肉桂醛水乳劑制備及其柑橘青霉抑菌效果測定

林麗萍，陳妍妍，田博文，廖安平，陳金印

1(江西農業大學 農學院，江西省果蔬保鮮與無損檢測重點實驗室，江西省果蔬采后處理關鍵技術與質量安全協同創新中心，江西 南昌，330045) 2(江西農業大學 食品科學與工程學院，南昌市農產品加工與質量控制重點實驗室，江西 南昌，330045) 3(萍鄉學院，江西 萍鄉，337055)

柑橘是世界第一大類水果，全世界范圍內柑橘產業栽培品種結構逐漸趨于合理化，鮮果漸成消費主流，調查數據顯示寬皮柑橘94.3%用于鮮食[1]。應對鮮銷首要的策略就是降低損耗，延長貯藏時間，以提高利潤。柑橘采摘后特別容易受到霉菌的侵染，導致柑橘的腐爛，造成巨大的經濟損失，甚至影響到相關產業鏈的健康發展[2]?；瘜W防治的危害[3-4]眾所周知，物理防治措施往往需要一定的設備投入，生物防治效果又受環境限制[5-6]。有研究結果表明，植物源抑菌活性物質不僅能有效抑菌、增強活體防護效果，并且能夠誘導果實的抗病性[7]。

肉桂醛(cinnamaldehyde)是一種從肉桂等植物當中提取的具有抑菌功能的醛類有機化合物。對草莓、番茄、油桃、香菇等多種果蔬均具有顯著的防腐保鮮效果[8]。王德德等[9]證實納米化后的肉桂醛對辣椒疫霉病原菌的抑菌能力提高了50%～100%。JO等[10]以吐溫20作為乳化劑制備出粒徑<200 nm肉桂醛微乳，對甜瓜汁有一定的保鮮作用。課題組前期工作證實肉桂醛能有效增強贛南臍橙和新余蜜桔對青霉病害的防護效果以及誘導果實對柑橘青霉的抗病性[11-12]。說明肉桂醛具有良好的開發植物源柑橘保鮮劑的潛力。

鑒于肉桂醛難溶于水、熔點低、沸點高、易氧化、易揮發的特性[13]，綜合評估肉桂的特性及目前對果蔬保鮮劑水基化、緩釋化、省力化的需求方向[14-15]，擬將植物源有效抑菌成分肉桂醛制備成水乳劑，綜合評估其穩定性和抑菌活性，優選出后續肉桂醛柑橘保鮮劑的基礎配方。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 指示菌

柑橘青霉病原菌：指狀青霉(Penicilliumdigitatum)，購自中國農業微生物菌種保藏中心，保存于江西省果蔬保鮮與無損檢測重點實驗室，用做抑菌試驗指示菌。

1.1.2 培養基及主要試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，瓊脂20 g，pH自然，121 ℃滅菌20 min。作指示菌的活化、培養及抑菌試驗用。

肉桂醛(≥95%GC)；乳化劑：司盤20(S20)、司盤80(S80)、吐溫60(T60)、吐溫80(T80)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.3 主要儀器

LDZX-40B自動立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；SHP-160型生化培養箱，上海三發科學儀器有限公司；HH-6數顯恒溫循環水浴鍋，國華電器有限公司；Vortex-Genie2漩渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司；HC-2518R高速冷凍離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；BK5000數碼生物顯微鏡，重慶奧特光學儀器有限責任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 水乳劑的制備

一種失水山梨糖醇酐酯(S20、S80)分別與一種聚氧乙烯失水山梨醇酐酯(T60、T80)配制成HLB值在9.0～14.5的復合乳化劑。采用乳化劑在水中法制備肉桂醛水乳劑，固定體系總量及油相(質量分數為10%的肉桂醛)用量，改變復合乳化劑的用量(質量分數分別為8%、6%和4%)，以旋渦混合器8檔4 min 輸入能量。試驗重復3次。

乳化劑的HLB值參考文獻[16]，S80、S20、T60、T80的HLB值分別為4.3、8.6、14.6、15.0，復合乳化劑HLB值計算公式為：

(1)

式中：w1和w2分別為2種乳化劑的質量分數，%；HLB為相應乳化劑的親水親油平衡值；HLB1和HLB2分別為2種乳化劑的親水親油平衡值。

1.2.2 肉桂醛水乳劑穩定性的測定

離心穩定性，參考邵明輝[17]法，稍作改動。制備水乳劑分裝于10 mL離心管中，經10 000 r/min，4 ℃離心10 min，若水乳劑仍保持均勻乳白色則離心穩定性合格；有析油、沉淀或分層情況則不合格。

