西藏靈菇中高產雙乙酰乳酸菌分離篩選及產香特性研究

田懷香，史雨樺，張燕，陳臣，于海燕

(上海應用技術大學 香料香精技術與工程學院，上海，201418)

酸奶是一種傳統發酵乳制品，因其風味獨特和營養豐富深受消費者喜愛。風味是評價酸奶品質的重要指標之一[1]，它影響消費者對酸奶品質的認可程度[2]，也是指導新產品研發的方向[3]。

乳酸菌在酸奶發酵過程中，通過產生一系列酶，催化糖和蛋白質等物質的水解反應，生成可揮發性化合物，影響或改變酸奶的香氣[4]。近年來，國內外研究者圍繞如何通過內源調控的方法增強酸奶香氣品質開展了大量研究。如改變現有的酸奶發酵劑中菌株組成，即在保證酸奶正常生產的前提下，添加或增大產香菌的比重，使酸奶本身可以產生更為豐富的香氣化合物[5]；誘變或篩選新型的具有更高產香能力的乳酸菌用于酸奶發酵，從而使得酸奶的香氣品質有所提高[6]；進行發酵工藝的優化或添加輔助乳酸菌產香的物質，從而改變酸奶香氣品質[7]。

西藏靈菇，又名藏靈菇，是一種棲息著乳酸菌和酵母菌等多種菌株的乳白色菌體，其本身具有抑菌，降血壓，抗氧化，延緩衰老和改善腸道菌群環境[8]等功能。近幾年科研人員主要對西藏靈菇的菌群結構進行研究[9]。劉宇峰等[9]對西藏靈菇中菌群進行研究發現，西藏靈菇中的真菌多為酵母類，包括克魯維酵母等，細菌類主要為乳酸菌，包括桿菌和鏈球菌等。王興興[10]研究發現，乳酸菌是西藏靈菇中的優勢菌群，包含乳桿菌屬、乳球菌屬和腸球菌屬等。

雙乙酰是酸奶特征風味物質之一，具有奶油香型，常被用于評價酸奶香氣品質[11]，因此本研究選擇雙乙酰生產能力作為乳酸菌產香能力的衡量指標，擬從西藏靈菇中分離高產雙乙酰的乳酸菌，結合形態學特征和16S rDNA基因序列分析技術對乳酸菌進行進一步鑒定，并對該菌株的生長特性進行測定，最后通過與空白酸奶(傳統發酵劑發酵)對比，確定該菌株在酸奶香氣品質改進中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設備

1.1.1 試驗材料

西藏靈菇采自西藏自治區那曲地區。

1.1.2 培養基與試劑

全脂牛奶，光明乳業股份有限公司；商業化菌粉(保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌)，科漢森有限公司；MRS培養基，北京陸橋技術股份有限公司；2-辛醇(C7-C30：色譜純)，美國Dr. Ehrenstorfer公司。

1.1.3 主要儀器設備

顯微鏡，上海彼愛姆光學儀器制造有限公司；pH計，梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司；GC7890-MS5973N氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司；50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，美國Supelco公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 西藏靈菇樣品采集

將采集得到的西藏靈菇置于無菌牛奶中，4 ℃恒溫保存用于后續實驗。

1.2.2 乳酸菌的分離與純化

將采集得到的西藏靈菇用無菌生理鹽水充分沖洗，待水分減少后，將西藏靈菇置于牛奶中，25 ℃培養，傳代3次以上使其恢復活力。

將活化好的西藏靈菇置于無菌生理鹽水中搗碎，混勻，梯度稀釋，并涂布于MRS培養基上，37 ℃培養36～48 h。選取大小不同的菌落進行純化，純化3～5次之后將菌株保存于30%甘油中，凍存于-25 ℃冰箱中待用。

1.2.3 酸奶制備

篩選菌株酸奶制備：將上述疑似乳酸菌菌株在MRS液體培養基中活化3代后，將菌懸液于6 000 r/min條件下離心10 min，用無菌水清洗菌體2～3次之后，加入等體積的無菌水將菌體混勻，待用。將上述菌懸液按照5%(體積分數)的比例接種于牛奶中，并加入傳統發酵劑嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌(1×106CFU，用于凝乳)，37 ℃培養至凝乳，得到酸奶，4 ℃保存待測。

空白酸奶制備：將傳統發酵劑嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌按5%(體積分數)的比例接種于牛奶中，37 ℃培養9 h，得到空白酸奶，4 ℃保存待測。

