Klotho蛋白對缺血-再灌注腎損傷大鼠氧化應激的影響

木尼熱·提力瓦力迪 周 萍 王 順 李素華

急性腎損傷(AKI)是臨床常見的急危重癥，發病率高，死亡率高，腎缺血再灌注損傷(IRI)是AKI的主要原因之一。Klotho是高表達于正常腎小管上皮細胞的一種跨膜蛋白，具有抗氧化應激、抗炎癥反應和抗衰老作用[1-2]，近些年來一直備受研究者關注。雖然Klotho 有抗氧化應激作用，但是Klotho 能否通過調節NO的合成作用來調節氧化應激作用目前還不清楚。本研究旨通過建立大鼠急性腎缺血再灌注損傷模型，檢測 Klotho 干預前后血清NO水平，來探討 Klotho 對 缺血-再灌注損傷大鼠氧化應激反應的影響及其與NO合成之間的關系。

材料與方法

實驗動物3～4月齡健康近交系Wistar 雄性大鼠120只，體質量180～260g(SPF級)由實驗動物中心提供，動物分籠飼養，恒溫環境下標準化實驗日糧飼養，飲水不限。

主要試劑與材料大鼠Klotho ELISA Kit購自武漢華美，人源Klotho蛋白購自賽默飛世爾科技公司，髓過氧化物酶測定試劑盒、總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(WST-1 法)、一氧化氮(NO)測定試劑盒(微板法)購自南京建成，蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒購自碧云天，蛋白預染Marker購自Thermo Scientific，β-巰基乙醇、Tris、SDS、丙烯酰胺、N,N’-亞甲雙丙烯酰胺購自Amresco，Anti-Klotho購自Abcam，無水乙醇、二甲苯、中性樹脂購自福宇精細化工。

模型建立和實驗分組本研究具體分組情況如下：根據隨機數字表法將120只大鼠隨機分為正常組+生理鹽水(NOR+NS,n=24)，假手術+生理鹽水組(Sham+NS,n=24)，假手術+Klotho組(Sham+Klotho，n=24)，缺血-再灌注手術+生理鹽水組(I/R+NS,n=24)，缺血-再灌注手術+Klotho組(I/R+Klotho,n=24)。NOR+NS組:不開腹，僅腹腔內注射麻醉劑(戊巴比妥鈉)麻醉大鼠和注射NS。Sham+NS與Sham+Klotho組：常規消毒手術器械、準備無菌手術臺,2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉成功后，備皮并消毒手術野。麻醉狀態下從恥骨聯合上方1 cm至劍突下方正中切開腹部，將腸管翻至腹腔外，用濕紗布包裹保護，暴露雙側腎臟，切除右側腎臟,不夾閉左側腎蒂，將Klotho蛋白(0.01 mg/kg)或NS(同等容量)腹腔注射。I/R+Klotho與Sham+Klotho組：常規消毒手術器械、準備無菌手術臺,2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉成功后，備皮并消毒手術野，同法切除右側腎臟,左側腎動脈鈍性分離，用無創動脈夾靠近腎門處夾閉腎動脈，觀察腎臟由鮮紅色逐漸變為暗紅色，將腹腔外腸管還納至腹腔內，用血管鉗鉗夾腹壁，夾閉腹腔，以防止水分散失和體溫下降，45 min后去除血管鉗，打開腹腔，將腹腔內腸管翻至腹腔外，暴露腎臟，松開動脈夾，恢復腎臟血液灌流，肉眼可見腎動脈充盈，腎臟逐漸由暗紅色變為鮮紅色，表明再灌注成功。用1號細絲線連續縫合腹壁切口。術后大鼠放于24℃～29℃環境，緊密觀察大鼠的生命體征，同時補充水與飼料，造模成功后將Klotho蛋白(0.01 mg/kg)或NS(同等容量)腹腔注射。

