急性腎損傷腎小管上皮細胞修復的分子機制

姜 雪 綜述 李世軍 審校

急性腎損傷(AKI)最常見原因是缺血、中毒和梗阻等因素導致近端小管上皮細胞凋亡或壞死，其主要組織學特征包括近端小管上皮細胞刷狀緣脫落，腎小管上皮細胞扁平和局灶性脫落，炎性細胞浸潤以及形成富含Tamm-Horsfall蛋白的管型[1]。輕度損傷時，近端小管上皮細胞再生使腎小管形態和功能恢復。而在重度損傷區域，上皮細胞廣泛受損、管周毛細血管損傷、內皮細胞及周細胞破壞、炎性細胞浸潤、成纖維細胞和α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)肌成纖維細胞增生，致使受損細胞外基質重塑不良、修復失調，造成持續的慢性炎癥和纖維化[2]。腎小管萎縮、腎單位進一步丟失和纖維化的惡性循環，導致AKI逐步進展為慢性腎臟病。本文對AKI腎小管上皮細胞修復的分子機制進行綜述，以期尋找促進近端小管再生的新治療靶點，抑制其慢性炎癥反應和纖維化進展。

腎小管上皮細胞與腎單位修復

小鼠AKI模型的遺傳命運圖譜研究顯示，殘存的腎小管上皮細胞(tubular epithelial cells，TECs)增生修復損傷的腎小管，腎小管外的細胞群不參與上皮細胞修復，這項研究結果同樣適用于人類[3]。但是，仍然存在由腎小管祖細胞介導上皮修復的可能性。究竟是殘存的TECs還是腎小管祖細胞介導上皮修復仍有爭論[4]。參與人和小鼠近端小管修復的CD133+CD24+細胞的發現增加了固有腎小管祖細胞群存在的可能性[5]。體外研究發現這些細胞具有極強的自我更新能力，并且可以經誘導產生多個克隆細胞系，但體內研究尚未完全證實。最近一項研究表明，與體外研究結果相比，體內大多數器官的周細胞不具有間充質干細胞樣特性[6]。遺傳譜系示蹤技術是追溯不同細胞群轉歸的最可靠方法，但這項技術不能用于人體研究。Corbeil等[7]發現健康小鼠腎臟近端小管中CD133表達豐富，因此質疑這種細胞群的干/祖細胞標記是否準確。由于無法對人類體內CD133+CD24+細胞進行遺傳命運圖譜分析，且其在小鼠腎臟中的表達存在爭議又缺乏準確的分子特征，故CD133+CD24+細胞在腎臟損傷修復中的機制研究仍有困難[4]。

研究發現損傷的上皮細胞中角蛋白19，Bcl2和波形蛋白表達上調[8]。在人類腎臟中，CD133+CD24+細胞表達波形蛋白，與CD133-CD24-的細胞相比，其細胞質、線粒體較少，刷狀緣模糊。這些細胞主要于AKI后測出并表達腎損傷分子-1(Kim-1+)。Kusaba等[9]研究發現缺血再灌注損傷后小鼠CD24、CD133、Kim-1和波形蛋白表達上調?？傊?，這些研究結果表明CD133+CD24+細胞可能代表受損的TECs。持續多西環素標記實驗顯示，損傷前標記的TECs數量沒有增加; 而損傷后標記細胞顯著增加[10]。雖然這種標記無法準確證實幸存TECs群體的真正增殖方式，但表明很可能是由幸存受損上皮細胞進行AKI后的腎小管修復，一部分此類細胞表達Kim-1+Ki67+。

TECs在上皮內穩態和損傷后都嚴格保持其管狀特征。R26VT2 / GK3小鼠研究顯示在上皮內穩態和修復期間，克隆維系單個腎單位譜系和小管類型轉歸[11]。在上皮細胞穩態期間，Wnt反應細胞(Axin2+細胞)在腎皮質和髓質中大量復制,與ActinCre+細胞相比，它有更強的增殖能力。在橫紋肌溶解AKI模型中，Axin2+細胞在損傷后2個月內表現出更大規模的克隆擴增。但AKI后Wnt反應細胞子代的細胞類型和Wnt配體的來源尚不清楚。這種細胞的遺傳穩定性及其對腎臟修復的影響尚未驗證，故而這些細胞在損傷后上皮再生中的作用機制仍不明確。損傷后對近端小管上皮細胞中Wnt4誘導提示Wnt通路與腎臟修復之間可能存在聯系[12]。然而Wnt4的檢測基于免疫染色，迄今為止，尚無檢測Wnt蛋白的可靠抗體。隨后的研究也未證實腎小管上皮細胞中Wnt4表達。相反，在缺血再灌注損傷后，Wnt4在髓質肌成纖維細胞中被重新激活，且去除Wnt4對纖維化或肌成纖維細胞增殖沒有影響[13]。

目前，尚無確鑿證據證實在腎單位中存在干細胞或祖細胞群。然而，仍然存在具有強大體內復制能力的這種特殊TECs的可能性。因此未來可期通過藥物研發來激發具有潛在高復制能力的細胞類型以增強內源性修復過程。

