免泡豆桿腐敗菌復配抑菌劑的優化及其保鮮效果

唐桂宇，唐怡淋，代博仁，蔣愛玲，張志清，申光輝

(四川農業大學 食品學院，四川 雅安，625014)

豆桿，又稱豆筋，豆棒，是川渝地區具有地方特色的非發酵豆制品。傳統豆桿制品烹調前需浸泡4 h以上，食用不便。免泡豆桿是將傳統豆桿制品進行預浸泡復水后，真空包裝制備的新型豆制品，節約了消費者浸泡復水消耗的時間，深受消費者喜愛，消費市場潛力大。然而免泡豆桿中營養物質豐富，水分含量高，極易發生微生物腐敗變質，尤其是殘留的耐熱性極強的芽孢細菌[1-2]。目前生產中主要采用傳統熱殺菌處理，不僅難以徹底殺滅耐熱細菌，同時強度過高的殺菌條件導致褐變、彈性下降等產品劣變現象，消費者接受度大大降低。因此，采用單一的熱殺菌方式難以保障免泡豆桿良好品質和較長貨架期。

使用廣譜高效、低毒、天然的防腐劑來延長非發酵豆制品貨架期，是近年來的研究熱點之一[3]。乳酸鏈球菌素(Nisin)是一種高效、穩定、安全的天然防腐劑，可抑制大多數革蘭氏陽性細菌，并對芽孢桿菌的芽孢有強烈的抑制作用[4]。ε-聚賴氨酸能抑制細菌、真菌和耐熱芽孢桿菌[5]，具有安全高效，耐高溫的優點。山梨酸及其鉀鹽，能夠抑制食品中脫氫酶活力，阻止脂肪酸氧化和脫氫，可有效抑制食品中細菌生長繁殖，且易被人體代謝分解，是目前使用廣泛的一種安全、高效的防腐劑[6]。

本課題組從腐敗免泡豆桿中分離獲得了4株優勢腐敗菌，均屬于耐熱性較強、蛋白酶分泌能力較強的芽孢桿菌屬[7]。為抑制腐敗菌生長繁殖導致豆桿腐敗變質，本實驗選取乳酸鏈球菌素(Nisin)、ε-聚賴氨酸和山梨酸鉀為抑菌劑，以最低抑菌濃度結合抑菌率指標，評價其對優勢腐敗菌的抑菌能力，并采用響應面法進行復配抑菌劑優化，并考察比較復合抑菌劑在不同應用方式與條件下的保鮮效果，以期為延長免泡豆桿貨架期，維持良好品質提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆桿：四川山古坊食品有限公司提供。

腐敗菌：解淀粉芽孢桿菌DY1a、DY1b，枯草芽孢桿菌DY2a、DY3，保存于四川農業大學食品學院。

抑菌劑：山梨酸鉀，購自成都市科龍化工試劑廠；乳酸鏈球菌素、ε -聚賴氨酸，購自鄭州博研生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-50 SI立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SW-CJ-2FD潔凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；GZ-150-M霉菌培養箱，韶關市廣智科技設備有限公司；QL-901渦旋振蕩器，其林貝爾儀器制造公司；ZWY-211B恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；PHS-3C酸度計，上海佑科儀器儀表有限公司；Varioskan Flash全波長多功能酶標儀，美國賽默飛世爾科技公司；DZ400-2C真空包裝機，上海青葩包裝機械有限公司；TA.XTPlus物性分析儀，英國SMS公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

將腐敗菌接種于LB液體培養基中，37 ℃，200 r/min 振蕩培養12 h，調整菌懸液細胞數量至106CFU/mL。

1.3.2 最低抑菌濃度(MIC)的測定

采用二倍稀釋法，抑菌劑用無菌水溶解配制并用LB液體培養基稀釋至不同質量濃度：Nisin 12.5～400 μg/mL，ε-聚賴氨酸12.5～400 μg/mL，山梨酸鉀100～3 200 μg/mL，添加100 μL至96孔板，再加入100 μL腐敗菌菌懸液，37 ℃培養24 h后用酶標儀測定OD600，將培養前后OD600無顯著性變化的防腐劑濃度確定為最低抑菌濃度，各處理重復3次。