模型成功判定密切觀察腎臟，松開動脈夾以后從紫黑色逐漸變為紅色說明經過缺血一再灌注病理生理過程，關腹繼續觀察2h，如實驗動物能正?；顒诱f明造模成功；如果松開動脈夾5 min后，腎臟未轉變紅色，則認為再灌注造模未成功，本實驗造模成功率為88%。

實驗指標檢測

標本收集 五組分別在造模成功后1h、5h、12h及24h 4個時間點，各組各時間點分別隨機選出6只大鼠處死，從腹正中線皮膚切開腹腔，使腹主動脈清楚暴露。用注射器吸出靜脈血液，編號后靜置2h，3 000 r/min離心10 min，常規分離血清并置于-80℃冰箱保存。于上述4個時間點處死大鼠后，迅速剝離大鼠的腎臟，記錄其肉眼外觀，然后每側腎各取1塊組織置于10%的中性甲醛中4℃固定過夜，標本待測。

腎功能檢測 血清肌酐(SCr)和血尿素氮(BUN)采用美國Backman全自動生化檢測儀檢測。

大鼠腎組織中過氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)的表達 采用比色法檢測組織MPO、組織SOD活性及血漿NO含量，檢測按試盒進行，嚴格按試劑盒說明說操作進行檢測。

血漿Klotho蛋白 NOR+NS，Sham+NS,I/R+NS三個組采用ELISE法檢測Klotho蛋白水平。

腎臟病理檢查 已固定腎組織經脫水、透明、浸蠟和包埋等步驟制成蠟塊后制作切片，染色前切片常規脫蠟入水，最后行HE染色。

統計學處理數據應用SPSS 14.0進行統計學分析，實驗所有數據均用表均值±標準差表示，兩組間比較用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

大鼠腎臟病理學改變缺血-再灌注損傷以后各實驗組各時間段大鼠腎臟組織呈現不同的改變，其中造模成功后24h改變最顯著。NOR+NS組鏡下腎小管未見明顯異常，腎皮質區個別腎小管輕度擴張，個別管腔內見紅染無結構蛋白管型樣結構；腎小球未見明確異常;Sham+NS組鏡下見皮質區個別腎小管擴張，部分腎小管上皮水腫，空泡變性；腎小球未見明確異常;I/R+NS組鏡下見皮質區及皮髓交接區部分腎小管刷狀緣消失，較多腎小管上皮細胞水腫，空泡變性，部分腎小管上皮核固縮，胞質紅染，凝固性壞死，脫落，管型形成；間質未見明確炎癥反應；腎小球未見明確異常;Sham+Klotho組鏡下部分腎小管上皮空泡變性；腎小球未見明確異常;I/R+Klotho組鏡下部分腎小管上皮空泡變性，并見少部分腎小管上皮壞死、脫落及管型形成；腎小球未見明確異常。

外源性補充Klotho蛋白對缺血再灌注前后SCr及BUN的影響實驗結果顯示NOR+NS組和Sham+NS組血清SCr水平及BUN水平各時間點無明顯變化，I/R+NS組血清SCr 1h～12h持續增高，并12h達到高峰，BUN水平也有持續增高趨勢，并24h達到高峰，與NOR+NS組和Sham+NS組相比明顯增高(P<0.01)，I/R+Klotho組血清SCr及BUN水平1h～12h持續增高趨勢，但與I/R組相比增高趨勢緩慢，各時間點SCr水平及BUN水平與I/R+NS組相比明顯下降(P<0.01)(圖1)。

圖1 血尿素氮(BUN)和血清肌酐(SCr)的動態變化相同時間點內各組間比較，NOR+NS組:AP<0.01,aP<0.05;各組比較,I/R+NS組:bP<0.05,BP<0.01;同一組內不同時間點比較1h:EP<0.01；NOR+NS：正常+生理鹽水組；Sham+NS:假手術+生理鹽水組；I/R+NS：手術+生理鹽水組；Sham+Klotho:假手術+Klotho組；I/R+Klotho:手術+Klotho組

Klotho蛋白表達的動態變化NOR+NS組及Sham+NS組Klotho蛋白表達水平各時間點無明顯變化，I/R+NS組Klotho蛋白表達水平逐漸減少，差異有統計學意義(圖2)。

