添加不同表面活性劑對胞苷發酵的影響

趙貝貝，方海田*，劉慧燕，馬若霜，王茹，劉予煊，李金娜

1(寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室，寧夏 銀川，750021) 2(寧夏大學 農學院，寧夏 銀川，750021)

胞苷(cytidine)又稱胞嘧啶核苷、1-β-D-呋喃核苷胞嘧啶[1-2]，在生物體的生理生化過程中起著非常重要的作用[3-4]。以胞苷為原料的胞苷類似物作為臨床藥物應用廣泛[3]，主要用于生產抗腫瘤、抗病毒藥物的中間體，是制造阿糖胞苷(Ara-CR)、環胞苷(Cyclo C)、三磷酸胞苷(CTP)等藥物的主要原料，也可作為核苷類功能食品配料[5-8]。目前胞苷的生產方法主要是添加前體物發酵法和直接發酵法，具有成本低、周期短、產量高等優勢，近年來通過發酵法提高胞苷產量的研究逐漸增多。胞苷的發酵單位與菌體細胞膜的滲透性存在密切關系[9]。發酵過程中添加表面活性劑能提高細胞膜的通透性，減少營養物質和氧進入細胞的傳遞阻力，從而提高發酵過程中目的代謝物的產量[10-11]。LIANG等[12]研究發現添加16 g/L Tween-80改變了根癌農桿菌細胞膜的精細結構，增加了細胞膜通透性，使凝膠多糖的產量明顯提高。SHENG等[13]研究了Tween-80對普魯蘭多糖產生、細胞生長、葡萄糖基轉移酶活性和脂肪酸組成的影響，結果發現Tween-80的添加對生物量沒有影響，可顯著提高普魯蘭多糖的產量；GALINDO等[14]發現添加Triton X-100的發酵體系中溶氧量明顯高于對照，黃色素的產率提高了1.45倍。研究發現，Triton X-100可誘導提高竹紅菌素的產量且能明顯縮短了發酵時間[15-16]；溫琦等[17]添加陽離子型表面活性劑CTAB使透明質酸產量提高了20%。目前國內外有關表面活性劑對發酵產物產量影響的報道較多，但在表面活性劑對胞苷發酵影響方面的研究尚未見報道。

本文主要選擇了Tween-80、TritonX-100、十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium broxide,CTAB)和乙胺丁醇二鹽酸鹽(ethambutol dihydrochloride,EMB)4種表面活性劑作為胞苷發酵的促進劑，在搖瓶條件下研究了4種表面活性劑對細菌生長、耗糖速率和胞苷發酵單位的影響，為進一步提高胞苷發酵產量奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株：大腸桿菌EscherichiacoliBG-12為本實驗室保藏。

試劑：蛋白胨、酵母粉、NaCl、瓊脂、Tween-80、CTAB、EMB、Triton X-100等均為市售分析純。

1.2 培養基

斜面活化培養基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，瓊脂20，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

種子培養基(g/L)：蛋白胨10，(NH4)2SO42，NaCl 10，葡萄糖5，pH 7.0～7.2，115 ℃滅菌15 min。

搖瓶發酵培養基(g/L)：葡萄糖100，玉米漿40，K2HPO410，KH2PO40.5，FeSO410 mg，MnSO410 mg，MgSO4400 mg，pH 7.0～7.2，苯酚紅(0.1%)20 mL/L，115 ℃滅菌15 min，0.5% CaCO3(單獨滅菌)。

1.3 主要儀器

LRH-150-B型生化培養箱，廣東省醫療器械廠；BSD-WX2200臥式智能精密型搖床，上海博迅實業有限公司；UV-752N分光光度計，上海精科實業有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀，山東省科學院生物研究所；LC-16型島津液相色譜儀，北京島津醫療器械有限公司。

1.4 培養方法

1.4.1 菌種活化

取保藏菌種劃線接種于斜面培養基，37 ℃恒溫靜置過夜培養。

1.4.2 種子培養

從活化斜面上取一環生長狀況良好的菌種轉接到裝有50 mL種子培養基的500 mL三角瓶裝液量，9層紗布封口，置于旋轉式搖床上(200 r/min)振蕩培養12 h。