低溫穩定性試驗[18-19]，制備水乳劑分裝于10 mL 離心管中，(4±1) ℃冰箱中保存7 d，若低溫出現析油、沉淀或分層情況，置于室溫，這些現象逐漸消失，或者經過適當振搖可以恢復原來乳狀液的情況，則低溫穩定性合格，否則為不合格。

高溫穩定性試驗[18-20]，制備水乳劑分裝于10 mL 離心管中，(54±1) ℃恒溫箱中，貯存14 d，外觀保持均勻，若出現分層，室溫振搖后可以恢復原狀即為高溫穩定性合格；否則為不合格。

稀釋穩定性試驗[18]，將1 mL肉桂醛水乳劑，用標準硬水稀釋20倍，攪拌均勻，靜置1 h，觀察現象，并記錄。無沉淀和浮油為合格。

1.2.3 肉桂醛水乳劑貯藏性測評

制備好的水乳劑于37 ℃恒溫箱中保存14 d，觀察析油情況、黃層高度及色澤，記錄實驗現象。參考華乃震關于水乳劑應符合的基本性質[22]描述，擬定評判肉桂醛水乳劑經時穩定性的表觀評定指標，應用加權評分法對不同水乳劑評分，滿分為100分，評分標準見表1。

表1 肉桂醛水乳劑的表觀評分標準Table 1 Rating criteria of emulsion in water of cinnamaldehyde

1.2.4 肉桂醛水乳劑分散性測定

于100 mL量筒中裝入99.5 mL標準硬水，用注射器吸0.5 mL待測水乳劑樣品，從距量筒水面5 cm處滴入水中，觀察其分散狀況，按其分散性能的好壞分為優、良、劣三級。

優級：在水中呈云霧狀自動分散，無可見顆粒下沉。

良級：在水中能自動分散，有顆粒下沉，下沉顆?？陕稚⒒蚪涊p微搖動后分散。

劣級：在水中不能自動分散，有顆粒呈絮狀下沉，經強烈搖動后才能分散。

1.2.5 肉桂醛水乳劑形態

將制備好的水乳劑用水溶性染料美藍染色，光學顯微鏡下觀察，并測定油滴的粒徑大小。

1.2.6 肉桂醛水乳劑抑菌效果測定

取0.2 mL指示菌孢子懸液，均勻涂布于PDA培養基表面，杯碟法檢測不同肉桂醛水乳劑的抑菌效果。(28±1) ℃，培養48 h，十字交叉法測量抑菌圈，取平均值做抑菌圈直徑。試驗重復3次。

1.2.7 肉桂醛水乳劑最小抑菌濃度

以復合乳化劑為稀釋劑，二倍稀釋法[23]將水乳劑稀釋為肉桂醛濃度分別為1 000、500、250、125、62.5 μg/g。采用杯碟法檢測不同濃度肉桂醛水乳劑的抑菌效果。以肉桂醛濃度從低到高首次出現抑菌圈的濃度為最小抑菌濃度。試驗重復3次。

1.2.8 數據分析

所有水乳劑制備試驗和抑菌試驗均重復3次，試驗結果以平均值±標準偏差的形式給出。采用Excel 2010對肉桂醛水乳劑貯藏性評分值做圖，IBM SPSS 20對不同肉桂醛水乳劑表觀評分值及抑菌圈大小進行方差分析及多重比較。

2 結果與分析

2.1 肉桂醛水乳劑穩定性試驗結果

肉桂醛水乳劑穩定性試驗結果見表2和表3。

表2 司盤20-吐溫60/吐溫80-肉桂醛水乳劑穩定性試驗結果Table 2 The stability test results of emulsion in water from Span20-Tween60/Tween80- cinnamaldehyde

表3 司盤80-吐溫60/吐溫80-肉桂醛水乳劑穩定性試驗結果Table 3 The stability test results of emulsion in water from Span80-Tween60/Tween80-cinnamaldehyde

復合乳化劑HLB值在9.0～14.5，司盤20-吐溫60/吐溫80-肉桂醛水乳劑與司盤80-吐溫60/吐溫80-肉桂醛水乳劑的低溫和稀釋穩定性均合格，能夠保持均勻一致的乳白色乳狀液。離心穩定性以司盤80-吐溫80-肉桂醛水乳劑合格率最高為100%，其他3個組(司盤20-吐溫60-肉桂醛、司盤20-吐溫80-肉桂醛和司盤80-吐溫60-肉桂醛)中復合乳化劑用量為8%時，經10 000 r/min，4 ℃離心10 min，會出現浮油或者白色沉淀，不能保持白色均勻水乳劑狀態。

