飼料精氨酸水平對黃顙魚幼魚生長性能、消化吸收相關指標、免疫功能和抗氧化能力的影響

趙紅霞 陳啟明 黃燕華 曹俊明* 王國霞 陳 冰 陳曉瑛

(1.廣東省農業科學院動物科學研究所，廣州510640；2.農業部華南動物營養與飼料重點實驗室，廣州510640；3.廣東省畜禽育種與營養研究重點實驗室，廣州510640)

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)屬鯰形目，鲿科，黃顙魚屬。其肉質細嫩、味道鮮美、無肌間刺[9]，有獨特風味，是營養豐富的動物性食品[10]。因為優良的肉質，黃顙魚不僅在國內有很好的銷量，日本、韓國和東南亞也是潛在的市場[11]。為滿足市場需求，我國近年的黃顙魚規?；B殖不斷增加，對黃顙魚營養需求的研究也成為熱點。Zhou等[12]研究了黃顙魚對精氨酸的適宜需要量。沈勇等[13]通過檢測黃顙魚消化酶活性和養分消化率探討飼料精氨酸與賴氨酸配比對黃顙魚消化吸收的影響。本實驗室前期研究表明，飼料中適宜水平的精氨酸可顯著提高黃顙魚幼魚的生長性能和抗氨氮應激能力[14]。但是，關于飼料中精氨酸水平對黃顙魚幼魚消化吸收相關酶活性、免疫功能和抗氧化能力影響方面的研究尚不多見。為豐富精氨酸在黃顙魚研究領域的應用成果，本試驗通過在飼料中添加不同水平的精氨酸，研究其對黃顙魚幼魚生長性能、消化吸收相關酶活性、免疫功能和抗氧化能力的影響，評估精氨酸在黃顙魚實用飼料中的適宜添加水平，為精氨酸在黃顙魚配合飼料中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

以魚粉、豆粕為主要蛋白質源，面粉為主要糖源，魚油、豆油為主要脂肪源，以丙氨酸作為等氮替代物，通過添加不同水平的精氨酸(L-精氨酸鹽酸鹽，純度≥99%，購自寧波大榭開發區海德氨基酸工業有限公司)，配制成精氨酸水平分別為2.44%、2.64%、2.81%、3.01%和3.23%的5種等氮等脂(蛋白質水平為42%，脂肪水平為9%)實用飼料，飼料蛋白質和脂肪水平等參照本實驗室前期研究[15]設定。飼料原料經粉碎后過60目篩，按配方準確稱取，各種飼料原料逐級混勻后，于NH-10型捏合機中(華南理工大學科技實業總廠)加入魚油、豆油，混合均勻后，加適量水在B20強力攪拌機(廣州市番禺力豐食品機械廠)中攪拌，用SLX-80型雙螺桿擠壓機(華南理工大學科技實業總廠)制成1.5 mm的條狀，在G-500型造粒機(華南理工大學科技實業總廠)中制成顆粒飼料，55 ℃烘干，自然冷卻后放入密封袋，置于-20 ℃冰箱中保存備用。試驗飼料組成及營養水平見表1，試驗飼料氨基酸組成見表2。

表1 試驗飼料組成及營養水平(風干基礎)

續表1項目 Items飼料精氨酸水平 Dietary arginine level/%2.442.642.813.013.23磷酸二氫鈣 Ca(H2PO4)21.50 1.50 1.50 1.50 1.50 維生素C酯 Vitamin C ester0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 氯化膽堿 Choline chloride0.30 0.30 0.30 0.30 0.30 L-精氨酸鹽酸鹽 L-Arg·HCl0.24 0.48 0.72 0.96 丙氨酸 Alanine2.00 1.60 1.20 0.80 0.40 合計 Total100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 營養水平 Nutrient levels3)粗蛋白質CP42.8 42.0 42.6 42.4 42.6 粗脂肪 EE8.9 9.0 9.3 8.7 8.7 粗灰分 Ash7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 水分 Moisture7.0 6.7 6.8 6.9 6.8