促進腎小管上皮細胞修復的細胞因子

腎小管上皮細胞中是否存在獨特的細胞類型仍存爭議，AKI后上皮再生的關鍵細胞因子仍需進一步研究。損傷誘導Sox9激活是一種關鍵再生反應[14]，研究顯示Sox9是缺血再灌注損傷后24h內上調最高的轉錄因子之一[15]。正常腎臟的近端小管中僅有很少的Sox9+細胞，而在calbindin-28dk+的遠曲小管上皮細胞中Sox9+細胞成簇存在[14]。在缺血和梗阻性AKI中，Sox9+細胞可用于區分受損的增殖性近端小管上皮細胞亞型，損傷后48h約40%至45%的Sox9+細胞與Ki67共表達。在AKI向慢性腎臟病轉化模型中，研究人員證實Sox9是受損腎單位上皮細胞再生的關鍵內在活化因子[14]。損傷后早期激活Sox9細胞的命運圖譜研究顯示，其子代恢復了與正常腎小管上皮細胞相似的頂端-基底端極性，從而證實這些細胞可再生近端小管上皮細胞[14](圖1)。與對照組小鼠相比，在缺血再灌注損傷后4周，近端小管特異性敲除Sox9的小鼠早期腎臟修復反應和腎功能恢復均嚴重受損，并產生更嚴重的纖維化。缺血再灌注損傷后4周，大部分近端小管中Sox9表達恢復到基線水平，近端小管恢復正常，損傷表達完全消除(Kim-1-)。然而，近端小管某些區域持續表達Kim-1，且這種Kim-1+的近端小管上皮細胞同時表達Sox9，此類Kim-1+Sox9+的近端小管上皮細胞亞型損傷修復尚未完成(圖1)。此種細胞類型可能在AKI向慢性腎臟病轉化中起作用[14]。Sox9也在中毒性AKI腎小管上皮細胞修復中發揮作用。Kang等[16]證明Sox9是中毒性AKI腎臟修復的關鍵細胞因子，但AKI后激活的Sox9+細胞或固有Sox9+細胞對整體修復的具體作用仍需進一步研究。

圖1 AKI后PTEC的轉歸[21]PTEC：近端小管上皮細胞；AKI：急性腎損傷；KIM-1：腎損傷分子1；EMT：上皮-間充質轉化

Sox9在腎小管上皮細胞形成和再生中均起著重要作用，在人類和小鼠腎臟胚胎發育中十分關鍵。單個Sox9等位基因失活突變可因其單倍體不足導致胃腸道發育不良綜合征[17]，其腎臟缺陷包括腎積水和腎發育不全。在腎臟胚胎發育過程中，敲除Sox8和Sox9可導致小鼠腎臟發育不全[18]。為了確定Sox9在近端小管上皮細胞修復和小管發育中的作用，研究人員對胚胎期腎臟Sox9+細胞進行遺傳譜系示蹤，結果顯示Sox9+細胞可發育成大部分腎小管上皮細胞[14]。然而，重新激活的基因是否會通過與它在發育過程中相似的基因調控網絡來再生受損的上皮細胞尚不明確[19]。與胚胎期相比，器官發生過程中起關鍵作用的活化基因于再生過程中可能會激活不同的基因調控網絡，Sox9的作用機制中或許存在此種因素。去分化是將分化成熟的細胞恢復到其發育期間在該譜系中的原始形式。研究發現葉酸誘導AKI后重新表達Pax2，故而Pax2被視為“腎小管上皮細胞去分化標記物”[20]。正常成人腎臟中髓質集合管持續表達Pax2，損傷發生后，Pax2在近端小管上皮細胞中重新表達。AKI后，Pax2+細胞的轉歸及Pax2在上皮修復中的作用仍有待研究證實。同時Pax2或Sox9能否真正界定去分化的近端小管上皮細胞亞型尚不清楚。

急性腎損傷后，部分近端小管上皮細胞凋亡壞死，部分幸存近端小管上皮細胞產生多種損傷修復反應。(1)早期損傷修復反應：損傷誘導活化Sox9+Kim-1+的近端小管上皮細胞亞型，再生受損的上皮細胞[14]。(2)慢性損傷修復反應(小鼠缺血再灌注損傷后28d)：成功再生的上皮細胞Sox9轉陰; 而由Kim-1+的近端小管上皮細胞損傷尚未修復區域持續Sox9+應答試圖自我再生。在此階段，大多數增殖的Ki67+近端小管上皮細胞表達Sox9+; 因此，在慢性期，Sox9+Kim-1+細胞可區分尚未完全修復的近端小管上皮細胞亞型[14]。(3)損傷激活Snai1和Twist1使部分上皮細胞轉化至間充質狀態[22-23]。部分上皮-間充質轉化(EMT)與病理性促炎和促纖維化反應有關。此類細胞的細胞周期阻滯。(4)小鼠重度AKI模型(單側缺血再灌注損傷、雙側嚴重缺血再灌注損傷、單側輸尿管梗阻模型)和經典纖維化模型(馬兜鈴酸腎病)中，G2/M期阻滯的上皮細胞加劇了纖維化進展[24](圖1)。