制備好的水乳劑經(54±1) ℃恒溫箱中，貯存14 d后，大部分出現析油和白色沉淀情況；僅復合乳化劑用量為4%的司盤20-吐溫60(HLB值為11.2和12.3)和司盤80-吐溫60(HLB值為別為9.0、10.1、11.2和12.3)6個處理的肉桂醛水乳劑高溫穩定性測定指標為合格；其他組中復合乳化劑用量為4%的處理，也只有少量析油。

2.2 肉桂醛水乳劑貯藏性測評結果

按照表1評分標準對37 ℃恒溫箱中保存14 d的司盤20-吐溫60/吐溫80-肉桂醛水乳劑表觀特征進行評分，結果見圖1。

圖1 司盤20-吐溫60/吐溫80-肉桂醛水乳劑評分值Fig.1 The rating value of emulsion in water from Span20-Tween60/Tween80-cinnamaldehyde

除乳化劑用量為8%的司盤20-吐溫60-肉桂醛組在HLB 10.1時出現了最大評分值(83.0分)外，其他處理組隨HLB值增加，表觀評分值均呈逐漸上升趨勢；至HLB值分別為13.4和14.5時，12個處理的評分值均≥80.0分，均可保持較穩定的均勻乳白色水乳劑，或有少量黃色細小油滴，其中最高評分為乳化劑用量6%，HLB值為14.5的司盤20-吐溫80-肉桂醛水乳劑，評分值為87.0分。另外，HLB值為12.3，乳化劑用量為6%的司盤20-吐溫60-肉桂醛處理也能形成較穩定的乳白色水乳劑。

同樣，按照表1評分標準對37 ℃恒溫箱中保存14 d的司盤80-吐溫60/吐溫80-肉桂醛制備水乳劑表觀特征進行評分，結果見圖2。

圖2 司盤80-吐溫60/吐溫80-肉桂醛水乳評分值Fig.2 The rating value of emulsion in water from Span80-Tween60/Tween80- cinnamaldehyde

乳化劑用量為4%的2個組在HLB值9.0～14.5均不能保持均勻水乳劑狀態。乳化劑用量為6%和8%的司盤80-吐溫60-肉桂醛組中，均在HLB值為10.1、11.2和12.3時，保持均勻乳白色水乳劑，最高表觀評分值均出現在HLB值11.2，分別為93.0分和91.7分。乳化劑用量為6%和8%的司盤80-吐溫80-肉桂醛組中，HLB值9.0時，均不能保持均勻水乳劑狀態；乳化劑用量8%，HLB值14.5時，司盤80-吐溫80-肉桂醛也不能保持均勻水乳劑狀態；其余9個處理均為均勻乳白色水乳劑，有4個處理的評分在90.0分以上。乳化劑用量為6%和8%的司盤80-吐溫80-肉桂醛組中，最高分均出現在HLB值12.3，都是93.0分。

表觀評分值90分以上的水乳劑具備非常好的分散性。水乳劑滴入水中后呈云霧狀分散，形成乳狀液，分散過程中無可見顆粒，分散均勻且較為迅速，評價等級為優，見圖3。用水溶性美藍染料對水乳劑進行染色[17]，光學顯微鏡下可見藍色的背景和無色的油滴，油滴粒徑多數分布在2 μm左右，符合穩定水乳劑的基本特征[22]。

圖3 肉桂醛水乳劑分散試驗現象Fig.3 The appearance of dispersion test of Cinnamaldehyde water emulsion

司盤20-吐溫60/吐溫80-肉桂醛制備水乳劑組和司盤80-吐溫60/吐溫80-肉桂醛制備水乳劑組中共29個處理能形成均勻乳白色水乳劑，對其表觀評分進行統計分析(表4)，表觀評分間存在極顯著差異(P<0.01)。按形成水乳劑的較高評分值，從司盤20-吐溫60/吐溫80-肉桂醛水乳劑組和司盤80-吐溫60/吐溫80-肉桂醛水乳劑組各優選出4個處理，共計8個處理的水乳劑用來開展后續柑橘青霉病原菌的抑菌試驗。8個處理形成的水乳劑評分多重比較結果見表5。復合乳化劑為司盤80-吐溫60/吐溫80的4個處理形成的水乳劑表觀評分值均高于乳化劑為司盤20-吐溫60/吐溫80的4個處理，且具有極顯著差異。

