黑米蛋白的功能與結構性質

高柳，向琴，李佳釔，劉娟，陳嬋，車振明，劉平

(西華大學 食品與生物工程學院，四川 成都，610039)

黑米又稱紫米，是一種食用大米，在我國大約有兩千年的種植歷史。黑米屬于糯米的一種，由于其表皮是黑色的，所以稱作黑米[1]。我國很多地方都有種植，具有代表性的有陜西黑米、貴州黑糯米、湖南黑米等。與普通大米相比，黑米含有特殊成分為VC、葉綠素、花青素、胡蘿卜素及強心甙，熬制的米粥清香油亮，軟糯適口，營養豐富，具有很好的滋補作用，因此被稱為“補血米”、“長壽米”等。由于其富含營養成分，因此，深受消費者喜愛。

目前，國內外黑米的研究大多數是對其花色苷、黃酮等生物活性等方面[2-3]，據報道，黑米中，蛋白質、脂肪、碳水化合物，以及鈣、鉀等含量較高，與普通大米相比，黑米中蛋白質含量大約在11.3%～15.2%[4]。關于黑米蛋白的研究鮮有報道，僅姜珊珊等[5]通過傳統“堿提酸沉”法提取出黑米的蛋白質，經優化得出最佳的傳統提取條件，但黑米蛋白的功能性質及結構表征卻未見報道。本研究以黑米為原料，采用“堿提酸沉”法提取黑米蛋白，同時以大豆分離蛋白作為對照，對黑米蛋白的功能與結構性質進行研究，為黑米蛋白的綜合利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黑米，購于成都世紀百盛超市；大豆分離蛋白，山東禹王實業有限公司；大豆油，中糧福臨門食品營銷有限公司；蛋白標品，Takara公司。

三(羥甲基)胺基甲烷、十二烷基硫酸鈉(SDS)、丙烯酰胺、過硫酸氨、N,N,N′,N′-四甲基乙二氨，北京索萊寶生物科技有限公司；NaOH、H2SO4、KBr、K2SO4、CuSO4、石油醚、考馬斯亮藍R-250，成都市科隆化學品有限公司。

1.2 試驗儀器

LyoLab 3000凍干機，Heto公司；SpectraMaxi3x多功能酶標儀，美谷分子儀器(上海)有限公司；SOX406自動粗脂肪測定儀、K1100自動凱氏定氮儀，濟南海能儀器有限公司；PA6-GF 30均質乳化機，上海恒川機械設備有限公司；Zetasizer Nano ZS 90馬爾文激光粒度儀，英國馬爾文儀器公司；MOS-450/AF-CD圓二色譜儀，法國Biologic公司；Nicolet 6700傅立葉變換紅外光譜儀，賽默飛世爾科技公司；DTG-60差熱熱重同步分析儀，島津儀器有限公司；DYY-8C電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑米蛋白提取工藝

黑米蛋白提取工藝：

1.3.2 黑米蛋白含量的基本成分

蛋白含量的測定：GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》；水含量的測定：GB 5009.3—2016 《食品中水分的測定》；灰分含量的測定：GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》；脂肪含量的測定：GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》。

1.3.3 溶解性的測定

將等量樣品溶于等量蒸餾水中，1 mol/L HCl溶液或1 mol/L NaOH溶液調節pH為 2.0～7.0 之后磁力攪拌30 min，靜置離心，并在280 nm下測上清液蛋白質含量[6]。溶解度公式如式(1)：

(1)

1.3.4 乳化性和乳化穩定性的測定

取4 mL大豆油和12 mL蛋白質溶液在10 000 r/min下高速均質1 min。從均質樣品底部取20 μL溶液加入5 mL 1 g/L的SDS溶液混勻，在500 nm處測吸光值。30 min后繼續取樣進行測定，計算乳化穩定性[7]。由以下公式計算乳化性(EAI)和乳化穩定性(ESI)，分別為公式(2)和(3)：

(2)

(3)

式中：A0，0 min時測得稀釋后的乳化液吸光度；At，tmin時測得稀釋后的乳化液吸光度；N=100，稀釋因子；C，原始蛋白質質量濃度，g/mL；θ=0.25，形成乳液的油的體積分數；L=1 cm，光程。