酸奶共制備3批樣品，每批樣品至少含3組平行。

1.2.4 酸奶中雙乙酰含量測定

(1)酸奶前處理

取制備好的酸奶，按照1∶1的質量比加入160 g/L三氯乙酸溶液，振蕩搖勻，3 500 r/min條件下離心10 min， 取上清液備用。

(2)雙乙酰含量測定

參照李妍等[12]的方法測定酸奶中雙乙酰含量，取不同菌株酸奶處理液10 mL，測定OD335 nm值，對照標準曲線，計算樣品中雙乙酰的含量，每株菌測定3次。

1.2.5 乳酸菌的鑒定

將1.2.4中篩選出的雙乙酰產量較高的乳酸菌進行形態學檢測、接觸酶實驗和16S rDNA序列鑒定。將獲得的未知菌株的16S rDNA序列與GenBank中已知菌株序列進行類比，尋找同源性最高的菌株，并下載該菌屬內其他菌株的基因序列，利用MEGA 5.05對所有序列進行系統發生樹的構建。

1.2.6 最適生長溫度測定

將分離得到的乳酸菌以5%(體積分數)的接種量接種于含有5 g/L蛋白胨的牛奶中，分別置于15、25、32、37、40和45 ℃培養8 h，將得到的液體10倍梯度稀釋，涂布于MRS瓊脂培養基上，在37 ℃恒溫培養箱中培養至長出單菌落。每個溫度下測定3次。

1.2.7 生長曲線測定

將分離得到的乳酸菌按照5%(體積分數)的接種量接種于含有5 g/L蛋白胨的牛奶中，置于37 ℃環境中培養，每隔1～2 h取一定的發酵液，10倍梯度稀釋，涂布于MRS瓊脂培養基上，在37 ℃恒溫培養箱中培養至長出單菌落。每個取樣點重復3次。

1.2.8 酸奶香氣化合物分析

將篩選菌株酸奶和空白酸奶放置于4 ℃冰箱中后熟24 h，取約5 g酸奶樣品于15 mL固相微萃取小瓶內，加入內標物，混勻。將固相微萃取小瓶固定于一定溫度水浴鍋中，保證水浴的液面高于樣品的液面，采用老化好的萃取頭進行萃取處理。萃取條件為：萃取頭50/30μm DVB/CAR/PDMS，萃取溫度55 ℃，萃取時間40 min。

GC條件：色譜柱：HP-INNOWax毛細管柱(60×0.25 mm×0.25μm；美國J&W公司)；進樣口溫度：230 ℃；升溫程序：60 ℃恒溫3 min，以5 ℃/min速率升溫至230 ℃，保持10 min；載氣：He；流速：1 mL/min；不分流進樣。

MS條件：離子源溫度：230 ℃；電離源：EI；電子能量70eV；掃描范圍：20～350amu；全離子掃描模式。

定性分析：將C7-C30的烷烴標樣進入GC-MS分析，根據正構烷烴的保留時間計算檢測物質的保留指數(RI)。利用全離子掃描的質譜圖，比對NIST和Wiley 7n.1數據庫中的標準譜圖，并與文獻中的RI值進行比對，從而確定某種物質。

定量分析：采用內標法進行定量分析[13]。

1.2.9 數據分析

采用統計軟件SAS v8(North Carolina State University，USA)進行實驗數據的統計與分析，結果以均值±標準差表示，并對數據結果進行了T檢驗分析。

2 結果與討論

2.1 不同菌株發酵酸奶中雙乙酰含量對比

用MRS培養基對西藏靈菇中的乳酸菌進行選擇性分離純化，挑選共116株疑似乳酸菌進行酸奶制備，分別檢測其雙乙酰含量。其編號分別為1-1到1-36、2-1到2-40和3-1到3-40，分別代表篩選的3批菌株。以空白(傳統發酵劑發酵)酸奶中的雙乙酰含量為基準，不同菌株發酵酸奶雙乙酰含量見圖1。

圖1 不同菌株發酵酸奶中雙乙酰含量對比圖Fig.1 Comparison of diacetyl content in the yoghurts fermented by different strains

圖1中水平線代表空白酸奶的雙乙酰產量，共有26株菌發酵酸奶的雙乙酰產量高于空白發酵酸奶，即1-16、1-19、1-23、1-33、1-34、2-28、2-34和3-29等。對上述具有較高雙乙酰生產能力的菌株進行革蘭氏染色和接觸酶試驗[14]，最終挑選具有較高雙乙酰生產能力，并且革蘭氏染色位陽性，過氧化氫酶為陰性的菌株1-33進行后續相關研究。

