動物外泌體的生物學功能研究進展

權素玉 南雪梅 蔣林樹 熊本海*

(1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，動物營養學國家重點實驗室，北京100193；2.北京農學院，奶牛營養學北京市重點實驗室，北京102206)

隨著生物進化過程，原核生物和真核生物均已進化出簡潔而高效的細胞間通訊策略。經典的細胞生物學認為，細胞間通訊有以下2種方式：通過直接接觸相互作用或者分泌可溶性因子如激素、生長因子、細胞因子等間接作用。近十多年的研究發現，細胞外囊泡，尤其是外泌體，作為第3種新發現的重要的細胞間通訊載體，能夠介導細胞之間蛋白質、脂質和核酸等生物大分子的轉運，廣泛影響機體的生理病理過程[1]。目前，畜牧學關于外泌體為數不多的研究集中于乳中，林德麟等[2]綜述了豬乳、人乳和牛乳中外泌體miRNAs的異同。miRNAs是外泌體重要的生物活性成分，被外泌體包裹以后可抵抗幼畜胃腸道的消化及血液中RNase的分解，通過血液循環運送至免疫器官調控其基因表達，為幼畜提供重要的免疫保護機制[1]。

1 外泌體的來源及發現

1983年，Pan等[3]首次發現體外培養的未成熟綿羊網織紅細胞在分化過程中可釋放由內吞作用產生的多囊泡聚集體，該小囊泡里含有細胞膜轉鐵蛋白受體，隨后，這些多囊泡聚集體被命名為外泌體。最初，研究者認為外泌體是清除細胞膜碎片和淘汰細胞膜表面分子的細胞組分，將被溶酶體徹底降解，不再回到細胞外環境循環利用。也有人認為外泌體是培養基中死細胞膜碎片被分離純化后的產物。10年后，Raposo等[4]闡明這些囊泡也可從Epstein Barr病毒侵染的B淋巴細胞分離出來，并具有遞呈抗原和誘導T細胞應答的功能。2007年，外泌體內含物RNAs和miRNAs被發現，其作為新的細胞間通訊介質引起了研究者們極大的興趣[1]。伴隨著這些開創性研究的推進，研究者發現包括內皮細胞、平滑肌細胞、免疫細胞在內的多種細胞可分泌外泌體，且外泌體天然存在于各種體液，如血液、尿液、唾液、腦脊液、乳汁等，至此，人們逐漸認識到其在保障動物機體健康成長過程中發揮了重要作用，外泌體在癌癥、自身免疫疾病、生理調控等方面的研究如雨后春筍般涌現出來。

2 外泌體生物生成

細胞外囊泡指的是以進化保守的方式分泌出細胞的含有細胞膜的囊泡，根據其大小、生成方式及組分主要分為3類：1)外泌體，細胞膜逆出芽后在核內體產生，形成多囊泡聚合體后由細胞膜釋放，直徑30～150 nm。2)細胞微泡，又稱細胞膜微?；蛘吆送忸w粒體，以外向出芽的方式由細胞膜裂變產生，直徑100～350 nm。3)凋亡小體，在細胞凋亡過程中由細胞膜出泡產生，直徑500～1 000 nm[5]。

外泌體的生成起始于含有表面蛋白的細胞膜內向出芽(即內吞作用)形成的早期外泌體。早期外泌體在囊泡分揀蛋白如轉運必需核內體復合物(endosomal complex required for transport，ESCRT)的作用下識別、分類、挑選外泌體內含蛋白生成多囊泡體，或者在神經酰胺的協助下生成多囊泡體，該過程根據是否需要ESCRT的參與分為ESCRT依賴途徑及ESCRT非依賴途徑。目前，miRNAs進入外泌體的分選機制尚不明確。生成的多囊泡體一部分被溶酶體降解，一部分與細胞膜融合，釋放外泌體。圖1為外泌體的生物生成及釋放示意圖[6-7]。