1.3.5 粒徑測定

配制1 mg/mL蛋白溶液，采用馬爾文納米粒度儀對溶液的平均粒徑進行測定。在室溫條件下重復測定12次。

1.3.6 持水性和持油性的測定

將0.5 g樣品分散在20 mL蒸餾水中，并在不同溫度下以300 r/min攪拌1 h。之后，將分散體4 000 r/min離心15 min。稱重沉淀物，計算重量的差異。結果表示為每克樣品吸收的水的克數[8]。

將0.5 g樣品加入到10 mL大豆油中并在旋渦混合器中混合30 s，并在不同溫度下以300 r/min攪拌1 h。之后，將分散體4 000 r/min離心15 min。稱重沉淀物，計算重量的差異。結果表示為每克樣品吸收的水的克數。

1.3.7 起泡性和起泡穩定性的測定

取20 mL質量分數1%的蛋白溶液，以10 000 r/min的速度均質2 min。將均質后的樣品迅速轉移到一個刻度量筒中。在均質化之后0和30 min讀取總體積[9]。由公式(4)和公式(5)計算起泡性和起泡穩定性。

(4)

(5)

式中：V0，原始體積，mL；V1，泡沫體積，mL；V2，液體體積，mL；V3，30 min后泡沫體積，mL。

1.3.8 圓二色光譜的測定

在25 ℃條件下，采用圓二色光譜儀在180～260 nm 掃描。比色池為0.1 cm，光譜帶寬為1 nm，分辨率為0.2 nm，響應時間為0.25 s，掃描速率為10 nm/min。

1.3.9 紅外光譜的測定

取少量樣品與KBr晶體按質量比約1∶100進行研磨，用傅里葉紅外光譜儀進行紅外光譜測定，測定波段為4 000～400 cm-1，掃描次數為32次。

1.3.10 熱穩定性的測定

稱取3.0 mg待測樣品至鋁盒中，加入10 μL蒸餾水，封閉鋁盒充平衡5 min。應用DTG差熱熱重同步分析儀測樣品，測試全過程在氮氣條件下進行，掃描速率為10 ℃/min，掃描區間為20～150 ℃[10]。

1.3.11 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

SDS-PAGE根據LAEMMLI[11]的方法制備的不連續緩沖液體系，本試驗采用12%的分離膠和5%的濃縮膠。電泳結束后凝膠用0.1%考馬斯亮藍R-250染色2 h，用脫色液脫色至背景清晰。

1.3.12 統計分析

所有試驗均重復3次，數據為3次重復的平均值，并用Origin 9.1 作圖。

2 結果與分析

2.1 黑米蛋白的基本組成成分

由表1可得，黑米蛋白的蛋白質含量為(89.41±0.23)%，大豆分離蛋白質含量為(91.93±0.46)%，參照大豆分離蛋白粉GB/T 22493—2008，各項指標均在規定范圍內。

表1 黑米蛋白和大豆分離蛋白基本組成成分 單位：%(質量分數)Table 1 Proximate chemical composition of black rice protein isolate and soy protein isolate

黑米蛋白呈黑紫色，粉狀，無結塊，無異味。

2.2 溶解性分析

溶解性能準確評價出蛋白質的內部結構發生變性和聚集程度，同時是蛋白質的最重要的物理、化學和功能性質之一[12]。因此本試驗比較了大豆分離蛋白和黑米蛋白2種蛋白質的溶解能力，結果如圖1所示。

圖1 大豆分離蛋白與黑米蛋白溶解性Fig.1 The solubility diagram of soy protein isolate and black rice protein isolate

由圖1可以看出，在不同pH下的大豆分離蛋白與黑米蛋白溶解趨勢比較一致，先下降后上升。大豆分離蛋白與黑米蛋白的溶解度在pH 4.0時均達到最低，等電點即為蛋白質溶解度最小的pH值，因此黑米蛋白等電點為pH 4.0，這與大多數植物蛋白相似，如黑木耳蛋白[13]、檸條蛋白[14]等。當pH ≥ 4.0時，遠離蛋白質等電點時，蛋白分子表面可能會增加一部分電荷，導致在靜電斥力作用下與蛋白離子水合作用增強，因此溶解度上升[15]。