2.2 乳酸菌鑒定

對2.1中挑選出來的菌株1-33進行形態學觀察，菌落特征觀察主要是在選擇性培養基上進行，細菌形態特征主要是利用顯微鏡觀察[15]，菌株1-33的形態學特征見圖2。

a-菌株的菌落形態；b-菌株的菌體形態圖2 菌株1-33的形態學特征Fig.2 Morphological characteristic of 1-33 production strains

由圖2可知，菌株1-33的菌落為圓型，邊緣完整，隆起，表面光滑，有光澤，乳白色，不透明，質地光滑；光學顯微鏡下為短桿狀，不運動，不產芽孢，革蘭氏染色均為陽性，符合乳桿菌的形態學特征[16]。

2.3 16S rDNA基因序列分析

16S rDNA的測序結果顯示1-33基因序列大小為1 459 bp，測序結果利用Blast進行同源性分析，根據對比結果分析菌株，結果表明該菌株與與植物乳桿菌H2(Sequence ID: HQ286594.1)的相似度最高，相似度>99%，因此判斷為植物乳桿菌。利用MEGA 5.05軟件，進行多序列比較，構建系統發生樹(見圖3)。

圖3 篩選乳酸菌基于16S rDNA基因的系統發生樹Fig.3 Phylogenetic tree of the screened Lactobacillus based on 16S rDNA gene sequences

由系統發生樹可知，菌株1-33與植物乳桿菌在同一分支上，證明其親緣關系最近，所以可以判定它們隸屬于植物乳桿菌種，并且與發酵乳桿菌，淀粉乳桿菌和德氏乳桿菌親緣關系都較近，形成第一類群。

2.4 菌株1-33的最適生長溫度測定

溫度可以對乳酸菌的生長狀況及代謝活動產生較大影響，環境溫度較低時，乳酸菌的生長較為緩慢，代謝活動也受到一定的抑制，乳酸和其他產物的生產量較低，進而影響酸奶品質[17]；環境溫度升高，菌體的生長速率加快，使乳酸菌到達生長穩定期的時間縮短[18]，但是過高的培養溫度也會使得乳酸菌的生長被抑制，甚至導致菌株死亡。因此尋找最適合乳酸菌生長的溫度，是保證其發酵酸奶具有較高品質的方法之一。測定菌株1-33的最適溫度，結果如圖4所示。

圖4 菌株1-33最適生長溫度Fig.4 The optimum growth temperature of 1-33 production strains

由圖4可知，菌株1-33的生長溫度范圍較廣，15～45 ℃都生長，30～40 ℃生長良好，最適生長溫度為37 ℃。進行不同菌株最適生長溫度的測定，是為后期實驗提供了確切實驗溫度，確保不同菌株都有較好的生長狀態，因此整個研究中，在37 ℃對菌株1-33進行培養，從而保證其生長狀態達到最佳。

2.5 菌株1-33的生長曲線

乳酸菌是通過分裂的方式進行繁殖，整個生長歷程從緩慢期開始，經過對數生長期和穩定期，然后最后走向衰亡期[19]，本研究篩選菌株1-33的生長曲線見圖5。

圖5 菌株1-33生長曲線的測定Fig.5 The grown curve of 1-33 production strains

1-33菌株在0～2 h左右為生長緩慢期，這個階段乳酸菌的數目基本保持恒定，有時甚至會減少，但是這個時期的乳酸菌菌體體積明顯增大，并且有較旺盛的代謝活動；2 h之后菌株的OD600 nm值迅速增大，即該階段菌體數目迅速增長，乳酸菌開始進入對數生長期，該時期的特征之一即菌數增長迅速，代謝活動更為活躍；在11 h左右該菌株逐漸進入穩定期，在該時期的乳酸菌的數量保持在一個動態平衡階段，OD600 nm值基本不變。生長曲線的結果可以清晰的看到不同菌株在不同培養周期內的生長狀況[20]，為后期進行酸奶制備提供一定的參考。

2.6 酸奶香氣化合物分析

對篩選菌株1-33制備的酸奶進行香氣化合物分析，共測定出22種香氣化合物。包括酮類13種，酸類4種，含硫化合物1種，芳香族化合物2種和醇類2種；傳統發酵劑發酵酸奶即空白酸奶中共檢測出19種化合物，其中酮類11種，酸類3種，含硫化合物1種，芳香族化合物2種和醇類2種，具體結果如表1所示。

表1 篩選菌株1-33發酵酸奶和空白酸奶中香氣化合物分析(n=3,X±D)Table 1 Comparison results for the volatiles in the yogurts fermented with 1-33 and traditional cultures(n=3,X±D)

注：nf為沒有找到相關數據；nd為在當前條件下該化合物低于檢測限，不能檢測到此物質；RI為揮發性化合物的保留指數(INNOWAX柱)；RIL為在NIST Chemistry WebBook里面查找的INNOWAX柱檢測出的該物質的保留指數；*為P<0.05，即1-33發酵酸奶與空白酸奶存在顯著性差異。