圖2 Klotho蛋白表達的動態變化A:相同時間點內各組與NOR+NS組比較，P<0.01；NOR+NS：正常+生理鹽水組；Sham+NS:假手術+生理鹽水組；I/R+NS：手術+生理鹽水組

腎組織MPO的動態變化NOR+NS組和Sham+NS組MPO含量各時間點無明顯變化，I/R+NS組隨著再灌注時間的延長MPO含量逐漸增高，與1h MPO含量相比差異有統計學意義(P<0.01)，各時間點MPO含量與NOR+NS組和Sham+NS組相比明顯增高(P<0.01)，I/R+Klotho組MPO含量隨著時間的延長仍有升高趨勢，但與I/R+NS組相比升高趨勢緩慢，各時間點MPO含量與I/R+NS組相比明顯減少(P<0.01)(圖3)。

腎組織SOD水平的動態變化NOR+NS組和sham+NS組SOD含量各時間點無明顯變化，I/R+NS組SOD水平1h～24h呈逐漸下降趨勢，各時間點SOD水平與NOR+NS組和Sham+NS組相比顯著減少(P<0.01)，I/R+Klotho組血清SOD水平仍有逐漸下降趨勢，但與I/R+NS組相比下降趨勢緩慢，各時間點SOD含量與I/R+NS組相比明顯增高(P<0.01)(圖3)。

圖3 腎組織超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(MPO)的動態變化相同時間點內各組間比較NOR+NS組AP<0.01,aP<0.05;比較I/R+NS組bP<0.05,BP<0.01;同一組別不同時間點比較1h,EP<0.01;NOR+NS：正常+生理鹽水組；Sham+NS:假手術+生理鹽水組；I/R+NS：手術+生理鹽水組;Sham+Klotho:假手術+Klotho組;I/R+Klotho手術+Klotho組

血漿NO濃度的動態變化NOR+NS組血漿NO水平1h～12h無明顯變化，24h明顯降低，sham+NS組NO水平5h明顯下降，與1h相比差異有統計學意義(P<0.01)，但24h NO含量明顯增高，與5h相比差異有統計學意義(P<0.01)，I/R+NS組NO水平1～24h逐漸下降趨勢，各時間點NO含量與Norm+NS組和Sham+NS組相比顯著降低(P<0.01)，I/R+Klotho組NO含量1～24h仍有逐漸下降趨勢，但與I/R+NS組相比下降趨勢緩慢，各時間點NO水平與I/R組明顯增高(P<0.01)(圖4)。

圖4 血漿一氧化氮(NO)濃度的動態變化相同時間點各組間比較NOR+NS組AP<0.01；同組內不同時間點比較1h，EP<0.01;NOR+NS：正常+生理鹽水組；Sham+NS:假手術+生理鹽水組；I/R+NS：手術+生理鹽水組；Sham+Klotho:假手術+Klotho組;I/R+Klotho手術+Klotho組

討 論

AKI目前仍是一個與高發病率和高死亡相關的嚴重醫學問題，如何能有效改善患者腎缺血，改善氧化應激一直是研究者追尋的結果[3]。 AKI是十分復雜的病理生理過程，其發病機制可能涉及腎缺血再灌注損傷、炎癥因子、NO學說、細胞 凋亡學說、內皮功能障礙及內皮素作用、內毒素直接損傷、氧化應激損傷等[4]。據文獻記載， NO的產生對缺血預處理大鼠的腎臟有積極的影響，抑制NO合成增加了腎臟對缺血再灌注損傷的易感性[5-6]。

本研究通過切掉大鼠右側腎臟，夾閉左側腎蒂建立大鼠缺血-再灌注模型，而后給予Klotho蛋白干預。結果顯示隨著再灌注時間的延長BUN及SCr含量持續增高，與NOR+NS組和Sham+NS組相比明顯增高，提示缺血-再灌注后，大鼠腎臟受損、腎功能顯著受損，腎組織形態學檢查亦顯示皮質區及皮髓交接區部分腎小管刷狀緣消失，較多腎小管上皮細胞水腫，空泡變性，部分腎小管上皮核固縮，胞漿紅染，凝固性壞死，脫落，管型形成，均表明I/R模型制作成功。

