喉鱗癌中DNA結合/分化抑制蛋白-2和血管內皮生長因子-C表達及臨床意義

孫 青，呂丹雨，秦雪梅， 陳國輝， 白廣平

復旦大學附屬中山醫院青浦分院耳鼻咽喉科(上海 201700)

喉鱗癌臨床中較為常見，主要見于中老年人，主要通過淋巴道播散[1]。近年人們關注腫瘤中的淋巴管生成對轉移的促進作用，并發現了以血管內皮生長因子-C(VEGF-C)為代表的淋巴管生成因子。研究認為VEGF-C可以與受體VEGFR3結合，促進淋巴管內皮細胞的增殖，為淋巴道轉移提供直接的通道[2-3]。DNA結合/分化抑制蛋白-2(ID-2)是近年學者在動物實驗時發現的因子，具有分化抑制的特征，主要通過抑制環-螺旋-環轉錄因子的作用對腫瘤細胞的增殖和轉移進行調控[4]，其對脈管內皮細胞的增殖可能有明確的作用。本實驗通過免疫組化的方法檢測喉鱗癌中ID-2和VEGF-C的表達，探討其臨床價值。

資料和方法

1 一般資料 收集2013年1月至2015年12月在我院住院治療并經病理醫師明確診斷、行手術根治的喉鱗癌患者作為觀察組，共67例。納入標準：①臨床隨訪資料完整。②符合WHO中的標準。③患者或家屬均簽屬知情同意書。均留取患者完整的臨床資料及術后蠟塊組織。排除標準：①伴有其它器官惡性腫瘤。②有口腔及呼吸道手術史。③伴有遺傳及免疫性疾病的患者。④術前放、化療的患者。其中男34例，女33例，年齡43～88歲，平均58.8歲。選擇聲帶息肉的組織45例作為對照組，其中男21例，女24例，年齡40～78歲，平均56.7歲。兩組常規資料的比較差別無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

2 ID-2和VEGF-C表達的檢測 ID-2和VEGF-C均購自北京中杉金橋生物公司，均為濃縮液。先行預實驗，選擇染色最好的濃度用于正式實驗(ID-2為1∶200，VEGF-C為1∶250)。正常實驗均由同一技師完成，一次性操作完成，嚴格按說明書的步驟進行，DAB顯色，減少人為誤差。

3 ID-2和VEGF-C結果的判定 ID-2和VEGF-C的定位是細胞質，二維方式評分，即:著色強度：無為0分；弱為1分，中等為2分，強為3分；陽性率:選擇2個高倍視野，取平均值，以<5%為0分，6～10%為1分，以11～30%為2分，以31～50%為3分，以>50%為4分。依著色強度和陽性率的評分之作為最終評定依據，≤3分為陰性，以>3分為陽性。

4 統計學方法 應用SAS 6.12統計學軟件分析，采用χ2檢驗、線性相關性分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 兩組中ID-2和VEGF-C表達的比較 兩組中ID-2和VEGF-C表達的陽性率差異有統計學意義(P<0.05)。見表1，見圖2。

2 觀察組中ID-2和VEGF-C的陽性率在不同臨床特征分組中的比較 觀察組中ID-2和VEGF-C的表達與增殖指數、脈管累犯、淋巴結轉移相關，ID-2的表達與腫瘤的分化程度和腫瘤最大徑密切相關,見表2。

3 觀察組中ID-2和VEGF-C的相關性 應用線性相關分析，顯示觀察組中ID-2和VEGF-C的表達具有正相關性(r=0.58，P=0.040)。

表1 兩組中ID-2和VEGF-C陽性率的比較[例(%)]

圖1 ID-2在喉鱗癌中陽性表達 圖2 VEGF-C在喉鱗癌中陽性表達

臨床特征n ID-2+- χ2值P值 VEGF-C+- χ2值P值脈管累犯無51 20(39.2)31(560.8) 10.4390.001 25(49.0)26(51.0) 7.4130.006有16 13(86.7)2(13.3) 14(87.5)2(12.5)增殖指數≤5035 12(34.3)23(65.7) 6.5690.010 13(37.1)22(62.9) 13.6390.000>5032 21(65.6)11(34.4) 26(81.3)6(18.8)淋巴結轉移無43 17(39.5)26(60.5) 4.5360.033 21(48.8)22(51.2) 4.3340.037有24 16(66.7)8(33.3) 18(75.0)6(25.0)腫瘤最大徑≤2cm21 4(19.0)17(81.0) 11.1660.001 13(61.9)8(38.1) 0.1720.679>2cm46 29(63.0)17(37.0) 26(56.5)20(43.5)分化程度 5.6070.018 0.5500.458高+中42 16(38.1)26(61.9) 23(54.8)19(45.2)低25 17(68.0)8(32.0) 16(64.0)9 (36.0)