1.4.3 發酵培養

吸取5.0 mL培養好的種子發酵液至裝有45 mL發酵培養基的500 mL擋板三角瓶中，置于旋轉式搖床上，37 ℃、200 r/min振蕩培養40 h。

1.4.4 表面活性劑溶液的配制

將Tween-80配制為質量分數為10.0%的溶液待用；將TritonX-100、CTAB、EMB配制為10 mg/mL的母液，在無菌條件下，以不同添加濃度，吸取相應的表面活性劑母液于10 h時添加到發酵液中。表面活性劑的添加量如表1所示。

表1 不同種類表面活性劑的添加量Table 1 The addition of different kinds of surfactants

1.5 分析方法

1.5.1 菌體量測定方法

分別取不同發酵時間的發酵液，用蒸餾水稀釋20倍，采用752型分光光度計于600 nm處測其吸光值。

1.5.2 葡萄糖質量濃度的測定

取不同發酵時間的發酵液，稀釋發酵液到其中葡萄糖質量濃度為0～1 g/L，采用SBA-40C生物傳感分析儀測定。

1.5.3 胞苷產量測定

取不同發酵時間的發酵液13 000 r/min離心5 min，取上清液采用高效液相色譜儀測定發酵液中胞苷產量。色譜條件為：色譜柱Agilent C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)，流動相V(乙腈)∶V(水)=4∶96，流速為1.0 mL/min，檢測波長為270 nm，柱溫30 ℃，檢測器為紫外檢測器。

2 結果與討論

2.1 添加Tween-80對胞苷發酵的影響

在發酵過程中，添加不同質量濃度的Tween-80對胞苷產量、菌體生長及耗糖速度的變化進行了分析。結果如圖所示。由圖1可以看出不同質量濃度的Tween-80質量對菌體的生長影響不大。當Tween-80濃度為5 g/L時，菌株生長最快，3 g/L時生長最慢，說明較高質量濃度的Tween-80沒有抑制菌株的生長。

圖1 不同質量濃度Tween-80下的菌株生長曲線Fig.1 Growth curve of strain Tween-80 with different concentration

由圖2可以看出，菌株的耗糖速率是呈現先上升后下降的趨勢。在0～20 h由于菌株進入對數生長期，生長迅速耗糖速率不斷增加，20 h后可能由于菌株的生長不以葡萄糖為直接的營養物質，消耗葡萄糖逐漸減慢，在38 h后葡萄糖的消耗又逐漸增多，由于發酵液中其他營養物質的消耗或其他物質又轉化為葡萄糖為菌株代謝所用。對比發現不添加Tween-80的發酵液葡萄糖的消耗速率整體最快，在20 h為0.875 g/(L·h)，為添加5 g/L Tween-80的1.86倍，而添加5 g/L Tween-80的耗糖速率整體最慢，可能是高濃度的Tween-80可以促進其他營養物質的消耗，減少對葡萄糖的消耗速率?？傮w來說，Tween-80的添加可以降低菌株對葡萄糖的消耗速率。而菌體密度與耗糖速率呈現相反的變化趨勢，說明添加Tween-80菌株的生長與葡萄糖的消耗不是線性關系，在發酵液中菌株的生長不以葡萄糖為最主要的營養物質。

圖2 不同質量濃度Tween-80下的菌株耗糖速率曲線Fig.2 Curve of sugar consumption rate of strain Tween-80 with different concentration

由圖3可知，發酵40 h過程中胞苷的產量隨時間呈現逐漸增加的趨勢。在發酵20 h后胞苷產生速度加快開始大量積累，當Tween-80添加量為1～4 g/L時，都有助于胞苷的產生積累，添加量為3 g/L時，胞苷的積累遠遠大于對照組。添加量為5 g/L時，則胞苷的產量明顯低于其他實驗組。

圖3 不同質量濃度Tween-80對胞苷發酵的影響Fig.3 Effect of different concentrations of Tween-80 on cytidine fermentation

