生物胺降解菌在醬油中的應用

程淑敏，藍翔，徐瑩，汪東風，馬冉冉

(中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島，266001)

生物胺是一種存在于蛋白質含量豐富的發酵食品中的一類含氮有機化合物，如發酵香腸、干酪、咸魚、魚露、醬油等[1]。適量的生物胺對細胞發揮正常的生理功能非常重要，其中有些是激素、生物堿、核酸或蛋白質合成的前體[2]，有些生物胺對細胞的生長和分化以及基因調節有重要作用[3]。但是，當生物胺在人體內積累到較高的數量時就會出現一些諸如頭痛、惡心等中毒癥狀，嚴重時會危及生命[4]。醬油是我國傳統的發酵食品，原料中的蛋白質在微生物的催化下水解成氨基酸等成分，造成了醬油獨特的風味口感。但是因為發酵周期長、微生物群落復雜等特點，發酵過程中不可避免地會生成有害物質，其中生物胺就是一類[5]。近幾年對市售醬油的生物胺調查顯示：成品醬油中普遍存在著8種生物胺，其中許多醬油的總生物胺含量已經超過1 000 mg/kg[6-7]。而醬油是我國使用最廣泛的調味品，因此降低醬油中的生物胺具有重要的意義。

實驗室前期篩出了2株生物胺降解菌Wickerhamomycesanomalus和Millerozymafarinosa，在培養基中對8種生物胺具有較好的降解效果，本文欲初步探究這2株菌在醬油的發酵環境中的降解效果以及對醬油品質的影響。探究在復雜環境中生物胺降解菌的降解效果，能為該菌株在食品中的擴大應用提供理論基礎。

1 材料與設備

1.1 材料

本實驗分離并保藏的2株生物胺降解菌(以下簡稱降胺菌)：W.anomalus(J2)、M.farinosa(J3)。實驗所用的醬油醪來自某釀造公司。

1.2 試劑

YPD培養基[8]、生物胺產生鑒別培養基[9](g/L)：胰蛋白胨5，酵母浸膏5，牛肉膏5，NaCl 2.5，葡萄糖0.5，Tween 80 1，MgSO40.2，MnSO40.05，FeSO40.04， 檸檬酸銨 2，硫胺素 0.01，K2HPO42，CaCO30.1，磷酸吡哆醛 0.05，前體氨基酸 0.1，溴甲酚紫 0.06，瓊脂20，調節pH=5.3。前體氨基酸、丹磺酰氯均購自Sigma公司；甲醇、乙腈為色譜純；脯氨酸、三乙胺、異硫氰酸苯酯、正己烷、DNS等為國產分析純。

1.3 儀器及設備

Kjeltec 2300型自動凱氏定氮儀，FOSS分析儀器公司；ZDJ-4A型自動電位滴定儀，海儀分科學儀器有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；YGC-12型氮吹儀，鄭州寶晶電子科技有限公司；HHBLL600-S型電熱恒溫培養箱，上海躍進醫療器械；PHSJ-3F型酸度計，上海雷磁儀器廠；Agilent 1100型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；PHSJ-3F型數字pH計，上海精密科學儀器有限公司等。

2 試驗方法

2.1 發酵劑的準備

將4 ℃斜面保藏的降胺菌經斜面活化24 h后在28 ℃下液態培養基培養菌株24 h；再以2%的接種量接種于含有3% NaCl的培養基中，培養24 h；置于4 ℃下4 000 r/min冷凍離心10 min，用無菌生理鹽水洗滌1次再離心，收集菌體并適量稀釋，運用血球計數法計數，菌懸液的接種濃度為106CFU/g，菌懸液保存于4 ℃的冰箱，當天使用。

2.2 樣品采集

未發酵的醬油醪由某釀造公司提供。取樣200 mL于無菌瓶內，-20 ℃冷藏待實驗。將2.1制備的降胺菌菌懸液加入發酵罐內，空白組加入等量的無菌生理鹽水，每組3個平行。分別混合均勻，8層紗布封口，在28 ℃下發酵90 d。每次取樣時混合均勻，其余時靜置發酵，在0、5、10、20、40、60、90 d時取樣分析。