3 外泌體主要組分及功能

3.1 蛋白質及相關功能

分析外泌體的生物組成時，人們驚奇地發現其內含蛋白的變化范圍非常有限，它不含核蛋白、線粒體蛋白、內質網蛋白及高爾基體蛋白。所有已發現的外泌體蛋白均來源于細胞溶質、內吞小泡或細胞膜。與其來源細胞相比，外泌體不僅僅是細胞膜碎片，因為其內蛋白不含一些在膜表面表達豐富的蛋白，如樹突狀細胞Fc受體[8]、T細胞CD28[9]、CD40L、CD45、B細胞轉鐵蛋白受體[10]。無論其分泌細胞是什么，多數外泌體的內含蛋白種類相似，只有小部分蛋白是細胞特異性的，這部分特異蛋白可反映出其分泌細胞的生理病理狀態[11]。典型的外泌體蛋白包括血小板來源生長因子受體、乳凝集素、跨膜蛋白、溶酶體相關膜蛋白-2B、膜轉運及融合蛋白如泛素、鳥苷三磷酸酶(GTPases)、熱休克蛋白(HSPs)、脂相關蛋白、磷脂酶等[12]。外泌體中一些富含的蛋白通常作為其標志物，包括四分子交聯體家族成員9(CD9、CD63、CD81和CD82)，14-3-3蛋白，肌球蛋白重鏈(MHC)分子細胞質蛋白如HSPs、腫瘤易感基因101(Tsg101)蛋白及ESCRT-3結合蛋白Alix。CD9、CD63和CD81最初被認為是外泌體特有標記物，但現已發現其也存在于凋亡小體和細胞微泡[13]。

Endocytosis：內吞作用；Early endosome：早期外泌體；ESCRT: 轉運必需核內體復合物 endosomal complex required for transport；Multivesicular body：多囊泡體；Membrane fusion：膜融合；Original cell：來源細胞；Recipient cell：受體細胞；Surface protein：膜表面蛋白；Exosome：外泌體。

圖1外泌體的生物生成及釋放

Fig.1 Biogenesis and release of exosome

由于外泌體攜帶大量可變的特殊蛋白，其所攜帶的蛋白可決定其在不同通路中的功能，因此外泌體被視為矢量信號小泡。外泌體膜外暴露的受體或配體負責使其定位到特定的細胞或細胞外區域。隨后，外泌體可通過與靶細胞膜表面受體或配體結合或內化激活胞內信號通路或改變其細胞表型[14]。特殊的外泌體蛋白如MHC-Ⅰ分子、MHC-Ⅱ分子、轉鐵蛋白受體在一些信號通路下游非?；钴S，如整合蛋白及Ca+信號通路[15]、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路及自然殺傷細胞群2D(NKG2D)信號通路[16]。諸如HSP60、HSP70這樣的HSPs及主要存在于免疫細胞膜的表面受體CD14、CD91、Toll樣受體(TLR)-2、TLR-4和氧化低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)，CD94/CD56就是經典的配體-受體相結合的模型[17]。

除了通過膜表面蛋白介導細胞間通訊作用外，外泌體還攜帶一些重要的可溶性蛋白介質，如細胞因子。外泌體相關細胞因子轉運最為熟知的例子是白細胞介素(IL)-1β，IL-1β不僅可在分泌性溶酶體與細胞膜融合后釋放，也可由外泌體產生[18]。與IL-1β相似，IL-18也屬于無N-末端信號肽，在受到炎癥復合物的激活后被外泌體攜帶由巨噬細胞表面分泌出來[19]。趨化因子是一類非常重要的獨特的細胞因子，研究發現趨化因子CXCL8和CX3CL1可由凋亡的淋巴細胞外泌體分泌[20]。

3.2 RNA及相關功能

2007年，首次發現小鼠和人肥大細胞外泌體均含有mRNAs和miRNAs，并且可轉移到受體細胞，在受體細胞發揮生理功能。外泌體的來源和不同的檢測方法都會引起最終得到的RNA的種類和含量的差異。測序分析表明，在人類血漿外泌體RNA中，miRNAs的含量是最豐富的，約593種，5種最常見的miRNAs(miR-99a-5p、miR-128、miR-124-3p、miR-22-3p和miR-99b-5p)占了總量的48.99%，核糖體RNA占9.16%，長鏈非編碼RNA占3.36%，piwi蛋白互作RNA占1.31%，轉運RNA占1.24%，核小RNA占0.18%，核仁小RNA占0.01%[21]。HeLa細胞培養基來源外泌體含有多種RNA：miRNAs、mRNAs、rRNA、tRNA、piRNA、RefSeq和ncRNA[22]。

外泌體為其內含脂質、蛋白質、RNA(尤其是mRNAs和miRNAs)提供了保護，使其免受酶類降解，并通過內吞作用為其內含成分提供了進入細胞的途徑。人間充質干細胞來源的外泌體約含有239種mRNAs，多數與細胞增殖分化和免疫調節密切相關，其中的2個mRNA可在鼠體內外腎上皮細胞翻譯為完整的蛋白質，表明外泌體可轉移有活性的mRNAs[23]。肥大細胞在氧化應激狀態和正常狀態下外泌體所攜帶的mRNAs含量差異顯著，表明外泌體所攝取的mRNAs受到細胞的生理狀態和應激的調節，可能在維持組織內穩態方面發揮重要作用[24]。同樣，心肌細胞外泌體所攜帶的mRNAs受到了生長因子的調控[25]，神經膠質細胞在低氧環境下外泌體攜帶的mRNAs和蛋白均受到影響[26]，表明外泌體轉運mRNAs的功能與動物細胞的生理狀態密切相關。