2.3 乳化性和乳化穩定性分析

蛋白質是表面活性物質，也是兩性物質，可通過改變pH改變表面帶電情況，也可通過降低溶液界面表面張力使水和油發生乳化。圖2和圖3分別表示大豆分離蛋白和黑米蛋白的乳化性和乳化穩定性在不同pH下的趨勢。

圖2 大豆分離蛋白與黑米蛋白乳化性Fig.2 Emulsifying property of soy protein isolate and black rice protein isolate

由圖2和圖3可以看出，在pH 4接近等電點時，大豆分離蛋白與黑米蛋白均表現出乳化性最弱，分別是37.18 m2/g和35.85 m2/g，但出現乳化穩定性最高，這種現象與熊家艷等[16]對黔江腎豆蛋白質研究結果相似，這可能是pH接近蛋白質的等電點時，蛋白質分子表面正負電荷的含量基本相等，相互抵消為0，分子作用力降到最低，乳化粒子相互碰撞發生絮凝和聚集，出現乳化能力最弱的現象[17]。乳化穩定性變高可能某些類型的多糖可以通過增加系統的黏度來幫助穩定乳液[18]。

圖3 大豆分離蛋白與黑米蛋白乳化穩定性Fig.3 Emulsifying stability of soy protein isolate and black rice protein isolate

2.4 持水性和持油性分析

不同溫度對分離蛋白持水性的影響如圖4所示。

圖4 大豆分離蛋白與黑米蛋白的持水性Fig.4 Water holding capacity of soy protein isolate and black rice protein isolate

根據納米粒度儀測試結果得，黑米蛋白的平均粒徑為289.4 nm，大豆分離蛋白的平均粒徑為472.2 nm。在20～60 ℃，黑米蛋白和大豆分離蛋白的持水率隨溫度變化，出現持水性先升高后降低，這與李露敏等[19]對樟樹籽仁蛋白持水性研究結果相似，這可能是從低溫到高溫的過程中，蛋白內部結構遭到一定程度的改變或者破壞導致其伸展性增大，加強了水分子與蛋白分子相互作用，因此出現蛋白質吸水性增大的現象。但隨著溫度繼續升高，蛋白表面吸水性下降，可能是由于高溫下加劇水解程度，減弱了蛋白分子的氫鍵和離子基團的水合作用，形成聚集作用[20]。由圖4可以看出，在30 ℃時，大豆分離蛋白與黑米蛋白持水率均達到最大，分別為541.32%和163.63%，由此表明，黑米蛋白的持水性低于大豆分離蛋白，可能是大豆分離蛋白的平均粒徑大于黑米蛋白，持水性更強。

圖5顯示，在20～60 ℃，大豆分離蛋白與黑米蛋白的持油性先升高后降低，在30 ℃時持油性達到最大，分別為105.52%和143.51%，原因可能是在低溫下，油脂流動性較低，容易被蛋白質分子截留，持油性增大。在30 ℃以后，隨著溫度升高，蛋白質內部構象結構發生改變，暴露更多的極性鍵，結合油脂的能力降低，油脂結合能力也達到飽和，持油性下降。在整個溫度范圍內，黑米蛋白持油性顯著高于大豆分離蛋白，可能與蛋白質含量、蛋白質類型和蛋白質的氨基酸組成有關，特別是與脂肪分子中與烴鏈相互作用的疏水性殘基[21]。

圖5 大豆分離蛋白與黑米蛋白的持油性Fig.5 Oil holding capacity of soy protein isolate and black rice protein isolate

2.5 起泡性與起泡穩定性分析

起泡性及起泡穩定性是蛋白質的功能性質之一。蛋白質結構的兩親性是具有良好表面性質(包括乳化和起泡)的蛋白質的先決條件。

大豆分離蛋白與黑米蛋白在不同pH值下的起泡性如圖6所示，在pH 2～10，大豆分離蛋白與黑米蛋白的起泡性均有最大值與最小值。

圖6 大豆分離蛋白與黑米蛋白起泡性Fig.6 Foaming property of soy protein isolate and black rice protein isolate