1.3.3 抑菌劑對腐敗菌DY3抑菌率的測定

根據MIC實驗結果，并參考GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》[8]中的相關規定確定3種防腐劑的最大使用限量及適宜范圍，以最難抑制的枯草芽孢桿菌DY3為指示菌，按1.3.2方法在96孔板中培養并測定OD600。未添加抑菌劑作為空白組。按公式(1)計算抑菌率[9]：

(1)

Nisin質量濃度為5、10、15、20、25、30 μg/mL，并添加50 μg/mLε-聚賴氨酸和400 μg/mL山梨酸鉀。ε-聚賴氨酸質量濃度為20、30、40、50、60、70 μg/mL，并添加20 μg/mL Nisin和400 μg/mL山梨酸鉀。山梨酸鉀質量濃度為250、300、350、400、450、500 μg/mL，并添加20 μg/mL Nisin和50 μg/mLε-聚賴氨酸。

1.3.4 響應面法優化復配抑菌劑配比及驗證

根據抑菌率實驗結果，進行3因素3水平Box-Behnken響應面設計，實驗因素及水平見表1。根據響應面法優化結果，配制復配抑菌劑，測定其24 h的抑菌率，驗證復配抑菌劑的抑制效果。

表1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface experiments

1.3.5 復配抑菌劑對免泡豆桿的防腐保鮮效果評價

(1)樣品的制備與處理

為考察復配抑菌劑的添加方式及與熱殺菌配合使用效果，設計6組不同實驗處理：對照組：豆桿復水后真空包裝貯藏；熱殺菌組：豆桿復水，真空包裝，100 ℃水浴殺菌20 min后冷卻貯藏；抑菌劑添加組：向復水豆桿中直接添加復配抑菌劑，真空包裝貯藏；抑菌劑復水組：將豆桿浸沒于復配抑菌劑水溶液復水4 h，真空包裝貯藏；抑菌劑添加+熱殺菌組：向復水豆桿中直接添加復配抑菌劑，真空包裝，100 ℃殺菌20 min冷卻貯藏；抑菌劑復水+熱殺菌組：將豆桿浸沒于復配抑菌劑水溶液復水4 h，真空包裝，100 ℃殺菌20 min冷卻貯藏。以上各組處理的復水溫度為20～23 ℃，復水時間4 h后，包裝規格為80 g/袋，貯藏溫度25 ℃。

(2)樣品感官評價

參考鄭麗君等[7]建立的感官評價方法，由10人組成的感官評價小組從色澤、氣味、質地方面對實驗豆桿樣品進行感官評價。

(3)揮發性鹽基氮(TVB-N)測定

按照GB 5009. 228—2016《食品安全國家標準食品中揮發性鹽基氮的測定》[10]測定。

(4)芽孢桿菌數量測定

稱取25.0 g樣品，無菌條件下充分研磨后轉入加有225 mL質量分數0.85%無菌生理鹽水的錐形瓶，200 r/min振蕩30 min，靜置5 min，用質量分數0.85%無菌生理鹽水10倍梯度稀釋，選擇3個適宜稀釋梯度，各取1 mL稀釋液，采用傾注法，利用錳鹽營養瓊脂選擇性培養基，37 ℃培養48 h對樣品中的芽孢桿菌進行平板計數。

(5)pH值測定

稱取25.0 g樣品，充分研磨后轉入裝有225 mL蒸餾水的錐形瓶，200 r/min振蕩30 min，靜置10 min后過濾，用pH計測定濾液，每個條件測量3次，測量結果取平均值。

(6)質構測定

將樣品切割成2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm，參考鄭麗君等[2]方法并做修正。測定條件：TPA模式，P/5平底柱形探頭，測前速度2.0 mm/s，測試速度1.0 mm/s，測后速度5.0 mm/s，2次下壓停留間隔時間5 s。選取中心位置進行測定樣品硬度、彈性、咀嚼性參數[11]，每組樣品重復5次。