1)每千克維生素預混料含有 Contained the following per kg of vitamin premix：VA 3 200 000 IU，VB14 g，VB28 g，VB64.8 g，VB1216 mg，VD31 600 000 IU，VE 16 g，VK 4 g，泛酸鈣 calcium pantothenate 16 g，葉酸 folic acid 1.28 g，煙酸 nicotinic acid 28 g，肌醇 inositol 40 g，生物素 biotin 64 mg。

2)每千克礦物質預混料含有 Contained the following per kg of mineral premix：MgSO4·H2O 12 g，Ca(IO3)29 g，KCl 36 g，Met-Cu 1.5 g，ZnSO4·H2O 10 g，FeSO4·H2O 1 g，Met-Co 250 mg，NaSeO30.003 6 g。

3)營養水平為實測值。Nutrient levels were measured values.

表2 試驗飼料氨基酸組成(風干基礎)

1.2 試驗魚與飼養管理

試驗用黃顙魚幼魚購自廣東省清遠市黃沙漁業基地。養殖試驗在廣東省農業科學院動物科學研究所水產研究室室內循環水養殖系統中進行，養殖用水為曝氣的自來水，進水速率為1.5 L/min，試驗系統由直徑80 cm、高70 cm的圓柱形玻璃纖維桶組成，容水量約為300 L。試驗開始前將黃顙魚幼魚在室外水泥池中暫養2周，期間投喂商品飼料(蛋白質水平為40%，脂肪水平為9.5%)，每天2次(08:30和18:30)。暫養結束后，選取初始體均重為(1.13±0.02) g的黃顙魚幼魚700尾，隨機分為5組，每組4個重復，每個重復35尾魚，分別投喂5種精氨酸水平的試驗飼料。投喂量為體重的5%～6%，每天08:30和18:30各投喂1次，上午投喂40%，下午投喂60%，根據攝食情況調整投喂量。養殖系統采取循環水過濾系統，定時換水，定期測定水質，試驗期間水溫29.5～33.0 ℃，自然光源，氨氮濃度<0.20 mg/L，亞硝酸鹽濃度<0.01 mg/L，溶氧濃度>6.0 mg/L，pH 7.4～7.9。養殖試驗為期56 d。

1.3 樣品采集

養殖試驗結束后停食24 h，稱量終末體重并統計存活數。從每個重復隨機選取15尾魚，放入120 mg/L的MS-222溶液中麻醉，隨機取10尾靜脈取血，4 000 r/min離心10 min，取上清液分裝制備血清，-80 ℃冰箱保存備用；剩下的5尾于冰上迅速解剖和剝離胃、肝臟和腸道，-80 ℃冰箱保存，用于消化吸收相關酶活性的測定。

1.4 指標測定

1.4.1 生長性能指標計算

存活率(SR，%)=100×終末尾數/初始尾數；
增重率(WGR，%)=100×(終末體重-
初始體重)/初始體重；
FCR=飼料攝入量/(終末體重-初始體重)。

1.4.2 飼料營養成分檢測

飼料營養成分采用AOAC(1984)[17]中方法測定。其中，水分含量采用105 ℃烘干恒重法測定，粗蛋白質含量采用凱氏定氮法測定，粗脂肪含量采用索氏抽提法測定，粗灰分含量采用高溫550 ℃馬弗爐灰化法測定。飼料經鹽酸水解后采用高效液相色譜儀(HPLC)分析系統(LC1260，安捷倫科技公司)安捷倫ZORBAX c18(150 mm×5 μm)測試柱測定氨基酸組成。

