五糧液大曲中的酚類成分及其抗氧化活性

姚燦，周韓玲，龔宇，廖勤儉，吳林蔚，李楊華，楊濤，安明哲，李國友*

1(中國科學院成都生物研究所，四川 成都，610041) 2(宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓，644007) 3(成都中醫藥大學，四川 成都，611137) 4(中國科學院大學，北京，100049)

白酒是我國一類重要的傳統發酵食品。早在9 000 年前，中華民族的祖先就開始了白酒釀造，在距今 2 000 多年的西漢時期，便開始蒸餾酒的生產[1]。無疑，白酒是幾千年來中華民族勞動人民智慧的結晶。作為世界六大蒸餾酒之一，中國白酒歷史底蘊豐厚，深受人們喜愛，白酒文化已經滲透到生活的各個方面。我國已經成為世界上最大的蒸餾酒生產和消費國家。白酒的釀造技術從古沿用至今，經過一代一代的傳承與創新，已經在世界釀造發展史上獨樹一幟。用曲釀酒是中國白酒釀造的特殊工藝，這也是與其他蒸餾酒區別的地方。作為有“酒之骨”之稱的酒曲，是我們民族的寶貴遺產[2-3]，它是以豌豆、小麥等為原料，經過粉碎、加水后加以培養，以獲得利于發酵的微生物菌系和酶系[4]。酒曲是白酒釀造過程中不可或缺的一部分，在釀酒原料中占到20%左右，不僅具有糖化、發酵、生香、呈味的作用，而且直接影響到成品白酒的品質與產酒率[5]。

近年來，隨著國民經濟水平提高和消費意識的改變，闡明白酒中的健康活性成分，開發新型健康白酒成為了白酒發展的重要趨勢。白酒生產采用特殊的固態蒸餾工藝，導致一些高沸點的活性分子在共沸、蒸汽夾帶等作用下轉移到白酒產品中。目前，科研工作者利用現代分析技術和手段已經從白酒產品中發現了氨基酸、多肽等高沸點天然活性成分[6-8]。大曲是白酒生產的重要原料，大曲中的活性成分是白酒活性成分的重要來源。研究和闡明大曲中的天然活性分子，可為白酒釀造工藝的改進和創新，生產富含健康活性成分的白酒產品奠定基礎。我們既往對釀酒大曲中的化學成分進行系統研究工作，已在洋河大曲中發現核苷等活性化合物[9]。

五糧液是中國名酒之一，為濃香型白酒的典型代表，其香味悠久，入口甘綿，各味諧調，以精良的釀酒工藝和卓越的成酒品質聞名于世。五糧液釀酒大曲對五糧液白酒產品質量的貢獻是不言而喻的。目前，關于五糧液大曲的研究主要集中于微生物菌群的鑒別[10]和香味物質的分析[11-12]，而對大曲高沸點難揮發化學成分的系統研究尚未開展?；诖?，本實驗以五糧液大曲作為研究對象，利用正相硅膠柱、凝膠色譜、高效液相色譜等方法對大曲的乙醇提取物化學成分進行分離純化，首次發現五糧液釀酒大曲中含有生理活性廣泛、安全可靠的阿魏酸類抗氧化活性成分，這為從白酒產品發現健康活性成分提供了科學基礎，有利于推動中國白酒的健康發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薄層層析硅膠(254 nm)、柱層析硅膠(100～200目、200～300目)，青島海洋化工廠；反相硅膠，蘇州納微生物科技有限公司；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20，GE Healthcare Bio-Sciences AB；甲醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚(工業級)，重蒸后使用；乙醇(分析純)，成都科隆化學品有限公司；過硫酸鉀，上海麥克林生化科技有限公司；Tris-HCl，北京索萊寶科技有限公司；DPPH粉末、ABTS粉末，杭州聯科生物技術股份有限公司；大曲，四川宜賓五糧液酒廠。

1.2 儀器與設備

BrukerAvance 400 MHz核磁共振儀(TMS為內標)、BrukerDaltonics BioTOF-Q質譜儀，瑞士Bruker公司；LC-100高效液相色譜儀，上海伍豐科學儀器有限公司；Spectra Max M5多功能讀數儀，美谷分子儀器有限公司；BSZ-100自動部分收集儀，蘇州江東精密儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取與分離

