解淀粉芽孢桿菌產葡甘聚糖酶的條件優化及酶學性質研究

吳丹丹，莊敏，焦丹，周中凱

(天津科技大學 食品工程與生物技術學院，天津，300457)

葡甘聚糖酶(glucomannanase)能將葡甘聚糖降解為葡甘低聚糖，是一種胞外酶[1]。研究表明葡甘低聚糖具有降血糖、降血脂、低熱值、增強機體的免疫力和抗氧化能力等特殊生理功能，在食品、醫藥乃至生物農藥等方面具有很好的應用前景[2-5]。葡甘低聚糖的獲取方法有物理法、化學法和酶解法。物理方法所需實驗設備要求太高，無法大量生產；化學法(酸水解)生產得到的低聚糖性質不穩定，副產品多；酶解法反應效率高、方法簡單[1,6-7]。目前國內外對魔芋葡甘聚糖酶的研究處于初級階段，王強等[1,8]篩選出一株產葡甘聚糖酶的菌株，該菌株只在以葡甘聚糖類物質為唯一碳源的條件下才能合成葡甘聚糖酶，且酶活力為241.61 U/mL；周海燕等[9]篩選出的產葡甘聚糖酶的菌株只有在葡甘聚糖做碳源時才可以誘導產生目的酶，酶活力為3 174 U/mg。

本研究通過對解淀粉芽孢桿菌產葡甘聚糖酶的條件進行優化，并進一步研究酶學性質，為工業生產葡甘聚糖酶及葡甘聚糖酶的應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：本實驗所用菌種是由實驗室從土壤中篩選出，在固體平板上菌落形狀不規則，表面有褶皺，用接種環挑取時感覺黏稠，用16S rDNA序列比對法進行鑒定，根據blast結果鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌。

葡萄糖(分析純)，天津市科密歐化學試劑有限公司；蔗糖(分析純)，天津市光復科技發展有限公司；麥芽糖漿，河南禾田食品添加劑有限公司；蛋白胨(生物試劑)，北京奧博星生物技術有限責任公司；牛肉膏(生物試劑)，北京奧博星生物技術有限責任公司；瓊脂；北京索萊寶科技有限公司，麥芽汁提取物，碧迪醫療器械(上海)有限公司；胰蛋白胨、酵母浸粉(生物試劑)，英國OXOID；魔芋精粉，云南魔麗魔芋科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸，成都市科龍化工試劑廠；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

電子天平，上海舜宇平科學儀器有限公司；pH計，上海雷磁儀器有限公司；立式自動壓力蒸汽滅菌器，致微(廈門)儀器有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設備有限公司；醫用離心機(TGL-16A)，長沙平凡儀器儀表有限公司；紫外分光光度計，安捷倫科技(中國)有限公司。

1.3 培養基

斜面培養基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏30，NaCl5，瓊脂20，pH 7.2～7.4。

種子培養液(g/L)：無水葡萄糖10，酵母粉3，麥芽汁提取物3，胰蛋白胨5。

發酵培養液(g/L)：蔗糖20，酵母粉5，硝酸銨0.8， K2HPO42，MgSO40.1，pH 7.0。

1.4 實驗方法

1.4.1 葡甘聚糖酶粗酶液的制備

將解淀粉芽孢桿菌移入種子培養液中，200 r/min、30 ℃振蕩培養24 h；將種子液以10%接種量接種到發酵培養液中，200 r/min、30 ℃振蕩培養4 d，10 000 r/min、4 ℃離心25 min，所得上清液即為粗酶液，用DNS法測定粗酶液酶活力。

1.4.2 葡甘聚糖酶酶活的測定[9]

葡甘聚糖酶酶活力的測定：以0.9 mL 5 g/L魔芋精粉溶液(用pH 6.5，0.05 mol/L磷酸緩沖溶液配制)為底物，50 ℃預熱2 min，加入0.1 mL粗酶液，50 ℃ 反應10 min；加入DNS試劑3 mL終止反應，沸水浴5 min，冷卻并定容至25 mL，于波長540 nm處測定吸光度值(OD540)，以滅活酶液做空白對照，根據酶活公式(1)計算酶活力。酶活力定義：在上述反應條件下，底物每分鐘釋放1 μmol葡萄糖所需的酶量為1個酶活單位，以U/mL表示。

(1)