1.4.3 血清免疫、抗氧化指標和胃、肝臟、腸道消化吸收相關指標測定

血清免疫、抗氧化指標和胃、肝臟、腸道消化吸收相關酶活性采用試劑盒檢測，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，具體測定方法參照試劑盒所附說明書。血清免疫指標：血清一氧化氮(NO)、補體4(C4)、免疫球蛋白(IgM)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量，血清抗氧化指標：超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)活性與總抗氧化能力(T-AOC)及丙二醛(MDA)含量。消化吸收相關指標：胃、肝臟和腸道蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，腸道堿性磷酸酶(AKP)、γ-谷氨酰轉移酶(γ-GT)、Na+/K+-ATP酶(Na+K+-ATPase)活性及內皮素1(ET-1)含量。

1.5 數據統計與分析

試驗數據用平均值±標準差(mean±SD，n=4)表示，采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。先對試驗數據開展方差齊性檢驗，滿足方差齊性條件則進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著再用Tukey’s檢驗方法進行多重比較；方差齊性條件不滿足的，則用Dunnett’s T3檢驗法進行多重比較。差異顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 黃顙魚幼魚的生長性能

各組黃顙魚幼魚養殖56 d后的存活率均為100%，未出現死亡情況。由表3可知，隨著飼料中精氨酸水平的升高，黃顙魚幼魚的WGR呈先升后降、FCR呈先降后升趨勢，在2.64%組分別達到最大值和最小值。與3.23%組相比，2.64%組和2.81%組黃顙魚幼魚的WGR顯著升高(P<0.05)，2.64%組、2.81%組和3.01%組黃顙魚幼魚的FCR顯著降低(P<0.05)。以黃顙魚幼魚的WGR和FCR為評價指標，經二次回歸模型分析得出黃顙魚幼魚對飼料中精氨酸的需求量分別為2.74%(占飼料蛋白質的6.45%)(圖1)和2.75%(占飼料蛋白質的6.47%)(圖2)。

2.2 黃顙魚幼魚的消化酶活性

由表4可知，黃顙魚幼魚的胃蛋白酶和淀粉酶活性在3.01%組達到最高，顯著高于2.44%組(P<0.05)。2.81%組和3.01%組黃顙魚幼魚的胃脂肪酶活性顯著高于其他各組(P<0.05)。2.64%組、2.81%組、3.23%組黃顙魚幼魚的肝臟淀粉酶活性顯著高于2.44%組(P<0.05)。飼料中精氨酸水平對黃顙魚幼魚的肝臟蛋白酶、脂肪酶活性和腸道蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性沒有產生顯著影響(P>0.05)。

表3 投喂含不同精氨酸水平飼料56 d后黃顙魚幼魚的生長性能

同行數據肩標無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

圖1 飼料精氨酸水平與黃顙魚幼魚增重率的關系

圖2 飼料精氨酸水平與黃顙魚幼魚飼料系數的關系

項目 Items飼料精氨酸水平 Dietary arginine level/%2.442.642.813.013.23蛋白酶Protease/(U/mg prot) 胃 Stomach927.08±152.35a1 073.47±174.45a1 007.37±136.14a1 367.82±378.59b1 159.42±447.43ab肝臟 Liver222.74±13.17237.82±13.10237.86±64.11224.31±25.36243.47±41.28腸道 Intestine577.45±75.06580.30±89.25642.71±154.76637.26±94.33637.84±125.64脂肪酶 Lipase/(U/g prot) 胃 Stomach116.32±25.18a139.48±29.02a200.63±37.12b201.25±43.34b119.41±24.33a肝臟 Liver51.33±13.6160.69±19.1859.36±20.8757.06±15.3852.76±14.66腸道 Intestine62.05±3.9361.76±2.7873.52±9.5755.39±7.8668.84±7.96淀粉酶Amylase/(U/mg prot) 胃 Stomach33.65±6.23a42.67±9.37ab49.11±12.66ab66.87±18.78b44.22±11.56ab肝臟 Liver8.38±1.36a14.50±4.12b15.82±3.15b10.27±0.77ab13.50±2.68b腸道 Intestine27.96±1.5328.54±2.3030.94±3.0431.21±3.3531.13±5.22