稱取30 kg大曲，粉碎后加入90 L的甲醇浸泡提取，每次5 d，共提取2次(如圖1所示)。提取液過濾后合并，經旋蒸儀減壓濃縮獲得總浸膏420 g。將總浸膏加入5 L蒸餾水，于60 ℃分散均勻，然后置于分液漏斗中，依次用石油醚(5 L)、乙酸乙酯(5 L)和正丁醇(5 L)萃取、每種溶劑萃取3次，分別將萃取液合并減壓濃縮，獲得石油醚浸膏(199 g)、乙酸乙酯浸膏(100 g)和正丁醇浸膏(90 g)。

圖1 大曲中酚類活性物質分離流程Fig.1 Isolation of phenolic compounds from Daqu

將石油醚浸膏(199 g)與等重量的硅膠(200～300目)拌和均勻，然后通過中壓柱層析進行初步色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯(體積比為1∶0,20∶1,10∶1,5∶1,2∶1,1∶1,0∶1)梯度洗脫，分段收集。經薄層層析色譜(thin layer chromatography,TLC)分析，合并得到P1-Q11共18個組分(P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、Q-1、Q-2、Q-3、Q-4、Q-5、Q-6、Q-7、Q-8、Q-9、Q-10、Q-11)。其中Q-2段經TCL分析在254 nm下有紫外吸收，將該段過葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱層析，以氯仿-甲醇體系(1∶1,體積比)洗脫，以自動部分收集儀收集樣品，經TLC分析合并得到2個主點，該部分樣品在氯仿：甲醇體系中重結晶，得到化合物1、2和3的混合物(圖2)。

將乙酸乙酯浸膏(100 g)與硅膠拌和均勻后，進行正相硅膠柱層析，以氯仿-甲醇為流動相(1∶0,50∶1,30∶1,10∶1,5∶1,2∶1,1∶1，0∶1,體積比)梯度洗脫，經TLC分析后合并為28個小段，分別編號EA-1～EA28。其中EA-5經TCL分析在254 nm下有紫外吸收，將該段過葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱，流動相為氯仿-甲醇(1∶1)，由自動部分收集儀分段收集樣品，TLC分析合并后得到化合物4、5和6(圖2)。

圖2 五糧液大曲分離的化合物(1～6)結構Fig.2 Structure of the compounds(1-6) from Daqu

1.3.2 抗氧化活性測試

本實驗對化合物(1-3)和(4-6)的DPPH·、ABTS+·和O2·的清除能力進行了測定[13]，以評價它們的抗氧化活性。

1.3.2.1 DPPH實驗

精密稱取DPPH粉末58.9 mg，以乙醇溶解并定容至100 mL，置-20 ℃保存備用。使用時將此液以乙醇稀釋20倍，即配即用。將290 μL DPPH溶液加入已置于96孔板的10 μL樣品液中，室溫下避光反應30 min后，在517 nm處以多功能讀數儀測定反應液的吸收值。

1.3.2.2 ABTS實驗

精密稱取ABTS粉末96.2 mg和過硫酸鉀16.5 mg，以水溶解并定容至25 mL，避光反應16 h后轉置4 ℃保存備用。使用時取此液350 μL以80%乙醇稀釋至25 mL，即配即用。將250 μL ABTS溶液加入已置于96孔板的10 μL樣品液中，室溫下避光反應5 min后，即在734 nm處以多功能讀數儀測定反應液的吸收值。

1.3.2.3 超氧陰離子自由基清除實驗

以16 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)分別配制150 μmol/L NBT、234 μmol/L NADH和30 μmol/L PMS溶液，置于冰箱4 ℃保存備用。使用時往已置于96孔板的10 μL樣品液中依次加入NBT溶液100 μL， NADH溶液100 μL和PMS溶液100 μL。室溫下反應5 min后，即在560 nm處以多功能讀數儀測定反應液的吸收值。