式中：U為酶活力，V/mL;m為還原糖的量，μg；t為反應時間， min；V為酶液體積，mL;n為稀釋倍數。

1.4.3 解淀粉芽孢桿菌產葡甘聚糖酶的發酵培養條件的優化

1.4.3.1 培養條件的優化

(1)發酵時間對酶活力的影響

按照1.4.1方法發酵葡甘聚糖酶，分別測定培養36、48、60、72、84、96 h后粗酶液的酶活力以確定最佳產酶培養時間，每組做3組平行實驗，下同。

(2)發酵溫度對酶活力的影響

按照1.4.1方法發酵葡甘聚糖酶，分別測定26、28、30、32、34 ℃條件下葡甘聚糖酶酶活力以確定最佳產酶培養溫度。

(3)接種量對酶活力的影響

按照1.4.1方法發酵葡甘聚糖酶，分別測定接種量為4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%時振蕩培養的葡甘聚糖酶酶活力以確定最佳接種量。

(4)裝液量對酶活力的影響

按照1.4.1方法發酵葡甘聚糖酶，分別測定裝液量為70、80、90、100、110、120 mL/250 mL時振蕩培養的葡甘聚糖酶酶活力以確定最佳裝液量。

1.4.3.2 產酶發酵培養基的優化

(1)碳源的選擇

采用優化后的發酵條件培養菌株，分別選用20 g/L 的不同碳源(蔗糖、葡萄糖、麥芽糖漿)，其他成分相同， 200 r/min、30 ℃振蕩培養72 h后離心取粗酶液測定其酶活，每組做3組平行實驗，下同。

(2)葡萄糖添加量的選擇

采用優化后的發酵條件培養菌株，以葡萄糖為碳源，改變培養基中葡萄糖添加量(10～60 g/L)，其他成分相同，200 r/min、30 ℃振蕩培養，離心取粗酶液測定其酶活。

(3)氮源及其添加量的選擇

采用優化后的發酵條件培養菌株，選用不同有機氮(5 g/L)：酵母粉、蛋白胨、尿素；不同無機氮(氮元素濃度為0.01 mol/L)：硫酸銨、氯化銨、硝酸銨，其他成分相同，200 r/min、30 ℃振蕩培養，離心取粗酶液測定其酶活。在上述實驗的基礎上，綜合考察不同酵母粉和硫酸銨濃度對菌株發酵產葡甘聚糖酶的影響。

1.4.4 響應面優化發酵條件

響應面法是采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的關系，因而被廣泛地應用于微生物發酵條件的優化和模型建立中[10-12]。在單因素試驗的基礎上，考慮各因素對產酶影響的顯著性差異，選取接種量、裝液量和發酵時間為自變量，葡甘聚糖酶酶活力為響應值，采用Design-Expert 8軟件Box-Behnken模型設計3因素3水平的二次回歸分析試驗條件，進行響應面分析，優化解淀粉芽孢桿菌產葡甘聚糖酶的培養條件[13-15]。

1.4.5 粗酶的性質

1.4.5.1 最適反應溫度及溫度穩定性影響

按照1.4.2酶活測定方法，分別在30～100 ℃溫度下反應測得酶活力。取適量粗酶液分別在上述溫度下保存30 min，然后取出放置冰上迅速冷卻測殘余酶活力。

1.4.5.2 最適反應pH值及pH穩定性影響

分別用不同pH緩沖溶液(pH 3.0～6.0檸檬酸緩沖液、pH 7.0～8.0磷酸緩沖液)配制魔芋底物，在各自相應的pH值反應測得酶活力。分別取適量粗酶液和等量上述不同pH值緩沖液，混勻4 ℃放置60 min，測殘余酶活力。

1.4.5.3 金屬離子的影響

配制10 mmol/L CaCl2、ZnCl2、AlCl3、KCl、MgCl2、BaCl2、FeCl3、NH4Ac、CuSO4、MnCl2母液。將粗酶液與等量金屬離子母液混勻(金屬離子的終濃度為5 mmol/L)，35 ℃保存30 min，按1.4.2酶活測定方法測殘余酶活。

1.5 數據分析處理

各項指標重復測定至少3次，取其平均值，采用Excel軟件和SPSS 19分析軟件進行數據統計分析，運用方差分析法(ANOVA)進行顯著性分析，顯著差異水平取P<0.05，采用Origin 8.5軟件進行圖形處理。