發酵40 h結束后，添加不同濃度的Tween-80的胞苷產量如圖4所示。

圖4 不同質量濃度Tween-80對胞苷發酵40 h產量的影響Fig.4 Effects of different concentrations of Tween-80 on 40 h production by cytidine fermentation

可知，適量Tween-80的添加有助于胞苷產量的提高。其中，Tween-80最適添加量為3 g/L，其產量為1.696 g/L是對照組的2.42倍，高濃度的Tween-80則抑制了胞苷的產量。另外，添加Tween-80時葡萄糖的消耗速率越快則胞苷的產量越多，因此可以用葡萄糖的消耗速率衡量胞苷產量的高低。

非離子表面活性劑Tween-80對菌體的生長影響較小，對菌體的傷害不明顯。有文獻報道添加0.1～10 g/L的表面活性劑對微生物生長的抑制作用較小[18-19]，本實驗也得到相同的結果。另外，營養培養基中存在Tween-80不影響細胞生長，Tween-80不是屎腸球菌ATCC 31749的營養物[20]，這與本實驗的結果一致。添加Tween-80可以微弱降低對葡萄糖的消耗速率，可能原因是Tween-80改變了細胞膜的通透性，從而使發酵培養基中其他營養物質的吸收增加，改變了菌株對培養基中物質的吸收分解代謝通路的變化。當Tween-80的質量濃度高于4 g/L時，胞苷的產量就會迅速降低，可能與葡萄糖的消耗速率較低和菌株本身的性質有關，在大于4 g/L濃度時不利于該菌株向合成代謝物胞苷的方向移動。

2.2 TritonX-100對胞苷發酵的影響

選擇TritonX-100的質量濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 g/L。TritonX-100對菌體生長、葡萄糖耗糖速率、胞苷產量的影響，結果如圖5～圖8所示。

由圖5可知，不同濃度TritonX-100對菌株生長有一定的影響。在適宜的濃度范圍內，TritonX-100可以促進菌株的生長。在TritonX-100質量濃度大于0.8 g/L時菌株的生長將受到抑制，且濃度越大抑制作用越強。

圖5 不同質量濃度TritonX-100下的菌株生長曲線Fig.5 Growth curve of strain TritonX-100 with different concentration

由圖5、圖6可知，不同濃度TritonX-100對菌株耗糖速率和菌體生長呈相同的變化趨勢，在一定的濃度范圍內，低濃度促進高濃度則抑制。在20 h時，各菌株的耗糖速率均達到最大，當TritonX-100為0.8 g/L，20 h的耗糖速率為0.915 g/(L·h)，為對照組的1.05倍。

圖6 不同質量濃度TritonX-100下的菌株耗糖速率曲線Fig.6 Curve of sugar consumption rate of strain TritonX-100 at different concentrations

由圖7、圖8可見，添加0.4～2.0 g/L的TritonX-100均抑制胞苷的產生。胞苷產量隨發酵時間逐漸增多，在發酵25 h后胞苷的積累速度加快。當TritonX-100添加濃度為1.6 g/L時，其胞苷產量較大，發酵40 h胞苷產量最高為0.362 g/L，是對照組的0.52倍，而該濃度的菌體生長和耗糖速率均較低，即1.6 g/L的TritonX-100對菌株的生長有影響，但對胞苷的胞外分泌量的抑制作用最弱。

圖7 不同質量濃度TritonX-100對胞苷發酵的影響Fig.7 Effect of different concentrations of TritonX-100 on cytidine fermentation

圖8 不同質量濃度TritonX-100對胞苷發酵40 h產量的影響Fig.8 Effects of different concentrations of TritonX-100 on 40 h production by cytidine fermentation