1.4 數據處理

實驗數據采用SPSS 20.0軟件進行顯著性檢驗與Duncan多重比較分析，Design-Expert 10.0.7.0進行響應面法數據分析，Origin 9.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 三種抑菌劑MIC測定結果

由表2可知，不同抑菌劑對4株優勢腐敗細菌的MIC值差異較大。ε-聚賴氨酸和Nisin的抑菌能力整體強于山梨酸鉀。不同受試腐敗菌對山梨酸鉀和Nisin的敏感度不同，其中DY1b和DY3對山梨酸鉀的敏感度較弱，MIC值高于其他2株腐敗菌；DY3對ε-聚賴氨酸的敏感度最弱，MIC為400 μg/mL。不同腐敗菌對抑菌劑敏感度可能與菌株遺傳特性有關。

表2 不同防腐劑對各優勢腐敗菌的MIC值Table 2 MIC value of different preservatives for each dominant spoilage organism

2.2 不同濃度抑菌劑對腐敗菌DY3抑菌率

由圖1可知，Nisin、ε-聚賴氨酸和山梨酸鉀對枯草芽孢桿菌DY3的抑菌率均隨添加濃度的增大而提高。

圖1 不同濃度抑菌劑對枯草芽孢桿菌DY3的抑制效果Fig.1 The inhibition effect of different concentrations of bacteriostatic agents on Bacillus subtilis DY3注：不同小寫字母表示不同濃度抑菌劑抑菌率有顯著性差異(P<0.05)。

根據GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》[8]和其附錄A.2中規定同一功能的食品添加劑(包括防腐劑)在混合使用時，各自用量占其最大使用量的比例之和不應超過1，根據圖1結果，綜合考慮響應面優化實驗的因素水平：Nisin：17.5、20、22.5 μg/mL；ε-聚賴氨酸：50、55、60 μg/mL；山梨酸鉀：375、400、425 μg/mL。

2.3 復配抑菌劑響應面法優化結果及驗證

響應面設計與結果見表3。利用Design-Expert 10.0.7.0軟件對表3中的試驗數據進行多元回歸擬合，獲得以抑菌率(Y)為響應值的回歸方程：

Y=88.311 99+6.123 75A+1.106 25B+3.002 50C+0.552 49AB-0.325 00AC+1.645 00BC-2.699 75A2-3.254 75B2+1.812 75C2

表3 響應面試驗結果Table 3 The experiment result of response surface

表4 響應面實驗方差分析Table 4 The variance analysis of response surface

根據回歸方程求得抑菌率極大值對應的因素水平，獲得3種防腐劑的最佳復配比例為：Nisin 22.50 μg/mL、ε-聚賴氨酸57.54 μg/mL、山梨酸鉀425.00 μg/mL。相比于單一防腐劑對枯草芽孢桿菌DY3的抑菌質量濃度：Nisin 200 μg/mL、ε-聚賴氨酸400 μg/mL、山梨酸鉀1 600 μg/mL，復配抑菌劑各防腐劑用量顯著減少，且根據最佳配比條件做3次重復驗證實驗，最后得到實際平均抑菌率為(94.22±0.35)%，抑菌效果十分明顯。最佳復配比例抑菌劑對枯草芽孢桿菌DY3的抑菌率的理論值為97.06%，實際值與理論值基本上吻合，所得到抑菌劑配比比較準確可靠。

2.4 復配防腐保鮮劑應用效果評價

2.4.1 真空免泡豆桿貯藏期間感官評價結果

由圖2可知，各組樣品貯藏過程中感官評分逐漸下降，經過100 ℃ 20 min熱殺菌處理的3組樣品感官評分整體上均高于未熱殺菌處理的3組樣品。貯藏至第10天，未進行熱殺菌處理的3組樣品感官評分均降低至臨界值以下，其中對照組樣品評分降低至30分，嚴重腐敗變臭，感官無法接受，單獨使用抑菌劑的兩組樣品評分略高于對照組，但也出現較嚴重的腐敗現象，僅熱殺菌處理組樣品感官評分雖然高于單獨使用抑菌劑的兩組樣品，但其貨架期只能保持6 d，抑菌劑復配結合熱殺菌處理的2組樣品感官評分均高于其他處理組，分值均>75分，處于感官臨界值以上，屬于可接受食用范圍。結果表明，抑菌劑結合熱殺菌能夠較好延長產品貨架期，維持較好的產品感官品質。