表4 29個處理的評分值的方差分析結果Table 4 Variance analysis of rating value for 29 treatments

表5 八個處理的評分值的多重比較結果Table 5 Multiple comparisons of rating value for 8 treatments

注：采用Duncan法進行多重比較。同列標有不同大寫字母者表示組間差異極顯著(P<0.01)，標有不同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)。表6同。

2.3 肉桂醛水乳劑的抑菌試驗結果

通過貯藏性評分篩選出8個穩定性較佳的水乳劑處理，如表6所示。

表6 八個處理的抑菌圈多重比較結果Table 6 Multiple comparisons of inhibition zone of 8 treatments

對水乳劑做10倍梯度稀釋，杯碟法抑制柑橘青霉病原菌試驗表明，水乳劑稀釋至肉桂醛有效含量為1 mg/g時，能夠形成規則、穩定的抑菌圈。對抑菌圈大小進行方差分析，無顯著差異，顯著高于相同濃度肉桂醛對照組。肉桂醛水乳劑最小抑菌濃度均為250 μg/g，肉桂醛對照組的最小抑菌濃度為500 μg/g。

3 討論

3.1 水乳劑穩定性

除司盤80-吐溫80-肉桂醛組外，其他組中復合乳化劑用量為8%時，離心穩定性不合格，不能保持白色均勻水乳劑狀態?？赡芘c復合乳化劑成分、油相的密度均大于水相密度有關，在低能量輸入，較多的復合乳化劑用量情況下導致體系離心后，出現析油或沉淀現象；而吐溫80有更好的乳化性能，同時復合乳化劑中司盤80的HLB值(4.3)與吐溫80的HLB值(15.0)差值較較大，結構相似[24-25]，因此，司盤80-吐溫80-肉桂醛組形成水乳劑離心穩定性好。

高溫穩定性試驗，僅有6個處理(全部試驗涉及72個處理)的司盤20/司盤80-吐溫60-肉桂醛水乳劑高溫穩定試驗結果為合格，合格的處理中，復合乳化劑用量均為4%。其他組中復合乳化劑用量為4%的處理，也只有少量析油。說明高溫(54 ℃)可進一步促進水乳劑的形成。關于高溫對該組水乳劑的形成，有待于進一步研究。

3.2 較優肉桂醛水乳劑柑橘青霉抑菌活性

比較發現，司盤80-吐溫60/吐溫80-肉桂醛組中優選出的4個水乳劑貯藏性評分值顯著高于司盤20-吐溫60/吐溫80-肉桂醛組中優選出的4個水乳劑經時評分值；而這8個處理形成水乳劑的柑橘青霉抑菌圈直徑無顯著差異，但都顯著高于相同用量的肉桂醛。8個水乳劑的最小抑菌濃度均為250 μg/g，肉桂醛的最小抑菌濃度為500 μg/g，說明水乳劑配方中的復合乳化劑有協同增強肉桂醛對柑橘青霉的抑菌效果。

4 結論

目前，柑橘采后商品化處理主要采用化學藥劑做防腐保鮮，常用保鮮劑、殺菌劑有抑霉唑、咪鮮胺、雙胍鹽、噻菌靈等，面臨病原微生物對化學藥劑產生耐藥性和化學防腐保鮮效果下降的問題；且果品藥劑殘留，對人體健康造成很大影響。柑橘產業迫切需求綠色環保柑橘保鮮劑的開發。水乳劑是將不溶于水的有效成分以水為介質，通過輸入足夠的能量(如高剪切乳化和高壓均化等手段)并借助適當表面活性劑的作用，以微小液滴分散在水中，得到動力學上穩定，外觀呈乳白色的水包油型乳狀液劑型[26]。水乳劑以其水基化，表面活性劑用量小，少用或不用有機溶劑，而成為保鮮劑重點開發劑型。

試驗以植物源活性抑菌物質肉桂醛為原料，低能量輸入法，綜合評估水乳劑穩定性、分散性、貯藏性及其對柑橘青霉的抑菌效果，獲得了2個肉桂醛水乳保鮮劑的初級配方，即油相(肉桂醛)的質量分數為10%，復合乳化劑分別為6%的司盤80-吐溫60(HLB值為11.2)和6%的司盤80-吐溫80(HLB值為12.3)。在此基礎上可開展后續肉桂醛保鮮劑配方優化工作。