蝦源枯草芽孢桿菌生長動力學與抑制效應評價

劉玲，郭全友，李保國，姜朝軍

1(上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海,200093) 2(中國水產科學研究院東海水產研究所，上海，200090)

南美白對蝦是當今全球養殖產量最高的三大蝦類之一。熟制南美白對蝦蝦仁在儲藏過程中易被微生物污染而導致腐敗變質。人們將生存能力強、繁殖快，且產生腐敗臭味代謝產物的特定菌群稱為特定腐敗菌[1]。對蝦的優勢腐敗菌與其品質和貨架期之間存在密切關系，在實際生產過程中往往可通過控制優勢腐敗菌生長繁殖來改善產品品質，延長其貨架期。研究表明枯草芽孢桿菌是低酸性罐頭[2]、肉制品[3]及水產品[4]等多種熟制食品的優勢腐敗菌。林進[5]研究表明枯草芽孢桿菌是熟制南美白對蝦的優勢腐敗菌之一。鄭麗君等[6]通過測定免泡豆桿中腐敗代謝產物(TVB-N)的產量因子為35.38(mg/100 g)，確定枯草芽孢桿菌是致腐能力較強的腐敗菌之一，因此抑制及預測枯草芽孢桿菌的生長對評估水產品儲藏及安全具有重要意義。

預測微生物學用于描述和預測微生物在一定條件下的生長情況，可對食品安全做出快速評估。其中預測微生物一級模型主要表征微生物數量與時間函數的關系[7]；二級模型主要表達通過一級模型得到的參數與環境因子變量之間的函數關系[8]；目前微生物生長動力學模型構建及參數獲取仍通過平板計數法，該法準確度高，但費時費力。WANG等[9]研究發現，通過OD-TTD值測定金黃色葡萄球菌的生長曲線時，OD值與菌落總數成線性關系(R2=0.999 7)，且該值可通過Gompertz模型、Baranyi模型、Logistic模型和3PLM模型進行計算。劉珊娜等[10]通過測定單增李斯特菌菌株在不同培養條件下菌液的OD600 nm值，繪制生長曲線并建立生長模型。吸光度法以其檢測速度快和高通量等優勢日益受到學者關注[11]。有研究表明，ε-聚賴氨酸和Nisin對枯草芽孢桿菌具有協同抗菌效應[12]。近年有學者多采用Aw、pH、鹽分及儲藏溫度[7，11，13]等變化預測腐敗菌的生長狀況，但采用生物因子作為生長調控因子的生長動力學模型較為少見。

本文以分離自熟制南美白對蝦中的優勢腐敗菌(枯草芽孢桿菌)為對象，研究pH和生物因子對枯草芽孢桿菌生長的影響，采用OD值測量法，用修正Compertz模型進行數據擬合并構建一級模型，根據分析所得數據對最大比生長速率的μmax值和遲滯期λ構建二級模型，為有效抑制枯草芽孢桿菌的生長，延長熟制南美白對蝦貨架期提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HCl標準溶液(0.01 mol/L)，深圳市博材達科技有限公司；營養瓊脂(AR)、甘油、營養肉湯(BR)、NaCl(AR)，上海市國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Bioscreen C微生物生長測定儀，芬蘭Oy GrowTh Ab Ltd.；pHS-3C pH計，上海雷磁儀器廠； SW-CJ-1FB潔凈工作臺，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；ZM-100反壓蒸煮消毒鍋，廣州標際包裝設備有限公司；ZHWY-200H恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 菌種來源與菌懸液制備

1.3.1 菌種來源

真空包裝熟制對蝦蝦仁(采購于寧德市某水產公司)貨架期終點時分離純化出優勢菌株，經MIDI細菌鑒定系統(Microbial ID Inc.,美國)和BIOLOG細菌鑒定系統(Biolog公司，美國)和16S rRNA測序(KU570452.1)[14]鑒定為枯草芽孢桿菌，凍干，4 ℃貯藏，待用。

1.3.2 菌懸液制備

菌株活化：取枯草芽孢桿菌接種于無菌營養肉湯中，振蕩30s，37 ℃培養24 h，在營養瓊脂培養基中劃線得到單菌落。

菌懸液制備：挑取單菌落，接種到10 mL無菌營養肉湯中，37 ℃培養18 h，取1 mL培養液至9 mL無菌生理鹽水中得到10-1菌懸液，逐級稀釋，制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6梯度菌懸液，各取0.1 mL涂布于營養瓊脂平板，37 ℃培養48 h，選取菌量約105CFU/mL菌懸液作為接種液。