圖2 不同處理條件免泡豆桿貯藏期間感官評價Fig.2 Sensory evaluation changes of dougan under different treatment conditions during storage at 25 ℃

2.4.2 揮發性鹽基氮(TVB-N)值

揮發性鹽基氮(TVB-N)是腐敗微生物降解蛋白質的重要產物，是評價高蛋白食品新鮮程度的重要指標[12]，其值越高則表明樣品蛋白質降解腐敗程度越高。由圖3可知，各組樣品貯藏期TVB-N值均呈上升趨勢。貯藏至第10天，對照組樣品TVB-N值最高，為12.32 mg/100 g，其次是熱殺菌組樣品，添加有復配抑菌劑的4組均顯著低于未加抑菌劑的2個對照組；抑菌劑結合100 ℃ 20 min熱殺菌處理的2組樣品TVB-N值低于其他各組，其中豆桿復水后添加抑菌劑，再熱殺菌處理的樣品TVB-N最低，為6.86 mg/100 g，遠低于24.00 mg/100 g[13]。結果表明復配抑菌劑可有效抑制樣品TVB-N的增加，延長樣品的貨架期，并且復配抑菌劑與熱殺菌結合處理的抑制效果更顯著。

圖3 不同處理條件免泡豆桿貯藏期間TVB-N值變化Fig.3 Total viable basic nitrogen values of dougan under different treatment conditions during storage at 25 ℃注：不同小寫字母表示同一貯藏時間不同處理樣品TVB-N值有顯著性差異(P<0.05)。

2.4.3 真空免泡豆桿貯藏期間芽孢桿菌數變化

由圖4可知，未熱殺菌處理的3組樣品芽孢桿菌總數貯藏期整體呈上升趨勢，且芽孢桿菌數量均高于經熱殺菌處理的3組樣品，主要是由于熱殺菌處理殺死部分非耐熱的細菌菌體，延緩了芽孢桿菌的增殖。第0天時，未經熱殺菌的3組樣品貯藏初期芽孢桿菌數為6.99 lgCFU/g，貯藏第0～4天過程中芽孢桿菌數明顯增加，而第4天后由于免泡豆桿中營養物質被消耗減少，生物胺等腐敗代謝產物積累，芽孢桿菌數量增加較緩慢[14]，結果表明，樣品僅添加復配抑菌劑而不經熱殺菌處理對芽孢桿菌增殖抑制效果并不明顯，這與離體條件下的抑菌效果存在較大差距，可能原因是無論采取復水后添加還是使用抑菌劑溶液復水，包裝袋內的復配抑菌劑并未均勻擴散分布于豆桿內部組織，同時豆桿樣品中的芽孢桿菌可能由于生物被膜的保護作用，導致抑菌劑的實際抑菌效果并不明顯。復配抑菌劑結合100 ℃ 20 min殺菌的2個處理組樣品貯藏第4天以前的芽孢桿菌總數顯著低于其他各組，表明抑菌劑結合熱殺菌對樣品中芽孢桿菌抑菌效果最好；其中抑菌劑復水結合熱殺菌的抑菌效果要好于抑菌劑添加結合熱殺菌處理組，可能是由于樣品在復配抑菌劑溶液中復水，提高了抑菌劑組分在豆桿組織中滲透分布均一性，使抑菌效果明顯增強，這與王敏等[15]研究蜂膠用于非發酵豆制品保鮮的條件優化及對菌落數的影響研究結果影響一致。而貯藏后期，熱殺菌處理的3組樣品芽孢桿菌總數無顯著性差異，逐漸趨于相同。

圖4 不同處理條件免泡豆桿貯藏期間芽孢桿菌數變化Fig.4 Total Bacillus number change of dougan under different treatment conditions during storage at 25 ℃注：不同小寫字母表示同一貯藏時間不同處理樣品芽孢桿菌數有顯著性差異(P<0.05)。