羰基化合物是酸奶中主要的揮發性化合物[21]，包括酮類物質和醛類物質。羰基化合物是乳酸菌在將牛奶中的乳糖分解，經過糖代謝等途徑，轉化而來[22]。雙乙酰，其因具有獨特的奶油香型而被認為是酸奶中最主要的羰基化合物之一，可賦予酸奶精致且飽滿的香氣品質，這一特性對于乙醛含量較低的酸奶十分重要[23]。通過表1可以看出，菌株1-33酸奶中的雙乙酰含量(11.13mg/L)是空白酸奶(傳統發酵劑發酵)的含量(3.36mg/L)的近4倍，顯著性差異，說明1-33具有較高的雙乙酰生產能力，可以提高酸奶獨特的奶油香味，從而提高酸奶品質。

乙醛對于酸奶整體風味具有較大的影響[24]，純品乙醛具有辛辣刺鼻的味道，但是稀釋到一定的濃度會散發愉悅的水果香，乙醛賦予酸奶青蘋果和堅果的香氣氣氛[11]。通過表1可以看出，空白發酵酸奶的乙醛含量為1.24 mg/L，菌株1-33發酵酸奶的含量為2.07 mg/L，篩選菌株1-33發酵酸奶的乙醛產量與空白發酵酸奶相當。此外，乙偶姻也是重要的羰基化合物，其本身具有淡奶油的香氣，雖然其閾值(1 mg/L)高于雙乙酰(0.2 mg/L)，但是乙偶姻的存在可以降低雙乙酰的尖銳性，使得酸奶整體風味更佳柔和、舒適[11]。由表1可知，1-33酸奶中乙偶姻的含量(38.92 mg/L)是空白酸奶中含量(25.46mg/L)的1.5 倍左右，在很大程度上改善了酸奶的整體風味，提高了酸奶風味的整體可接受性。研究表明，雙乙?？梢栽陔p乙酰還原酶的作用下可以轉化乙偶姻，所選菌株1-33除具有高產雙乙酰的能力外，還具有一定的生產乙偶姻的能力。

2-丙酮和2-丁酮也是衡量酸奶制品的重要的兩種化合物。丙酮具有甜香和果香，被認為對酸奶品質具有重要影響，酸奶中的丙酮，一部分來自牛乳，另外一部分由乳酸菌產生[25]。典型酸奶中丙酮的濃度為0.3～4.0 mg/L[24]，被研究中的空白酸奶(傳統發酵劑發酵)和篩選菌株1-33制備的酸奶中丙酮含量都在或者接近這個濃度范圍，這就說明這兩種酸奶中丙酮的含量適宜，符合酸奶的品質要求。2-丁酮的香氣類型和丙酮的類似，都具有果香[26]，研究表明，2-丁酮可以刺激酸奶香氣的釋放[27]，并且對酸奶果香氣味具有較大的貢獻。

酸類化合物對酸奶的品質具有十分重要的影響，雖然難揮發性酸對酸奶的品質影響更大，但是適量的揮發性酸，也可以改善酸奶的香氣品質。低濃度的乙酸可以賦予酸奶酸香，但是乙酸濃度過高，可能會讓酸奶具有醋的不良風味[11]。乙酸在酸奶中含量在0.5～18.8 mg/L最為適宜[28]，含量過高則會產生醋味，使酸奶整體風味不協調，也不容易被消費者接受。在上述兩種酸奶中乙酸含量均低于18.8 mg/L，因此在正常的生產過程中，所篩選菌株不會產生過多的乙酸，從而影響酸奶香氣品質。

其他類型的揮發性組分也有檢測出，但種類較少，例如含硫化合物，含氮化合物和醇類化合物等。含氮化合物一般是由蛋白質和氨基酸轉化而來，含硫化合物主要來自牛乳中的有機硫化物[29]，菌株不同其含量也有所差異。

3 結論

對西藏靈菇中高產雙乙酰的乳酸菌進行篩選，最終獲得具有較高雙乙酰生產能力的菌株1-33。對其進行生理生化和分子生物學鑒定，為植物乳桿菌。其最適生長溫度為37 ℃，發酵酸奶中雙乙酰的含量是空白酸奶(傳統發酵劑發酵)含量的3倍左右，并且其特征香氣化合物總含量和總個數均優于空白酸奶。因此，篩選的植物乳桿菌可以應用于酸奶的制備，并且具有提升酸奶中雙乙酰含量的品質，具有一定的市場前景。