當細胞被有害因素刺激時，產生大量的活性氧，氧化和抗氧化系統之間的平衡被破壞，最終發生氧化應激，促進細胞凋亡甚至病理損傷。大量研究表明，許多腎臟疾病模型處于氧化應激狀態，因此本研究通過檢測腎組織MPO及SOD含量以判定大鼠IRI模型的氧化應激反應。其中MPO是一種過氧化物酶，為髓系細胞殺菌系統的重要組分，同時也是氧化應激的一個主要標志物[7]，本研究得出I/R+NS組隨著再灌注時間的延長MPO含量逐漸增高，并各時間點MPO含量與正常對照組及假手術組相比明顯增高，提示缺血再灌注后腎組織中性粒細胞聚集，參與腎臟的損傷；而SOD作為一種抗氧化酶，可以抵抗機體受氧化損傷，其活性高低也可反映機體抗體抗氧化能力[8]。本實驗結果提示I/R+NS組隨著再灌注時間的延長，SOD水平明顯減少，并各時間點的SOD含量與對照組相比明顯減少提示缺血再關注后產生大量ROS，導致抗氧化物質SOD的大量消耗。以上均表明IRI損傷中氧化應激參與腎組織的損傷。

盡管Klotho在多個器官中表達，但它在腎臟中高表達，特別是在遠曲小管中[9]，大量研究證實Klotho蛋白具有抗氧化，抗凋亡，抗衰老等功能[9-11]，而后Hu等[12]發現IRI大鼠的腎臟，尿液和血液中的Klotho減少，損傷修復后恢復正常。提示Klotho蛋白缺失參與AKI發生發展的病理生理過程。本研究結果顯示:IRI以后，Klotho蛋白含量明顯減少，結果與Hu等[12]的實驗結果相符，Klotho蛋白干預后IRI大鼠SCr水平及BUN明顯減少、病理組織學也顯示腎組織損傷程度減輕，提示Klotho蛋白有腎臟保護作用，通過實驗我們還證實Klotho干預以后腎組織MPO含量減少，SOD含量增多，考慮Klotho蛋白腎臟保護作用與其抗氧化作用密切相關。

NO作為一種血管舒張因子．可以降低腎臟血管阻力、改善腎臟血液灌注，保證腎臟代謝及排泄功能的正常運行，NO濃度的適當升高，是AKI中一個重要的保護因素。研究表明，Klotho蛋白具有抗氧化應激作用，Klotho能否通過調節NO的合成及其活性改善急性腎損傷的腎臟灌注目前未見相關報道。我們得出的實驗結果顯示：NOR+NS組損傷12h之前NO含量無明顯變化，Sham+NS組5h明顯下降，但24h NO含量明顯增高，提示單純手術對NO含量無明顯影響，單群手術以后機體通過自我調節能提高NO含量；I/R+NS組NO水平隨著再灌注時間的延長逐漸下降趨勢，各時間點NO含量與NOR+NS組和Sham+NS組相比明顯降低，NO水平的下降與腎臟形態結構損傷及功能損害程度相符，均說明缺血-再灌注損傷中體內NO含量下降可能為腎臟損傷過程中不可忽視的環節；Klotho蛋白干預后NO含量明顯增高，腎臟功能及形態學損傷有明顯的恢復，考慮Klotho蛋白的腎臟保護作用可能與其通過增加NO含量來擴張腎臟血管及改善腎臟血供密切相關。

綜上所述，I/R后，大鼠腎臟組織形態及功能均發生損傷，氧化應激參與此過程，Klotho蛋白通過抵抗過度氧化應激減輕腎缺血-再灌注損傷，其作用可能與調節NO合成密切相關，Klotho蛋白促進NO合成的具體作用機制還需進一步研究。