1.4 方法

參考文獻[12，14]設計pH值為 4.0、4.6、5.0、6.0和7.0五個水平。設計ε-聚賴氨酸和Nisin濃度值皆為20、60、100、140和180 μg/mL 5個水平(溶液設定pH=5.0)。調節過pH、生物因子濃度的營養肉湯溶液經121 ℃滅菌處理，每孔180 μL接入微孔板中，取105CFU/mL的接種液20 μL，確定最終接種液濃度為104CFU/mL左右，接種入孔，每個條件3組平行，1個空白，在微生物生長測定儀中速37 ℃振蕩培養，7 d內間隔1h測定OD600nm值。

1.5 蝦源枯草芽孢桿菌一級模型的建立

選擇修正的Gompertz方程式(1)[15]對實驗數據進行擬合。

(1)

式中：t為時間，h；ODt為t時的吸光度值，ODmin為最小OD值；A為菌數增長的對數值；μmax為最大比生長速率,h-1；λ為遲滯期,h。

1.6 蝦源枯草芽孢桿菌二級模型的建立

本研究基于一級生長模型中所得到的蝦源枯草芽孢桿菌的μmax值和λ值，選取平方根模型(式2、式3)[7]對蝦源枯草芽孢桿菌的二級生長模型進行擬合。

(2)

(3)

式中：b為方程常數；T為溫度，℃；Tmin為生長最低溫度，℃，即在此溫度時最大比生長速率為零；λ為遲滯期；μ為比生長速率。

ZWIETERING等[16]提出pH值對微生物生長速率的影響可以用平方根經驗模型式(2)和式(3)來描述，同樣的ε-聚賴氨酸濃度及Nisin濃度對微生物速率的影響也可以用式(2)和式(3)來描述。

1.7 模型可靠性評價

通過判定系數R2，均方誤差(root mean square error，RMSE)，偏差因子(bias factor，Bf)和準確因子(accuracy factor，Af)[13]來進行驗證。

(4)

(5)

(6)

式中：y實測為實測值；y預測為預測值；n為實測值個數。

1.8 數據處理

試驗均重復3次，結果采用平均值±標準偏差，采用Excel 2010進行數據處理及計算。按照修正Compertz模型進行擬合，采用Origin 9.0(美國OriginLab公司)對數據進行處理分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 pH脅迫作用對枯草芽孢桿菌生長情況及生長動力學參數的影響

2.1.1 不同pH下枯草芽孢桿菌的生長曲線和一級模型的建立

微生物能在較廣范圍pH下生長，一般細菌可在pH 5.0～9.0生長。極端pH能改變細胞膜通透性，破壞細胞內營養物質從而造成細胞死亡[11]。孫力軍等[18]發現從枯草芽孢桿菌中提取的抗菌肽在pH 2.0～12.0具有廣泛的適應范圍，SASITHORN等[15]研究發現提取自一株新型枯草芽孢菌的蛋白酶能在pH 3.0～12.0維持最大活性的80%。

在37 ℃下，采用Origin 9.0軟件分析實驗數據并通過修正Compertz模型擬合的枯草芽孢桿菌生長曲線，pH 4.0～7.0時，呈現出S型生長曲線，如圖1所示，模型評價中R2均大于0.960，Af在1.030～1.040，Bf在0.970～1.020，RMSE在0.000～0.100，生長模型擬合優度良好。

圖1 37 ℃時不同pH下枯草芽孢桿菌生長曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus subtilis at different pH at 37 ℃注：圖中pH值均為實測值。

修正Gompertz模型擬合得到的枯草芽孢桿菌不同pH下的生長參數值如表1，37 ℃時，最大比生長速率隨pH增大而增大，pH為4.0時，最大比生長速率為0.023 h-1，pH為6.0時，最大比生長速率增至0.186 h-1，pH=6.0～7.0時，最大比生長速率變化不顯著，在0.184～0.186 h-1(表1)。

表1 37 ℃時修正Gompertz模型擬合得到的枯草芽孢桿菌不同pH下的生長參數值Table 1 Correction of growth parameter values of Bacillus subtilis modified by Gompertz at different pH values at 37 ℃ model

37 ℃時，遲滯期也隨pH增大而縮短，pH 4.0時遲滯期最長，為127.0 h，pH增至4.6時，遲滯期降至36.8 h，pH為6.0～7.0時，遲滯期為4.8～5.3 h，變化較不顯著。和LEE等[19]研究結果比較發現，多黏芽孢桿菌最佳生長為pH 5.0～9.0，在pH 4.0的肉湯中觀察到細菌計數減少約4個對數周期吻合。由最大比生長速率及遲滯期的數據表明，pH對枯草芽孢桿菌生長影響顯著，低pH降低最大比生長速率并延長遲滯期，抑制枯草芽孢桿菌的生長。