在pH 4等電點時，2種蛋白質的起泡性均達到最低，分別為23.53%和5.88%。黑米蛋白質的起泡性在pH 2時達到最高，而大豆分離蛋白在pH 10時達到最大，分別為38.24%和52.94%。蛋白質的起泡性差異可能是由于它們不同的構象特征[22]。

此外，蛋白質起泡后30 min得到其起泡穩定性。由圖7可以看出，黑米蛋白起泡穩定性先降低后升高，而大豆分離蛋白是先升高后降低。但在整個pH 4～10，大豆分離蛋白的起泡穩定性均顯著高于黑米蛋白，且比較穩定。這可能是由于蛋白質-蛋白質相互作用，在接近等電點的pH 4時也有起泡能力，這與蛋白質最小溶解度有較好的相關性。隨著pH升高，黑米蛋白起泡穩定性逐漸增大，可能是蛋白質分子間作用增強，提高黏度性，因而出現良好的起泡穩定性[23]。

圖7 大豆分離蛋白與黑米蛋白起泡穩定性Fig.7 Foaming stability of soy protein isolate and black rice protein isolate

2.6 二級結構分析

蛋白質的二級結構是多肽鏈骨架中局部肽段的構象，圓二色光譜(CD)以廣泛應用于研究蛋白質分子構象。由圖8可以看出，黑米蛋白在191 nm處有一正峰，在207 nm出有一負峰。通過CD-Pro軟件計算結果可知，黑米蛋白中α-螺旋含量為5.15%，β-折疊含量為40.65%，β-轉角含量為21.70%，無規則卷曲含量為32.40%。其中β-折疊含量最高，α-螺旋含量最低。

圖8 黑米蛋白的CD圖譜Fig.8 Far-UV CD spectrum of the black rice protein isolate

2.7 特征性官能團分析

黑米蛋白的紅外光譜圖譜如圖9所示，蛋白質在4 000～400 cm-1有多處吸收峰。其中，波數在3 291.95 cm-1處出現的寬峰是H—O鍵伸縮振動引起的典型吸收峰，1 645.01 cm-1處的吸收峰是蛋白質伯酰胺中R—CO—NH2中—C=O—伸縮振動產生的，1 517.73 cm-1處吸收峰是蛋白質伯胺基團中的—NH面內彎曲振動產生的，1 390.44 cm-1處較弱的吸收峰蛋白質中游離的COO—對稱伸縮振動產生的[24]。

圖9 黑米蛋白紅外光譜Fig.9 Infrared spectrum of the black rice protein isolate

2.8 熱穩定性分析

差示掃描量熱法(DSC)是一種熱分析法，它能夠提供蛋白熱變性有關的信號，如蛋白質空間構發生相變。本試驗研究黑米蛋白對熱的穩定性，得出其變性溫度。

黑米蛋白DCS曲線如圖10所示，在80～100 ℃由于黑米蛋白產生熱變性，出現了明顯的吸熱峰，吸熱峰產生溫度的變性溫度為87.35 ℃，變性溫度與大豆分離蛋白[25]接近。出現變性的原因是黑米蛋白加熱，其高級結構發生改變，吸收能量。

圖10 黑米蛋白的熱穩定性Fig.10 Heating stability of black rice protein isolate

2.9 SDS-PAGE分析

圖11為黑米蛋白的染色圖，由圖11可以看出，黑米蛋白的組成較復雜，主要含有5個條帶，分別是11、19、33、51和115 kDa。表明黑米蛋白的組成中，小分子含量較多。另外，由圖11也可以看出有部分蛋白質分子質量在200 kDa以上，這與姜珊珊[5]對黑米蛋白分子質量研究結果基本一致，但在分子質量115 kDa時有較大差別，可能是黑米原產地的不同。

圖11 黑米蛋白的SDS-PAGEFig.11 SDS-PAGE of black rice protein isolate

3 結論