與MLCK的調節密切相關，而MLC發生磷酸化是腸黏膜上皮TJ屏障功能障礙的關鍵所在。Moriez等[38]研究發現，注射脂多糖后大鼠的上皮細胞TJ擴張，MLCK被激活，MLC磷酸化程度增加，使得細胞收縮和細胞間隙形成，最終影響結腸黏膜的通透性。注射MLCK特異性抑制劑ML-7后能夠顯著降低MLCK的活性及其所誘導的屏障功能紊亂。研究報道，用炎性因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和干擾素-γ(IFN-γ)處理后的單層上皮細胞模型中，MLCK的表達水平上調，MLC磷酸化明顯升高，上皮細胞的屏障功能遭到破壞，而這些結果均能夠被MLCK抑制劑所改善[39]。以上結果表明，MLCK所介導的MLC磷酸化信號通路在內毒素或不同炎性因子所引起的腸上皮屏障功能損害的發生機制中具有重要作用。

陳傳莉[40]研究表明，小鼠早期嚴重燒傷以及缺氧引起的腸黏膜通透性升高，會伴隨有MLCK蛋白表達水平及MLC磷酸化程度增加，注射ML-9抑制劑后MLC磷酸化被抑制。除此之外，MLCK所介導的MLC磷酸化信號通路也參與了熱應激所導致的腸黏膜上皮屏障功能損害的發生，當注射ML-7特異性抑制劑后能夠阻止MLC磷酸化以及腸黏膜上皮通透性增加。

MLC磷酸化除了主要受MLCK的調控外，還受到肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)的負調控[41]。Rho激酶(Rho kinase,ROCK)能夠與MLCP亞基作用，造成MLCP失活，進而阻止MLCP對MLC的去磷酸化作用，使得胞漿內的MLC磷酸化水平增加[42]。嚴重燒傷后腸黏膜ROCK激活和MLC磷酸化水平增加，是導致大鼠腸黏膜通透性增加及屏障功能損害的分子機制之一。因此，ROCK激活是導致MLC磷酸化的又一原因。

2.3 蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)

PKC是20世紀70年代被發現的一類由Ca2+激活的磷脂依賴性蛋白激酶，在哺乳動物的組織、器官以及細胞中廣泛分布，通過蛋白質磷酸化的催化作用，對動物細胞生長、分化、代謝、信息傳遞及信號轉導等具有重要的調節作用[43]。PKC的分子質量為70～90 ku，分子結構由N端的調節區域和C端的催化區域組成，該蛋白激酶一旦被激活會轉移到細胞膜對其蛋白底物進行磷酸化作用并引發許多細胞內反應[44]，但在不同的細胞中，PKC激活的亞型及主要通路有所不同。作為一種蛋白激酶，PKC可直接作用于MLC的絲氨酸/蘇氨酸殘基，使MLC發生磷酸化；也可通過激活MLCK，引起細胞骨架蛋白MLC磷酸化而導致細胞結構蛋白的重組排列[45]。研究表明，當腸黏膜上皮細胞PKC被激活后，MLCK磷酸化狀態及其酶活性會發生改變，進而引起MLC磷酸化狀態的改變，影響周圍連接肌動球蛋白環的收縮，最終導致腸黏膜上皮通透性增加[46]。因此，PKC可通過磷酸化MLCK介導腸黏膜上皮屏障功能發生改變。

2.4 Ca2+濃度

Ca2+在維持腸黏膜上皮正常生理功能中扮演重要角色，細胞內游離Ca2+濃度改變調節著細胞的能量代謝、蛋白質磷酸化和去磷酸化修飾、基因表達和調控等活動[47]。Ca2+是調節MLCK活性的最基本介質，通過與CaM結合并激活MLCK是決定MLC磷酸化和引起細胞收縮的重要因素[23,48]。研究表明，細胞外Ca2+濃度降低時能夠激活細胞內MLCK的活性，肌動蛋白和肌球蛋白發生向心性收縮，細胞間TJ破壞，進而導致腸黏膜上皮屏障功能遭到破壞，使其通透性增加[49]。Ma等[50]研究發現，Ca2+誘導的腸黏膜上皮TJ屏障功能改變與MLCK激活有關，使用MLCK抑制劑ML-7后能夠阻止MLCK活化以及腸黏膜上皮細胞通透性增加，這說明Ca2+通過活化MLCK引起腸黏膜上皮通透性增加。此外，Ca2+通道是一種細胞膜上的、與Ca2+轉運相關的特定蛋白質，其激活對于細胞內外Ca2+濃度的調控至關重要，Ca2+通道在MLCK介導腸黏膜上皮通透性增加的過程中也發揮重要作用。

3 小 結

多種信號分子可通過不同的信號轉導通路激活MLCK，導致腸黏膜上皮屏障功能紊亂。其中MLCK介導的MLC磷酸化為MLCK介導腸黏膜通透性增加的關鍵環節，同時也是細胞內多種信號通路的中心環節。MLCK活性及其蛋白質表達水平增加均可引起MLC磷酸化程度增加，細胞間TJ發生改變，導致細胞收縮和細胞間隙增大，從而影響腸黏膜上皮屏障功能，通透性增加。近年來，MLCK介導腸黏膜上皮屏障損傷機制的研究取得了很多進展，但有關這方面的研究主要集中在人類和單胃動物上，在反芻動物上的研究較少，因此，有必要進一步探索MLCK對反芻動物腸黏膜上皮屏障功能及分子調控機制的影響。同時，隨著大數據時代的到來，生物信息學在動物營養學代謝疾病的研究中取得廣泛應用，這對更好地挖掘參與MLCK介導反芻動物腸黏膜通透性改變的關鍵信號通路以及相關的上下游功能基因具有指導意義，更為今后探索防治腸黏膜上皮屏障功能損害的新型技術措施提供理論依據。