2.1.2 pH對生長動力學參數的影響及二級模型的建立

A-生長速率;B-遲滯期圖2 平方根模型擬合蝦源枯草芽孢桿菌最大比生長速率、遲滯期與生長pH的關系曲線Fig.2 Square root model fitting the maximum specific growth rate,lag time and growth pH of shrimp-derived Bacillus subtilis

2.2 ε-聚賴氨酸脅迫作用對枯草芽孢桿菌生長情況及生長動力學參數的影響

2.2.1 不同ε-聚賴氨酸濃度下枯草芽孢桿菌的生長曲線和一級模型的建立

ε-聚賴氨酸是白色鏈球菌的代謝產物，其抑菌譜廣，作用機理為破壞細胞膜、細胞壁、遺傳物質、酶或功能蛋白、抑制細菌的呼吸作用，從而達到抑菌目的[20-21]。如圖3所示，模型評價中R2均大于0.970，Af在1.000～1.100，Bf在0.950～1.040，RMSE在0.000 ～0.100，生長模型擬合優度良好。

圖3 37 ℃時不同ε-聚賴氨酸濃度下枯草芽孢桿菌生長曲線Fig.3 Bacillus subtilis growth curve at different ε-polylysine concentrations at 37 ℃注：ε-聚賴氨酸濃度為實測值。

修正Gompertz模型擬合得到的枯草芽孢桿菌不同ε-聚賴氨酸濃度下的生長參數值如表2，37 ℃，pH=5.0 時，最大比生長速率隨ε-聚賴氨酸濃度增大而減小，ε-聚賴氨酸濃度為20 μg/mL時，最大比生長速率為0.096 h-1，ε-聚賴氨酸濃度為100 μg/mL時，最大比生長速率增至0.060 h-1，ε-聚賴氨酸濃度增至180 μg/mL之間時，最大比生長速率降至0.034 h-1。

表2 37 ℃時修正Gompertz模型擬合得到的枯草芽孢桿菌不同ε-聚賴氨酸濃度下的生長參數值Table 2 Correction of growth parameter values of different ε-polylysine concentrations of Bacillus subtilis obtained by fitting Gompertz model at 37 ℃

遲滯期隨ε-聚賴氨酸濃度增大而增大，ε-聚賴氨酸質量濃度180 μg/mL時遲滯期最長，為73.9 h，ε-聚賴氨酸濃度降至20 μg/mL時，遲滯期降至7.4 h。與LI等[22]研究結果：在pH 5～8時，ε-聚賴氨酸對枯草芽孢桿菌具有較好的抑菌效力結果相似。與修艷輝[23]研究0.012 5%～0.2%聚賴氨酸作用于腐敗希瓦氏菌，最大比生長速率從0.202 h-1下降至0.088 h-1，遲滯期從1.4 h增大至6.7 h趨勢吻合。由最大比生長速率及遲滯期的數據表明，ε-聚賴氨酸濃度對枯草芽孢桿菌生長影響顯著，高ε-聚賴氨酸濃度降低最大比生長速率并延長遲滯期，抑制枯草芽孢桿菌的生長。

2.2.2 ε-聚賴氨酸對生長動力學參數的影響及二級模型的建立

A-生長速率；B-遲滯期圖4 平方根模型擬合蝦源枯草芽孢桿菌最大比生長速率、遲滯期 與生長ε-聚賴氨酸濃度的關系曲線Fig.4 Square root model fitting the relationship between maximum specificgrowth rate,lag time and growth ε-polylysine concentration of shrimp-derived Bacillus subtilis

2.3 Nisin脅迫作用對枯草芽孢桿菌生長情況及生長動力學參數的影響

2.3.1 不同Nisin濃度下枯草芽孢桿菌的生長曲線和一級模型的建立

Nisin能抑制大部分革蘭氏陽性菌及其芽孢的生長和繁殖，有研究結果報道Nisin對枯草芽孢桿菌的抑菌效果較好[24]。如圖5所示，模型評價中R2均大于0.986，Af在1.010～1.050，Bf在0.980～1.000，RMSE在0.000～0.100，生長模型擬合優度良好。

圖5 37 ℃時不同Nisin濃度下枯草芽孢桿菌生長曲線Fig.5 Growth curve of Bacillus subtilis at different concentrations of Nisin at 37 ℃注：Nisin濃度為實測值。