討 論

喉鱗狀細胞癌是發生于喉粘膜鱗狀上皮的惡性腫瘤，腫瘤形成常表現為失控性增生和分化障礙，對周圍組織和器官進行侵犯，形成浸潤性病變[5]。腫瘤多為高和中分化的，具有角化現象，部分病例顯示出明顯的異型增生，表現為彌漫性生長，出現低分化的特征，此種腫瘤的預后差[6]。腫瘤間質可以觀察到血管和淋巴管的新生，也能觀察到比正常喉粘膜的間質更多的淋巴管，尤其是D2-40和VEGFR3陽性的淋巴管，這些淋巴管增生后與機體原有的淋巴循環相連，為腫瘤細胞進入淋巴道創造管腔條件。淋巴管內皮細胞出現明顯增殖，也可以表現出較高的增殖指數，其中促進增殖最重要的因子是VEGF-C和VEGF-D，二者也被學者定義為淋巴管生長因子。VEGF-C是最早在血管內皮生長因子家族中發現的淋巴管生長因子，作用最強，效果最明顯，其作用方式是通過VEGFR3實現的，VEGF-C/VEGFR3可能是作用的直接通路，能使淋巴管內皮細胞增殖，表現為DNA復制明顯。當細胞增殖到一定程度，在淋巴液的物理性沖擊作用下，可以形成具有功能的管腔，并與原有淋巴循環相通。腫瘤細胞通過此途徑形成轉移性播散。IDs蛋白是一類相對分子量為13-20kDa的小分子蛋白，其編碼的蛋白含有119-199個氨基酸殘基，此結構域含有親脂的α螺旋序列，在α螺旋中高度保守螺旋區通過其疏水基團的作用，形成二聚體，發揮轉錄調控作用，其對轉錄的調控作用可能是通過核因子起作用。ID-2是家族中的重要成員，具有所謂的“永生化”的結構和功能特征，其特點是能阻止細胞分化，使細胞發育停滯，呈明顯的增生狀態。近年也有研究顯示ID-2通過細胞表面的配體-受體發揮作用，其特點是通過泛素蛋白的作用來降解相關基質通路來完成的。也有研究認為ID-2過度表達可以延遲細胞老化，對調控細胞定向分化和胚胎發育有一定作用。還有研究認為ID-2可以促進初始器官的形成，并對成熟器官細胞的凋亡有一定作用[7]。有學者認為ID-2高表達時可以促進血管的生成，使CD34陽性的血管新生作用增強，同時對淋巴管的生成也有明顯的調節作用，因此ID-2的作用譜可能更廣泛。

本研究結果顯示觀察組中ID-2和VEGF-C的表達明顯高于對照組，提示二者具有癌基因樣的作用，二者是促進腫瘤形成的重要因素，二者的作用與對細胞的增殖生長的調控有關。結果顯示觀察組中ID-2和VEGF-C的表達與病變的增殖指數、脈管累犯和淋巴結轉移密切相關，提示ID-2和VEGF-C表達上調后能引起細胞增生，主要表現為腫瘤性的失控性增生，也表現為對脈管的侵犯和破壞，繼而形成淋巴道播散。ID-2是多種細胞的增殖因子，當其受到腫瘤性因子刺激時表達上調，其調控途徑主要有兩種，一是bHLH依賴途徑(依靠CDKs抑制劑的調節發揮作用)，另一個是bHLH非依賴途徑(通過pRB、Ets結構域轉錄因子發揮作用)。結果顯示ID-2高表達與腫瘤的分化程度密切相關，提示ID-2可以調節腫瘤的分化過程，并對起源細胞進行結構性的改建，同時對鄰近組織的直接蔓延起促進作用。ID-2升高時可以調節鱗狀細胞癌、腺癌和小細胞癌的分化，而分化是細胞由幼稚到成熟時的發育過程，因此其也是細胞在生長過程中不同發育時期細胞表現的形態反映，ID-2表達上調，能使細胞停滯于幼稚階段，腫瘤細胞的異型性更明顯，與起源組織的差異小，細胞核染色深，細胞的形態多種多樣，此類細胞具有高度增殖及高度侵襲的特征。本結果也顯示出ID-2的表達與腫瘤最大徑密切相關，提示ID-2對腫瘤生長過程具有明確的調控作用。相關分析顯示觀察組中ID-2和VEGF-C的表達具有正相關性，提示二者具有正向協同作用，ID-2對淋巴管生成因子具有促進作用[8]。因此ID-2的調控途徑可能更多，其也常作為上游基因，對下游相關信號進行調節，如VEGF-C、EGFR和PI3K/AKT等信號通路，引起淋巴管內皮細胞細胞增生繁殖，腫瘤細胞在淋巴管內遷移形成淋巴結轉移[9-10]。但是否ID-2/VEGF-C/VEGFR-3是一個經典通路尚有待證實。

總之，ID-2和VEGF-C在喉鱗癌組織中表達明顯升高，且具有協同作用，對腫瘤的形成和發展有一定的調節作用。