2 結果與分析

2.1 結構鑒定

化合物1、2和3為白色粉末，以混合物的形式分離得到。分析其1H NMR譜圖可以發現，在高場區域δH0.89處有一個呈三重峰的甲基信號，δH1.28處有多個重疊的亞甲基信號，δH2.49處有一個呈三重峰的亞甲基信號，上述信號表示該化合物中含有一個飽和的脂肪長鏈。在低場區域，位于δH6.19(1H,t,J=2.2 Hz,H-2)和6.26(2H,d,J=2.2 Hz,H-4)的信號表明，該化合物中含有一個對稱三取代苯基。進一步分析13C NMR譜圖可以發現，在高場區域δC35.97、31.21、29.85(多個碳信號重疊)、29.81、29.74、 29.67、29.44、29.52、22.85和14.28的信號屬于典型的飽和脂肪長鏈信號，同時低場區域的δC156.7、100.24、108.17和146.32 的信號確定該化合物含有羥基對稱取代的苯基。分析質譜可以發現，該化合物的質譜中含有3個準分子離子峰m/z377.16 [M+H]+、405.19 [M+H]+和433.24 [M+H]+，且3個準分子離子峰之間依次相差28，即2個CH2的分子質量數。仔細分析1H NMR長鏈的末端甲基信號也可以確定其為混合物。通過與文獻中報道的核磁數據[14]對比，最后將該化合物鑒定為5-正十九烷基雷鎖辛(1,5-n-nonadecylresorcinol)、5-正二十一烷基雷鎖辛(2,5-n-heneicosyresorcinol)和5-正二十三烷基雷鎖辛(3,5-n-tricosylresorcinol)。其理化數據如下：m/z377.16 [M+H]+,405.19 [M+H]+,433.24 [M+H]+;1H-NMR(400 MHz,CDCl3): δH6.26(2H,d,J=2.2 Hz,H-4),6.19(1H,t,J=2.2 Hz,H-2),4.90(2H,brs,OH),2.49(2H,t,J=7.3 Hz,H-1′),1.28(overlapped),0.89(3H,t,J=6.8 Hz,CH3)；13C-NMR(100 MHz,CDCl3): δC156.7(C-1,3),100.24(C-2),108.17(C-4,6),146.32(C-5),35.97(C-1′),31.21(C-2′),29.85(C-3′～C-18′),29.81(C-19′),29.74(C-20′),29.67(C-21′),29.44(C-22′),29.52(C-23′),22.85(C-24′),14.28(C-25′)。

化合物4、5和6結構極為相似，常規色譜技術難以分離純化，以混合物形式分離得到，為黃色油狀。分析1H-NMR可以發現，在低場區域具有兩組明顯的ABX體系取代的苯環[δH7.03(1H,d,J=1.8 Hz,H-2),7.07(1H,dd,J=8.3,1.8,H-6)和6.90(1H,d,J=8.3 Hz,H-5); 7.72(1H,d,J=1.8 Hz),7.11(1H,dd,J=8.3,1.8,H-6′)和6.88(1H,d,J=8.3 Hz,H-5′)]。另外，在低場區域還含有一對反式雙鍵[δH6.29,7.61(1H,d,J=15.7 Hz,H-8,H-7)]和一對順式雙鍵氫信號[5.81,6.78(1H,d,J=13.0 Hz,H-8′,H-7′)]，在δH3.92和3.91分別含有一個甲氧基信號。上述信號提示該化合物中含有一個順式和一個反式的阿魏?；?。另外，由δH4.14和4.17(各2H,t,J=6.6 Hz)、以及δH1.25的多個CH2重疊的氫信號，可以推出該化合物含有一個長鏈的二醇單元。同時，由13C NMR譜圖低場區域的18個碳信號和高場區域的長鏈飽和脂肪二醇信號，可以進一步確定該化合物含有兩個阿魏?；烷L鏈脂肪二醇結構單元。進一步的質譜分析可以發現，在其質譜中存在3個分子離子峰m/z547.39 [M+H]+、575.43 [M+H]+和603.46 [M+H]+，表明該混合物由3個化合物組成，分子質量依次相差28，即相差2個CH2。最后通過與文獻[15]比對，確定其結構分別為(1E,22Z)-1,22-diferuloyloxydocoane(4)，(1E,24Z)-1,24-diferuloyloxyteracosane(5)和(1E,22Z)-1,26-diferuloyloxyhexacosane(6)。其理化數據如下：1H-NMR(400 MHz,CDCl3) δ：1.25(38H,brs),4.14,4.17(2H， t,J=6.6 Hz),3.92(6H,s,OMe-3、OMe-3′),5.84(2H,s,OH-4和OH-4′),5.81,6.78(1H,d,J=13.0 Hz,H-8′,H-7′),6.29,7.61(1H,d,J=15.7 Hz,H-8,H-7),6.88,6.90(1H,d,J=8.3 Hz,H-5,H-5′),7.03,7.72(1H,d,J=1.8 Hz,H-2,H-2′),7.07,7.11(1H,dd,J=8.3,1.8 Hz,H-6,H-6′);13C NMR(CDCl3,100 MHz) δ：29.9,29.5(n-CH2),65.1(O-CH2),56.62,56.10(OMe-3,OMe-3′),109.5(C-2),113.0(C-2′),113.9(C-5),114.9(C-5′),116.5(C-8),117.8(C- 8′),123.18(C-6),125.68(C-6′),128.3(C-1),128.1(C-1′),143.2(C-7),144.5(C-7′),146.1(C-3),146.9(C-3′),147.1(C-4),148.0(C-4′),166.2(C-9),166.9(C-9′)。