修正Gompertz模型擬合得到的枯草芽孢桿菌不同ε-聚賴氨酸濃度下的生長參數值如表3。37 ℃時，最大比生長速率隨Nisin濃度增大而減小，Nisin濃度為20～100 μg/mL時，最大比生長速率變化較不顯著，在0.078～0.084 h-1，Nisin濃度為140 μg/mL時，最大比生長速率降至0.043 h-1，Nisin濃度為180 μg/mL 時，7d內OD值無顯著差異，μmax≤0.001,判定枯草芽孢桿菌不生長[11]。同時，遲滯期也隨Nisin濃度增大而增大， Nisin濃度140 μg/mL時遲滯期最長，為131.8 h，Nisin濃度降至20 μg/mL時，遲滯期降至21.7 h。該結果與KHALIL等[25]研究25～100 IU/mL Nisin單獨處理枯草芽孢桿菌，隨濃度增加，OD600 nm繪制的生長曲線遲滯期增加，最大比生長速率減小。且使用低濃度的Nisin可能減少乳酸鏈球菌肽抗性細菌亞群的出現。由最大比生長速率及遲滯期的數據表明，Nisin濃度對枯草芽孢桿菌生長影響顯著，高Nisin濃度減小最大比生長速率并延長遲滯期，抑制枯草芽孢桿菌的生長。

表3 37 ℃時修正Gompertz模型擬合得到的枯草芽孢桿菌不同pH下的生長參數值Table 3 Correction of growth parameter values of Bacillus subtilis at different pH values at 37 ℃ modified by Gompertz model

注：“/”代表菌株未生長。

2.3.2 Nisin對生長動力學參數的影響及二級模型的建立

采用平方根模型作為二級模型擬合Nisin濃度對微生物生長的影響如圖6。

A-生長速率;B-遲滯期圖6 平方根模型擬合蝦源枯草芽孢桿菌最大比生長速率、遲滯期與生長Nisin濃度的關系曲線Fig.6 The relationship between the maximum specific growth rate,the lagtime and the growth Nisin concentration of the shrimp source Bacillus subtilis model

3 結論

以蝦源枯草芽孢桿菌為對象，通過調控不同環境因子(pH、ε-聚賴氨酸和Nisin)研究其生長規律，并建立了枯草芽孢桿菌的一級和二級生長模型，選取修正Compertz模型作為描述不同條件下蝦源枯草芽孢桿菌生長動力學參數的一級生長模型，模型評價中R2均大于0.960，Af均在1.000～1.100，Bf均在0.950～1.040，RMSE均在0.000～0.100，生長模型擬合優度良好。

根據修正Gompertz模型擬合得到的枯草芽孢桿菌不同調控因子下的生長參數值得出，枯草芽孢桿菌最大比生長速率隨pH增大而增大，而遲滯期卻縮短。pH為4.0時，最大比生長速率為0.023 h-1，遲滯期最長，為127.0 h；pH為6.0時，最大比生長速率增至0.186 h-1，pH 6.0～7.0時，最大比生長速率在0.184～0.186 h-1，遲滯期為4.8～5.3 h，變化不顯著。

最大比生長速率隨ε-聚賴氨酸濃度增大而減小，ε-聚賴氨酸濃度為20 μg/mL時，最大比生長速率為0.096 h-1，ε-聚賴氨酸濃度為100 μg/mL時，最大比生長速率為0.060 h-1，ε-聚賴氨酸濃度增至180 μg/mL之間時，最大比生長速率降至0.034 h-1。遲滯期隨ε-聚賴氨酸濃度增大而延長，ε-聚賴氨酸濃度180 μg/mL時遲滯期最長，為73.9 h，ε-聚賴氨酸濃度降至20 μg/mL時，遲滯期降至7.4 h。

最大比生長速率隨Nisin濃度增大而減小，Nisin濃度為20～100 μg/mL時，最大比生長速率變化較不顯著，在0.081～0.084 h-1，Nisin濃度為140 μg/mL時，最大比生長速率降至0.043 h-1，Nisin濃度為180 μg/mL 時，枯草芽孢桿菌不生長。遲滯期也隨Nisin濃度增大而增大， Nisin濃度140 μg/mL時遲滯期最長，為131.8 h，Nisin濃度降至20 μg/mL時，遲滯期降至21.7 h。

根據平方根模型能夠較準確預測蝦源枯草芽孢桿菌的生長狀況。R2分別為0.894和0.908?？梢娖椒礁Ｐ湍茌^好擬合不同調控因子與最大比生長速率、遲滯期之間的關系。