2.3 黃顙魚幼魚的腸道吸收相關指標

由表5可知，2.64%組、2.81%組、3.01%組和3.23%組黃顙魚幼魚腸道AKP活性顯著高于2.44%組(P<0.05)。2.64%組和2.81%組黃顙魚幼魚腸道γ-GT活性顯著高于2.44%組、3.01%組和3.23%組(P<0.05)。飼料中精氨酸水平對黃顙魚幼魚腸道Na+/K+-ATPase活性和ET-1含量沒有產生顯著影響(P>0.05)。

表5 投喂含不同精氨酸水平飼料56 d后黃顙魚幼魚的腸道堿性磷酸酶、

2.4 黃顙魚幼魚的血清免疫指標

由表6可知，2.81%組和3.01%組黃顙魚幼魚血清NO含量顯著高于2.44%組(P<0.05)，2.64%組、2.81%組、3.01%組和3.23%組黃顙魚幼魚血清IL-1β含量顯著低于2.44%組(P<0.05)，2.44%組和2.64%組黃顙魚幼魚血清IL-6含量顯著高于2.81%組(P<0.05)。飼料中精氨酸水平對黃顙魚幼魚血清C4、IgM、TNF-α含量未產生顯著影響(P>0.05)。以黃顙魚幼魚血清NO含量為評價指標，經二次回歸模型分析得出黃顙魚幼魚對飼料中精氨酸的需求量為2.94%(占飼料蛋白質的6.92%)(圖3)。

表6 投喂含不同精氨酸水平飼料56 d后黃顙魚幼魚的血清免疫指標

2.5 黃顙魚幼魚的血清抗氧化指標

由表7可知，2.64%組黃顙魚幼魚血清GSH-Px活性顯著高于2.44%組(P<0.05)，2.64%組黃顙魚幼魚血清CAT活性顯著高于2.44%組、3.01%組和3.23%組(P<0.05)，3.01%組黃顙魚幼魚血清MDA含量顯著低于2.64%組(P<0.05)。飼料中精氨酸水平對黃顙魚幼魚血清SOD、POD活性和T-AOC未產生顯著影響(P>0.05)。

3 討 論

3.1 飼料精氨酸水平對黃顙魚幼魚生長性能的影響

精氨酸可以參與體內蛋白質及多胺的合成，促進生長[1-2]。已有研究表明，精氨酸可以提高魚類的生長性能[3-6]。本試驗結果表明，隨著飼料精氨酸水平的升高，黃顙魚幼魚的WGR升高、FCR降低，在2.64%組分別達到最大值和最小值，說明適宜水平的精氨酸可以提高黃顙魚幼魚的生長性能。利用二次回歸模型擬合WGR和飼料精氨酸水平，得出黃顙魚幼魚對飼料中精氨酸的需求量為2.74%(占飼料蛋白質的6.45%)。該結果在魚類精氨酸需求量范圍(占飼料蛋白質的3.8%～8.1%)[12,18-21]之內。隨著飼料精氨酸水平的進一步升高，黃顙魚幼魚的生長性能呈現下降趨勢，該現象與在金鯧(Trachinotusovatus)[1]、尼羅羅非魚(OreochromisniloticusL.)[3]和軍曹魚(Rachycentroncanadum)[18]等上的研究結果類似。在對哺乳動物中的研究發現，飼料中過量的精氨酸導致動物生長性能下降可能是由于精氨酸-賴氨酸的拮抗作用造成的，但是這一作用在魚類中是否存在還存在爭議[2]。Berge等[19]和廖英杰等[20]的研究認為，大西洋鮭(Salmosalar)和團頭魴存在精氨酸-賴氨酸拮抗現象，而Alam等[21]和Zhou等[12]研究結果則認為牙鲆(Paralichthysolivaceus)和黃顙魚不存在精氨酸-賴氨酸拮抗現象。