2.4.4 真空免泡豆桿貯藏期間pH變化

pH是評判豆制品品質高低的指標之一。由圖5可知，貯藏期各組樣品因腐敗菌繁殖而產酸[16]，導致pH值均呈下降趨勢，抑菌劑結合熱殺菌對pH下降有顯著抑制作用，其中采用抑菌劑溶液復水結合熱殺菌處理的抑制效果最好。各組樣品第6天均出現上升，可能是腐敗菌利用樣品中的碳水化合物產酸量減少而分解蛋白質的產胺量增多有關。

圖5 不同處理條件免泡豆桿貯藏期間pH值變化Fig.5 The pH value change of dougan under different treatment conditions during storage at 25 ℃注：不同小寫字母表示同一貯藏時間不同處理樣品pH值有顯著性差異(P<0.05)。

2.4.5 真空免泡豆桿貯藏期間質構變化

質構特性作為食品重要的物理特性，是評判產品質量的重要依據[17]。由圖6和圖7可知，隨著貯藏時間的增加，樣品硬度和咀嚼性均呈上升趨勢，這與貯藏期間樣品受到化學和微生物作用，導致蛋白質分子內部化學鍵和作用力破壞，凝膠網狀結構中的水分釋放，促使水分向更自由的那部分水分轉化[18]，樣品失水而導致硬度和咀嚼性增加有關。抑菌劑結合熱殺菌處理顯著延緩樣品硬度和咀嚼性的增加，有利于維持相對較好的品質特性。

圖6 不同處理條件免泡豆桿貯藏期間硬度變化Fig.6 The hardness change of dougan under different treatment conditions during storage at 25 ℃注：不同小寫字母表示同一貯藏時間不同處理樣品硬度有顯著性差異(P<0.05)。

圖7 不同處理條件免泡豆桿貯藏期間咀嚼性變化Fig.7 The chewiness change of dougan under different treatment conditions during storage at 25 ℃注：不同小寫字母表示同一貯藏時間不同處理樣品咀嚼性有顯著性差異(P<0.05)。

由圖8可知，對照組樣品貯藏期彈性逐漸降低，抑菌劑結合熱殺菌處理樣品彈性沒有降低，反而具有一定的增強趨勢，表明抑菌劑結合熱殺菌處理可保持并改善樣品彈性品質。

圖8 不同處理條件免泡豆桿貯藏期間彈性變化Fig.8 The springiness change of dougan under different treatment conditions during storage at 25 ℃注：不同小寫字母表示同一貯藏時間不同處理樣品彈性有顯著性差異(P<0.05)。

綜上，熱殺菌處理可一定程度上起到良好的保鮮效果，復配抑菌劑結合+熱殺菌處理樣品大部分指標(包括感官整體評分、微生物數量、TVB-N、彈性、咀嚼性)均優于單獨熱殺菌處理，表明復配抑菌劑與熱殺菌處理相結合，可提高免泡豆桿常規熱殺菌處理的保鮮效果。

3 結論

Nisin和ε-聚賴氨酸對腐敗菌的抑菌性能強于山梨酸鉀，枯草芽孢桿菌DY3對ε-聚賴氨酸的敏感度弱與其他腐敗菌株，MIC值高于其他腐敗菌株。復配抑菌劑得到最佳配比為：Nisin 22.50 μg/mL、ε-聚賴氨酸57.54 μg/mL、山梨酸鉀425.00 μg/mL，對枯草芽孢桿菌DY3的抑菌率為(94.22±0.35)%。

采用復配抑菌劑溶液復水，并結合100 ℃ 20 min熱殺菌對免泡豆桿的抑菌保鮮效果最好。該方法處理可有效抑制樣品中芽孢桿菌生長繁殖，延緩樣品酸化和揮發性鹽基氮的生成，較對照樣品貨架期延長4 d，并在6 d內維持免泡豆桿的良好的感官和質構品質，可為免泡豆桿工業生產抑菌保鮮提供技術參考。