2.2 抗氧化活性

在濃度為25.0 μmol/L時，化合物(1-3)的混合物對DPPH·的清除率為(32.2±0.4)%，對O2·的清除率為(36.3±0.5)%，對ABTS+·的清除能力為(8.6±0.2)%。在濃度為25.0 μmol/L時，化合物(4-6)的混合物對DPPH·的清除率是(62.3±0.5)%， 對O2·清除的清除率為(54.2±0.6)%，對ABTS+·的清除能力為(18.1±0.2)%。陽性對照為維生素Vc，在濃度5.0 μmol/L，其對DPPH·清除率為(48.6±0.5)%，對O2·清除率為(87.6±0.3)%，對ABTS+·的清除率為(18.3±0.6)%，如圖3所示。

圖3 化合物(1-3),( 4-6)的混合物分別對3種自由基的清除率Fig.3 The free radical scavenging rates and the superoxide anion radical scavenging rates of mixtures(1-3) and(4-6)

多酚類物質具有多種生物功能，對人體健康有益，且其中大部分具有減少或清除自由基的能力?；钚詫嶒灡砻?，在DPPH·及ABTS+·清除實驗中，化合物(4-6)的混合物對自由基的清除率大于或等于Vc；在O2·清除實驗中，也有較強的清除自由基的能力?；衔?4-6)為相差(CH2)2的同系物，含有一個順式和反式阿魏?；?，天然產物中有不少的化合物含有阿魏?；哂休^好的生物活性，如中藥姜黃的有效成分“雙阿魏?；淄椤?，其對乳腺癌細胞株(MCF-7)有抑制作用[16]；阿魏酸乙酯具有抑制由二磷酸腺苷(ADP)誘導的血小板聚集的作用[17]；另外，一些阿魏酸衍生物也具有抗氧化、抗腫瘤及增強免疫功能等活性[18]。同時，化合物1-3的混合物也具有良好的自由基清除能力，但其抗氧化活性比化合物4-6偏低。HOU等[19]的研究中表明，化合物分子中羥基的位置與其自由基清除活性有關，并且清除能力大小受多種因素影響。

3 結論

本次實驗以濃香型白酒五糧液的大曲為研究對象，利用色譜分離技術對大曲中的多酚類化學成分進行了分離和鑒定，確定了6個阿魏酸類小分子化合物。根據結構特征，可以分為兩類，其中化合物(1-3)為間二苯酚烷基雷鎖辛化合物，化合物(4-6)為對稱的阿魏酸飽和脂肪二酯?；衔?1-3)主要存在于高等植物中，以小麥、黑麥、玉米等禾本科糧食作物的種子主，在微生物、藻類、動物的次級代謝產物中也有少量分布。該類化合物具有十分廣泛的生物活性，如抗氧化、降血脂、抗菌、抗腫瘤等。由此可見，化合物(1-3)是一類十分安全而具有廣泛活性的重要天然產物?；衔?4)和(5)僅在藤黃科植物木竹子(Garciniamultiflora)以混合物的形式發現，未研究其活性[20]。經過SciFinder數據庫查詢檢索，化合物(6)的結構尚未見到報道，為新化合物。本論文首次在大曲中發現它們的存在，活性研究表明，化合物(4-6)具有較顯著的抗氧化活性。本研究為中國白酒中尋找和發現健康活性成份奠定了一定的基礎，也為中國白酒的發展和創新指出了一個新的方向。