沈勇等[13]發現黃顙魚飼料中精氨酸與賴氨酸比值約為1.20時，能夠顯著促進生長性能，但飼料中賴氨酸添加量過量則抑制黃顙魚的生長。在黃顙魚中是否存在精氨酸-賴氨酸拮抗現象還有待于進一步研究。

圖3 飼料精氨酸水平與黃顙魚幼魚

項目 Items飼料精氨酸水平 Dietary arginine level/%2.442.642.813.013.23谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px/(U/mL) 163.65±15.60a303.18±80.83b198.53±65.19ab192.83±36.50ab258.68±99.26ab過氧化氫酶 CAT/(U/mL)3.30±0.58a5.38±0.63b3.89±1.01ab2.95±0.12a3.68±1.04a超氧化物歧化酶 SOD/(U/mL)66.72±0.8668.38±9.1867.68±2.9666.44±4.6469.87±4.57過氧化物酶 POD/(U/mL)45.96±9.5256.46±17.2343.04±0.6637.86±5.3547.88±0.43總抗氧化能力 T-AOC/(U/mL)2.07±0.901.51±0.761.89±1.052.79±0.831.71±1.03丙二醛 MDA/(nmol/L)8.60±0.35ab9.57±0.18b9.39±0.81ab8.18±0.57a8.58±1.24ab

3.2 飼料精氨酸水平對黃顙魚幼魚消化酶活性的影響

消化酶是生物體內催化各種生化反應的一類特殊的蛋白質，主要作用是消化和分解生物體從外界所攝取的食物，為生長和發育提供所需的各種營養物質[22]。王際英等[23]研究發現，飼料精氨酸水平可以顯著影響仿刺參腸道蛋白酶的活性，對脂肪酶和淀粉酶活性無顯著影響。Chen等[24]的研究表明，精氨酸可以顯著提高建鯉蛋白酶和脂肪酶的活性，對淀粉酶活性無顯著影響。王連生等[25]試驗證明，飼料中添加精氨酸顯著提高雜交鱘前腸蛋白酶和淀粉酶活性。本試驗結果表明，飼料中適宜水平的精氨酸顯著提高了黃顙魚幼魚胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性及肝臟淀粉酶活性。精氨酸對不同魚類消化酶活性的影響不盡相同，影響魚類消化酶活性的因素有很多，如食性、生長階段、理化因子(如水溫、pH、鹽度等)、營養與飼料(飼料原料、飼料添加劑等)等[26]。沈勇等[13]研究發現，飼料中精氨酸/賴氨酸為2.19/2.61組黃顙魚的肝臟、腸道胰蛋白酶活性顯著高于精氨酸/賴氨酸為3.07/2.61、2.19/3.65和3.08/3.65組，胃蛋白酶活性在飼料精氨酸/賴氨酸為1.74/2.08、1.74/30.2和2.63/2.08組顯著高于其他各組。本試驗結果與之不同，黃顙魚幼魚胃蛋白酶和淀粉酶活性在精氨酸水平為3.01%時達到最高，胃脂肪酶活性在精氨酸水平為3.01%達到最高，肝臟淀粉酶活性在精氨酸水平為2.64%、2.81%和3.23%時較2.44%時顯著升高。精氨酸來源、精氨酸/賴氨酸、飼料組成等軍可能影響精氨酸的利用，從而導致黃顙魚幼魚消化酶活性出現較大差異。