TritonX-100的添加對菌體的生長有一定的影響，呈現低濃度促進高濃度抑制的現象。低質量濃度(小于1.2 g/L)的TritonX-100促進菌體的生長，當TritonX-100質量濃度在0.8 g/L時，菌體生長最快，明顯優于對照組。TritonX-100的添加對菌株葡萄糖的耗糖速率和菌體生長呈現一致的變化趨勢，說明添加TritonX-100使菌株的生長主要依賴于葡萄糖。當添加TritonX-100的質量濃度為0.8 g/L時，菌體生長和耗糖速率均較低，而胞苷產量比其他添加組較高，說明添加TritonX-100對產物胞苷的積累有影響，使胞苷的合成不以葡萄糖為主要的營養物質。

2.3 添加CTAB對胞苷發酵的影響

在發酵培養基中添加質量濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 mg/L的CTAB，考察其對菌體生長、葡萄糖耗糖速率、胞苷產量的影響，結果如圖9～圖12所示。

由圖9、圖10可知，CTAB在0.4～2 mg/L時，對菌株的生長和耗糖速率影響不大，且在該濃度范圍內，菌株的生長和耗糖速率呈相同的變化趨勢。

圖9 不同質量濃度CTAB下的菌株生長曲線Fig.9 Growth curve of strain CTAB with different concentration

圖10 不同質量濃度CTAB下的菌株耗糖速率曲線Fig.10 Curve of sugar consumption rate of strain CTAB with different concentration

由圖11、圖12可知，添加0.4～2 mg/L的CTAB，與對照組相比，均抑制了胞苷的產生。在該濃度范圍內菌株生長和耗糖速率均與對照組相差不大，而胞苷產量明顯減少，說明添加CTAB不利于胞苷的積累。有研究也表明添加各種表面活性劑對微生物的毒性不同，一般來說陽離子表面活性劑對生物的毒性較大[21]。本試驗也證明添加CTAB對大腸桿菌BG-12的生長和耗糖速率影響不大，但對發酵產胞苷是不利的。

圖11 不同質量濃度CTAB對胞苷發酵的影響Fig.11 Effect of different concentrations of CTAB on cytidine fermentation

圖12 不同濃度CTAB對胞苷發酵40 h產量的影響Fig.12 Effects of different concentrations of CTAB on 40 hour production by cytidine fermentation

由圖11和圖12可知，添加CTAB的質量濃度在0.4～2 mg/L，對菌體的生長、葡萄糖消耗速率影響不大且均有一定的促進作用，說明添加CTAB時，菌株的生長主要依賴于葡萄糖的消耗。隨著添加CTAB的質量濃度的增加，胞苷的發酵抑制加強幾乎停止。一般來說，陽離子表面活性劑對生物的毒性較大[21-22]。實驗結果表明，添加質量濃度0.4～2 mg/L的CTAB對大腸桿菌BG-12的生長速率、葡萄糖的耗糖速率影響不大，但對代謝產物胞苷的積累產生明顯的抑制作用。

2.4 添加EMB對胞苷發酵的影響

在發酵培養基中添加質量濃度分別為5、10、15、20和25 mg/L的EMB，考察其對菌體生長、葡萄糖耗糖速率、胞苷產量的影響，結果如圖13～圖16所示。

由圖13、圖14可知，添加EMB質量濃度為5～25 mg/L，對菌株生長和耗糖速率影響不大。

圖13 不同質量濃度EMB下的菌株生長曲線Fig.13 Growth curve of strain EMB with different concentration

圖14 不同質量濃度EMB下的菌株耗糖速率曲線Fig.14 Curve of sugar consumption rate of strain EMB with different concentration

由圖15、圖16可以看出，添加EMB均抑制了胞苷的產量。說明添加EMB對胞苷產量的積累是有害的。

圖15 不同質量濃度EMB對胞苷發酵的影響Fig.15 Effect of different concentrations of EMB on cytidine fermentation

圖16 不同濃度EMB對胞苷發酵40 h產量的影響Fig.16 Effects of different concentrations of EMB on 40 hour production by cytidine fermentation

在發酵培養基中分別加入不同質量濃度的EMB，大腸桿菌BG-12發酵產胞苷均較空白試驗有不同程度的抑制作用；從菌體生長曲線、葡萄糖的耗糖速率可以看出，加入一定質量濃度的EMB對菌株生長和耗糖影響不大，菌體的生長還是主要依賴于葡萄糖的消耗。