外泌體中的miRNAs可通過血液循環運輸而不被血液中的RNA酶降解，是外泌體介導細胞間通訊的基礎。miRNAs長度為18～25 nt，最初轉錄產物為帶發卡結構的pri-miRNAs，Drosha釋放出pri-miRNAs的發卡結構形成pre-miRNAs，Dicer負責清除pre-miRNAs上3′和5′臂上的環狀結構形成miRNAs雙鏈，miRNAs雙鏈與Ago蛋白結合，丟棄隨從鏈，向導鏈與miRNAs誘導沉默復合體(miRISC)互補，最終形成成熟的miRNAs以調控目標mRNA的表達[27]。選擇性降解外泌體中部分miRNAs是一種潛在的快速調節基因表達的方式，也是一種抑制癌細胞擴散可能的手段。

外泌體介導的miRNAs轉運與細胞的免疫功能相關。在免疫細胞突觸形成過程中，T細胞來源的外泌體攜帶的miRNAs，如miR-335單向轉移進入抗原遞呈細胞調節其基因表達[28]。乳源外泌體能夠抑制Anti-CD3和Anti-PHA誘導的細胞因子的產生，增加調節性T細胞特異性群組的數量[29]。免疫相關miRNAs(miR181a和miR-17)在人分娩后最初的6個月乳外泌體中高表達，表明外泌體可介導miRNAs在母體和嬰兒之間的傳遞，對嬰兒免疫系統的發育可能有重要影響[30]。

3.3 脂質及相關功能

外泌體脂質對于囊泡發揮其生理功能有重要作用。盡管不同來源的外泌體脂質組成成分不同，但與其來源細胞相比，都含有豐富的鞘磷脂、膽固醇和鞘糖脂。大量的鞘磷脂和膽固醇能夠鞏固外泌體結構，提高其對不良理化環境的抗性[31]。另外，外泌體膜雙分子層結構也有利于其在不同的細胞外環境中保持穩定性。外泌體穩定性的研究對外泌體載體藥物的開發有重要意義。

4 外泌體分離鑒定

目前已鑒定出各類細胞外囊泡的一些特點，但仍缺乏一種被廣泛接受的分類標準。典型的分離方法并不能準確區分開或者純化各種囊泡，只能得到多囊泡復合體，因此，多種技術聯合使用，如差速離心、密度梯度離心、過濾、排阻色譜等能夠得到相對單一的囊泡[32]。目前主要存在以下幾種外泌體分離純化技術：超速離心法、基于大小分離法、免疫親和性捕捉法、外泌體沉淀法[33]。

超速離心法是分離外泌體的標準方法，該方法操作簡單，技術難度低，耗時不長，樣品無需預處理，但由于外泌體的不均一性及大小與其他細胞外囊泡重合，該方法分離得到的外泌體會含有其他的細胞外囊泡[34]。Théry等[35]詳細介紹了提取細胞培養基上清液及各種生物體液如尿液、血漿、血清、腹水等外泌體的步驟，是目前分離外泌體最經典的方法。超濾法是基于大小分離外泌體較為常用和成熟的技術，其原理是利用限制特定分子重量和大小的超濾膜將其分離。超濾比超速離線節約時間，也不需要特殊的儀器設備，但超濾時施加的壓力比較大，導致體積大的囊泡變形和破裂，可能影響后續的分析結果[36]。外泌體膜表面存在大量的蛋白和受體，可通過這些蛋白與抗體的特異性結合開發免疫親和性分離技術[34]，諸如CD63這樣存在于外泌體表面的特異性蛋白分子為復雜樣品分離外泌體提供了策略。

外泌體的鑒定需要通過電子顯微鏡來進行形態學觀察。對于組織細胞來說，標準的電子顯微鏡制片過程包括固定、脫水、包埋、切片，而這一過程不適用于外泌體，因為在脫水及包埋過程中會損壞外泌體膜，因此，外泌體的制片需要特殊的方法[28]。當在電子顯微鏡下觀察時，外泌體呈典型的杯狀形態，直徑為30～150 nm，扁平球狀[37]。外泌體進一步鑒定需要蛋白質組學分析、Western Blot、熒光激活細胞分選技術(FACS)等手段的輔助。

5 小 結

外泌體于1983年首次被發現，其后十多年里一直被當做細胞廢棄物從而忽略了這方面的研究。近年來，人們逐漸認識到了外泌體不僅可介導細胞間通訊，而且對機體生理病理過程有重要影響。鑒于外泌體在維持動物內穩態平衡中的重要作用，其在動物疾病發生發展過程中的作用不言而喻，目前尚需這方面的研究。