2 結果與討論

2.1 發酵條件優化的結果

2.1.1 發酵時間和溫度對產酶的影響

發酵初期，培養基中的營養物質主要用于菌體的生長，代謝產物較少。隨著發酵時間的延長，酶活逐漸降低，可能是因為營養物質被消耗，且大量積累有害的次級代謝產物，從而抑制菌體產酶[11]。由圖1-a可知，發酵時間為36～72 h時，葡甘聚糖酶酶活力曲線呈直線上升，72 h酶活力達到最大值。因此，解淀粉芽孢桿菌的最適發酵產酶時間是72 h。由圖1-b可知，在26～28 ℃， 溫度變化對解淀粉芽孢桿菌產酶影響變化幅度??；當溫度高于28 ℃時，酶活力上升，在30 ℃時達到最大值；溫度高于30 ℃時酶活力出現下降趨勢，因此解淀粉芽孢桿菌的最適發酵產酶溫度是30 ℃。

圖1 發酵時間(a)、發酵溫度(b)對產酶的影響Fig.1 Effects of fermentation time(a) and temperature (b) on enzyme production注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著，下同。

2.1.2 接種量和裝液量對產酶的影響

由圖2-a可知，隨著接種量的增加，葡甘聚糖酶酶活力升高，在10%時達到最大值，之后隨著接種量的增加酶活力下降，故最適接種量是10%。由圖2-b可知，裝液量在大于70 mL/250 mL時酶活力上升，大于130 mL/250 mL時酶活力下降；在裝液量90～130 mL/250 mL，酶活力變化較平緩，考慮到實際生產應用成本問題，在保證菌體產葡甘聚糖酶高酶活的情況的，采用較低裝液量，故解淀粉芽孢桿菌的最適發酵產酶裝液量為90 mL/250 mL。

圖2 接種量(a)、裝液量(b)對產酶的影響Fig.2 Effects of inoculation amount(a) and liquid loading(b) on enzyme production

2.2 菌株產酶培養基的優化結果

2.2.1 碳源及其添加量的選擇

如圖3-a所示，以葡萄糖為碳源時解淀粉芽孢桿菌產酶效果較好。

圖3 碳源(a)及其添加量(b)的選擇Fig.3 Selection of carbon source(a) and its added amount(b)注：*表示P<0.05，差異顯著；**表示0.001

隨著葡萄糖量增加，葡甘聚糖酶酶活力升高，但當其添加量超過40 g/L時，酶活力開始下降如圖3-b所示，因此，葡萄糖的最佳添加量為40 g/L。王強[1,8]利用枯草芽孢桿菌Q1，在以葡甘聚糖為碳源的條件下產生葡甘聚糖酶，該酶活力僅有241.61 U/mL，而本實驗研究的菌株可以在無葡甘聚糖作為引物時產生葡甘聚糖酶，酶活力可到1 500 U/mL。

2.2.2 氮源及其添加量的選擇

結果如圖4(a)所示，有機氮中以酵母粉為氮源、無機氮源中硫酸銨為氮源，葡甘聚糖酶酶活力較高，故選擇酵母粉和硫酸銨為發酵培養基的氮源。當酵母粉濃度為9 g/L時菌株產酶酶活力達到最大值；當硫酸銨濃度為0.8 g/L時，酶活力達到最大值，說明最適氮源為酵母粉和硫酸銨，其添加量分別為9 g/L和0.8 g/L。

圖4 氮源及其添加量的選擇Fig.4 Selection of nitrogen source and its added amount

2.3 響應面優化試驗結果

由單因素試驗確定接種量、裝液量和發酵時間為自變量，葡甘聚糖酶的酶活(U/mL)為響應值，進行3因素3水平的Box-Behnken設計試驗。其設計及結果見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計和響應值Table 1 Box-Behnken test design and response values

響應面分析中對Box-Behnken試驗結果進行擬合二次模型的方差分析(見表2)。模型的P值小于0.05，說明模型具有顯著性；該二次模型多元相關系數R2為0.945 9，表示有5.41%的變異情況不能由該模型解釋；失擬項P值為0.548 4，表明失擬項不顯著，即模型沒有失擬現象。

表2 Box-Behnken回歸方程的方差分析表Table 2 Variance analysis table of Box-Behnken regression equation