3.3 飼料精氨酸水平對黃顙魚幼魚腸道吸收相關指標的影響

腸道不僅在消化吸收營養物質過程中發揮著重要作用，而且是集內分泌、免疫、屏障等功能為一體的重要器官，魚類腸道健康對于魚體的整體健康起到非常重要的作用[27-28]。AKP、γ-GT、Na+K+-ATPase活性和ET-1含量是反映腸道對營養物質代謝、轉運和消化吸收功能的指標，目前尚未見關于精氨酸對黃顙魚腸道AKP、γ-GT、Na+K+-ATPase活性和ET-1含量影響的相關報道。本試驗中，飼料精氨酸水平對黃顙魚幼魚腸道Na+K+-ATPase活性和ET-1含量沒有產生顯著影響。分布于動物腸道上皮刷狀緣細胞表面的腸型堿性磷酸酶(IAKP)與維生素D、鈣、氨基酸、膽固醇、脂類和葡萄糖等多種營養物質吸收有關[29-30]。本試驗結果顯示，飼料中添加精氨酸顯著提高黃顙魚幼魚腸道AKP活性，表明精氨酸可以增強黃顙魚腸道的吸收能力，促進營養物質的代謝。γ-GT是谷氨酸循環的關鍵酶，能促進氨基酸向細胞內轉運，為蛋白質生物合成提供原料[31]。本試驗發現，2.64%組和2.81%組黃顙魚幼魚腸道γ-GT活性顯著高于2.44%組、3.01%組和3.23%組，表明飼料中適宜水平的精氨酸能夠提高黃顙魚幼魚腸道γ-GT活性，促進體內氨基酸的轉運。

3.4 飼料精氨酸水平對黃顙魚幼魚免疫功能的影響

魚類和哺乳動物一樣，具有非特異性和特異性免疫功能，能通過黏膜屏障、組織和體液中各種免疫細胞和因子共同抵御病原入侵[32]。補體系統可以被抗原-抗體復合物激活或直接被抗原激活，結合到抗原表面，也可以被外源細菌凝集素和炎癥初期產生的蛋白共同激活，輔助非特異性和特異性免疫[33]。C4是補體系統中的主要成分，是體內具有酶原活性的球蛋白[34]。本試驗條件下，飼料精氨酸水平對血清C4含量無顯著影響，與廖英杰等[20]在團頭魴幼魚上的研究結果一致。大量研究表明，魚類能進行體液和細胞免疫應答，而免疫球蛋白是魚類特異性體液免疫應答的主要介質[35]。本試驗研究顯示，精氨酸對黃顙魚幼魚血清IgM含量無顯著影響。NO既是腫瘤免疫、微生物免疫的效應分子，又是多種免疫細胞的調節因子。在本試驗中，隨著飼料中精氨酸水平的升高，黃顙魚幼魚血清NO含量呈現先上升后下降的趨勢，表明飼料中添加適量的精氨酸可以增強黃顙魚幼魚發免疫功能。炎癥是常見的病理過程，可以生于機體各部位的組織和各器官，參與炎癥反應的各種細胞因子主要有IL-1β、IL-6和TNF-α等。Zheng等[36]研究發現，精氨酸可以降低斷奶仔豬肝臟IL-6和TNF-α的mRNA表達量。Tan等[37]的研究顯示，精氨酸可以降低肉雞腸道IL-1β的mRNA表達量。本試驗結果亦顯示，飼料精氨酸水平的升高可以降低黃顙魚幼魚血清促炎因子IL-1β、IL-6的含量，表明精氨酸可以在一定程度上緩解黃顙魚機體的炎癥反應，與Holen等[38]在大西洋鮭上得出的結論一致。

3.5 飼料精氨酸水平對黃顙魚幼魚抗氧化能力的影響

4 結 論

飼料中適宜水平的精氨酸可提高黃顙魚幼魚的WGR，降低FCR，增強消化吸收能力、免疫功能和抗氧化能力。以黃顙魚幼魚的WGR和血清NO含量為評價指標，經二次回歸模型分析得出黃顙魚幼魚對飼料中精氨酸的需求量分別為2.74%(占飼料蛋白質的6.45%)和2.94%(占飼料蛋白質的6.92%)。