綜合比較認為，添加Tween-80的效果較好，可將胞苷產量最多提高2.42倍。

2.5 表面活性劑對胞苷產量的影響

利用SPSS分析軟件對添加不同種類和含量的4種表面活性劑的胞苷產量進行方差分析，結果見表2。

表2 添加不同種類表面活性劑對胞苷產量的組統計量Table 2 Group statistics of cytidine production with different surfactants

從表2可以看出，Tween-80、CTAB和EMB的P值均小于0.05，表示有統計學差異，說明添加不同濃度的表面活性劑可以影響菌株BG-12的胞苷產量，有效影響菌株BG-12胞苷的生物合成量，為添加表面活性劑對胞苷合成奠定了基礎。

3 結論

非離子表面活性劑Tween-80可在一定添加量范圍內有利于胞苷發酵單位的提高。Tween-80添加量在1～5 g/L時，對菌體的生長影響不大；對葡萄糖的耗糖速率均有所下降，發酵20 h時耗糖速率均達到最大，且添加量為5 g/L時耗糖速率僅為對照組的0.54倍；添加量在1～4 g/L時，均有促進胞苷發酵單位的提高，其中，Tween-80最適添加量在3 g/L，發酵40 h時其產量為1.696 g/L，是對照組的2.42倍。

TritonX-100對菌株生長和耗糖速率均有一定的影響，當添加量大于0.8 g/L會抑制菌株的生長和耗糖速率，濃度越大抑制作用越強，在20 h時，添加2.0 g/L TritonX-100，耗糖速率僅為對照組的0.59倍；當TritonX-100添加質量濃度為1.6 g/L時，胞苷產量為0.362 g/L，是對照組的0.52倍。添加0.4～2 mg/L 質量濃度的CTAB和5～25 mg/L的EMB，對菌株生長和耗糖速率影響不大，在該質量濃度范圍內均抑制胞苷的積累，可見CTAB和EMB對胞苷發酵是不利的。

不同類型的表面活性劑性質不同，對微生物的生長及代謝產物的積累亦不同。非離子表面活性劑Tween-80對菌體生長的影響較弱，但對胞苷的積累有較大的影響，當添加3 g/L發酵40 h時其產量達到最大?？赡茉蚴翘砑颖砻婊钚詣㏕ween-80可以增加細胞膜的通透性，減少氧及營養物質進入細胞的傳遞阻力，改善發酵體系的供氧能力。非離子表面活性劑TritonX-100，該菌種對其比較敏感，加入劑量在0.4～2 g/L均抑制胞苷的積累。對于添加表面活性劑TritonX-100、CTAB和EMB均抑制胞苷的積累，可能是由于在加入表面活性劑后，在菌體表面進行了沉積和結合，改變了細胞的通透性降低氧傳遞，從而減弱發酵體系的供氧能力同時增加了代謝產物的副反饋作用，使代謝產物胞苷的積累大大減少。綜合分析造成以上結果的原因可能在于，不同的表面活性劑，因其不同的結構和化學性質，當其干擾大腸桿菌BG-12細胞膜合成，造成細胞膜滲漏、缺失等效果，會產生不同的影響效果。本實驗研究表明，添加適合濃度的表面活性劑對于胞苷發酵單位的提高有一定的促進作用，但是濃度過高時產量將受到抑制，這可能是表面活性劑濃度過高，對菌體造成傷害，導致代謝產物的產量下降。本試驗中在最適的添加濃度下，Tween-80添加后胞苷產量提高2.42倍，且Tween-80對菌體的生長影響不大，表現出添加Tween-80優于TritonX-100。Tween-80、TritonX-100同屬非離子型表面活性劑也因其結構、性質和濃度的不同，而影響大腸桿菌BG-12的發酵代謝，其中Tween-80表現出高濃度抑制、低濃度促進的現象。在發酵液中添加Tween-80，減少胞苷在細胞內的沉積，從而促進胞苷發酵單位的提高。