利用軟件對試驗數據進行方差分析后得到模型的二次多項回歸方程：

Y=1 948.38-79.10×A+130.45×B+77.24×C-76.43×A×B-176.23×A×C+463.72×B×C-19.72×A2+ 77.75×B2-529.75×C

(2)

式中：Y，葡甘聚糖酶的預測值(U/mL)；A、B、C，分別代表接種量(%)、裝液量(mL/250 mL)和發酵時間(h)。

通過Design-Expert 8軟件對回歸方程求解，預測解淀粉芽孢桿菌產葡甘聚糖酶的最佳培養條件為：接種量8%、發酵時間80 h、裝液量100 mL/250 mL，其他培養條件和培養基成分為：葡萄糖40 g/L、酵母粉9 g/L、硫酸銨0.8 g/L，發酵溫度30 ℃。在此條件下作3次驗證性試驗，測得葡甘聚糖酶酶活平均值為2 509 U/mL，這與回歸方程的預測值(2 535 U/mL)的相對誤差較小，用該回歸模型優化解淀粉芽孢桿菌產葡甘聚糖酶培養條件進行的分析和預測是可行的。本試驗得到的葡甘聚糖酶(2 509 U/mL)酶活要遠遠高于董桂清[16]所得到的葡甘聚糖酶(58.54 U/mL)。

2.4 粗酶的基本性質

2.4.1 最適反應溫度及溫度穩定性的影響

如圖5所示，葡甘聚糖酶的最適反應溫度為50 ℃， 這與枯草芽孢桿菌Q1[1,8]發酵產生的葡甘聚糖酶(最適反應溫度為35 ℃)不一致，可能是由于出發菌株的不同；將粗酶液在不同溫度下保溫30 min后，50 ℃條件下測定殘余酶活力，結果顯示在30～40 ℃ 范圍內葡甘聚糖酶保持穩定。

圖5 葡甘聚糖酶的最適反應溫度及其穩定性Fig.5 Optimum reaction temperature and stability of glucomannanase

2.4.2 最適反應pH值及pH穩定性的影響

由圖6可知，葡甘聚糖酶的最適反應pH值為7，該酶是一種中性酶。

圖6 葡甘聚糖酶的最適反應pH值及其穩定性Fig.6 Optimum reaction conditioins and stability of glucomannanase

將粗酶液在不同pH值下4 ℃保持60 min后，測定殘余酶活力，結果顯示該酶在pH 3～7較穩定，隨著pH值的增加(pH>5)相對酶活逐漸降低，穩定性差。

2.4.3 金屬離子對酶活力的影響

由圖7可知，將等量的酶液和不同金屬離子混合放置30 min后，測得的相對酶活各不相同。Al3+、Fe3+、Cu2+等離子對葡甘聚糖酶有強烈的抑制作用，Mn2+有一定的激活作用，其他離子也存在不同程度的抑制作用，但影響不是很大，這與王強等[1,8]研究結果一致，Cu2+和Fe2+對葡甘聚糖酶有強抑制性，Mg2+的抑制性較弱， Mn2+對葡甘聚糖酶有激活作用。

圖7 金屬離子對酶活力的影響Fig.7 Effects of metal ions on enzyme activity

3 結論

本研究以解淀粉芽孢桿菌為出發菌株，在單因素試驗的基礎上，利用響應面法對其發酵葡甘聚糖酶的條件進行優化，發現解淀粉芽孢桿菌在培養基成分中不含葡甘聚糖的條件下亦可產生葡甘聚糖酶，且得到最佳發酵條件：發酵時間80 h、接種量8%、裝液量100 mL/250 mL，溫度30 ℃；最佳培養基組分為：葡萄糖40 g/L、酵母粉9 g/L、硫酸銨0.8 g/L。在上述條件下葡甘聚糖酶酶活力達2 509 U/mL，是優化前(516 U/mL)的4.86倍。本研究通過響應面法優化培養條件，顯著提高了產酶水平，為工業上實現葡甘聚糖酶的大規模生產提供了有價值的參考。

該葡甘聚糖酶的最適反應條件為50 ℃、pH 7；在30～40 ℃、pH 3～7酶活力穩定；Al3+、Fe3+、Cu2+等離子對葡甘聚糖酶有抑制作用，Mn2+有一定的激活作用，這些特性為其在飼料和食品行業等方面的應用奠定了基礎。