阻礙腎小管上皮細胞修復的細胞因子

雖然受損的TECs在細胞類型方面高度保真; 仍有少數細胞可發生EMT，影響腎小管上皮細胞修復，加重促炎和促纖維化反應[22-23]。從部分EMT狀態治療受損細胞可提高損傷后腎臟修復效率。損傷時，TECs隨機發生部分EMT，同時分泌促炎和促纖維化因子。已有研究表明損傷激活的Snai1是胚胎發育和腫瘤進展期間有效的EMT誘導劑，可誘導部分EMT。單側輸尿管梗阻和葉酸誘導的AKI中，與對照組相比，近端小管上皮細胞特異性Snai1基因敲除動物的炎癥反應、α-SMA+肌成纖維細胞數量及纖維化程度明顯減弱[23]。另一項研究表明，在缺乏Snai1和Twist1(一種關鍵的EMT調節因子)的小鼠中，AKI所致的纖維化程度顯著降低[23]。這項研究顯示，Snai1和Twist1可導致TECs的G2期阻滯，從而抑制TECs的增殖并增強其促炎和促纖維化反應。部分EMT可能是嚴重受損的TECs嘗試獲得遷移表型以覆蓋裸露腎小管基膜的表現。然而，在這種損傷修復反應過程中，同時啟動了促炎和促纖維化分子程序。與完全EMT相比，發生部分EMT的受損TECs除具有遷移特性外，還獲得了轉分化為間質肌成纖維細胞的侵襲性表型[25]。Yang等[24]發現G2 / M細胞周期阻滯的近端小管上皮細胞可以分泌促炎和促纖維化細胞因子，加重纖維化程度?？偟膩碚f，這些研究主張更全面地了解影響腎小管上皮細胞修復的細胞因子，以期尋找干預其促炎促纖維化過程的靶向藥物，減少AKI進展為慢性腎臟病。

調節腎臟修復的細胞分子信號通路

AKI后腎臟修復可能是損傷誘導的多種信號通路激活、關鍵下游分子驅動和/或阻礙受損上皮細胞再生之間相互作用的結果。損傷誘導表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor ，EGFR)、集落刺激因子1(colony stimulating factor 1，Csf-1)、經典Wnt/β-catenin通路和視黃酸信號傳導通路(RA signaling)基因擾動，影響AKI后腎臟修復。研究表明EGFR和Erbb2是缺血性AKI后小鼠腎皮質磷酸化最多的磷酸受體酪氨酸激酶[26]。抑制表皮生長因子受體磷酸化或近端小管上皮細胞特異性敲除表皮生長因子受體，均可導致近端小管上皮細胞增殖減少、早期功能和組織學修復受損。雖然許多研究表明缺血、中毒和梗阻性AKI模型中通過配體(如外源性表皮生長因子或肝素結合表皮生長因子)激活表皮生長因子受體通路具有修復作用[27]，但其修復過程中的下游機制仍有待闡明。近端小管上皮細胞中損傷誘導的STAT3-Birc5信號傳導通路似乎亦是一種修復反應。γ-分泌酶抑制劑抑制STAT3(信號傳導及轉錄激活因子3)磷酸化可導致Birc5表達下調、修復反應延遲[28]。與對照組相比，近端小管上皮細胞特異性Birc5敲除小鼠的TECs增殖減弱、腎功能和組織學恢復延遲。

AKI后，TECs中表皮生長因子受體和STAT3/ Birc5信號傳導被激活。肝素結合表皮生長因子 (HBEGF)是上皮細胞釋放的表皮生長因子受體信號傳導配體，以自分泌或近分泌方式激活表皮生長因子受體信號傳導通路。巨噬細胞通過旁分泌促進上皮細胞中的集落刺激因子1(Csf-1)激活，Csf-1的激活反過來促進M2巨噬細胞表型標志物生成。巨噬細胞旁分泌激活TECs中的RA信號傳導通路和經典Wnt/β-catenin信號通路。巨噬細胞和內皮細胞分泌的IL-22和MMP(基質金屬蛋白酶)分別作用于TECs促進腎臟修復。內皮細胞通過S1pr1(鞘氨醇1-磷酸酯受體1)和Hif1α/ Hif2α(缺氧誘導因子)信號傳導調節慢性炎癥反應，促進修復。此外，血管分泌因子如VEGF、Ang1和Sirt1(組織沉默調節蛋白1)均影響腎臟修復反應[21]，但目前仍需進一步研究加以證實(圖2)。

圖2 腎臟修復的細胞分子信號網絡[21]

小結：對AKI后腎小管上皮細胞修復的研究已有一定進展。損傷誘導腎小管上皮細胞再生、部分EMT和細胞周期阻滯體現了受損近端小管上皮細胞的多樣化轉歸。目前對這些重要生物學過程的分子機制仍然知之甚少。對其機制的進一步研究可能會提示新的治療策略和方向，從而發現腎臟修復過程中有希望的治療靶點和生物標志物，以促進腎臟自身修復、抑制其伴隨的纖維化，減少AKI進展為慢性腎臟病。