2.3 pH、TVB-N、氨基酸態氮的測定

pH的測定：使用數字pH計測定。揮發性鹽基氮(TVB-N)的測定[10]：將1 mL樣品定容到100 mL，取10 mL在蒸餾瓶中，加入10 mL 1%的氧化酶懸浮液(1 g MgO溶于100 mL蒸餾水)，上機測定，結果以mg/100 mL表示[11]。氨基酸態氮測定：采用甲醛滴定法進行測定[12]。

2.4 生物量的測定

樣品處理：取1.0 mL樣品，加入到含9.0 mL滅菌蛋白胨鹽溶液(0.1%蛋白胨，0.85% NaCl)的無菌試管中，混合均勻，10倍梯度稀釋，分別移取0.1 mL涂布相應平板，按照以下條件培養?？偤醚跷⑸铮篜CA培養基平板，28 ℃培養24 h。生物胺產生菌：生物胺產生菌鑒別培養基，28 ℃培養24 h?？偤醚蹙嫈邓芯?，生物胺產生菌計數紫色菌落。選擇菌落數范圍為30～300個的平板進行計數，按照稀釋倍數進行換算，結果以lg CFU/mL表示。

2.5 生物胺的測定

采用高效液相色譜，丹磺酰氯柱前衍生法測定[13]。

2.6 游離氨基酸的測定

游離氨基酸的測定采用的是高效液相PITC柱前衍生法[14]。量取 200 μL氨基酸混合標準溶液(0.002 5 mol/L)，置于1.5 mL塑料離心管中，加入100 μL 1 mol/L三乙胺乙腈溶液和 100 μL 0.1 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液，混勻，室溫反應1 h，然后加入正己烷400 μL，旋緊蓋子后劇烈振蕩 5～10 s，靜置分層，取 200 μL下層溶液與 800 μL水混合，0.22 μm針式過濾器過濾，待分析。樣品的衍生方法與標準品相同。高效相液相色譜(HPLC)的分析條件：色譜柱為C18分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫40 ℃；流動相A: 0.1 mol/L乙酸鈉溶液(pH值為6.50±0.05)∶乙腈=93∶7(體積比)；流動相B∶V(水)∶V(乙腈)=20∶80；流速：1.0 mL/min：進樣量：20 μL。樣品的梯度洗脫程序參考文獻[2]。

2.7 數據處理與統計分析

實驗結果表示為平均值±標準偏差。數據統計分析采用SPSS 20.0 軟件進行ANOVA差異顯著性分析，P<0.05為顯著性差異。繪圖使用Microsoft office Excel 2007 軟件。

3 結果與討論

3.1 降胺菌對高鹽稀態醬油發酵過程中生物胺的影響

在發酵過程中不同時期的生物胺含量變化如圖1，在發酵的10 d內，生物胺含量緩慢上升，空白組與實驗組在色胺、腐胺、組胺、酪胺含量之間沒有明顯差別，苯乙胺的空白組實驗含量低于實驗組，尸胺、酪胺、亞精胺、精胺的空白組含量高于實驗組。這一階段生物胺的總量變化不明顯，這可能是因為在發酵的初期，生物胺降解菌在環境中并沒有發揮作用，主要菌群仍然是醬油發酵菌群。在發酵40～90 d時，空白組與實驗組的8種生物胺含量出現了顯著性差異。由圖可看出J2在組胺、酪胺、亞精胺的降解方面優于J3。結合總生物胺含量的變化可知：降解效果J2優于J3。

3.2 對發酵過程pH的影響

降胺菌對醬油發酵過程中pH的影響如圖2所示?？瞻捉M與實驗組的pH隨著發酵時間的延長均不斷降低。在發酵的前10 d三組的pH差異不大。在發酵的前20 d pH下降較快，原因是在發酵的初始階段產酸微生物比較活躍，這些產酸的微生物代謝較多的乳酸及其他酸類物質，有機酸類物質在此階段生成速率增加，產酸較多，所以pH下降較快。在20 d之后，pH下降緩慢，pH從高到低依次為J3>J2>K,是因為在20 d之后的發酵時間里，生成的氨基酸等物質會有少量轉化成堿性的揮發性鹽基氮類物質，使得pH下降緩慢[15]。

a-色胺tryptamine(TRY);b-苯乙胺β-phenylethylamine(PHE);c-腐胺putrescine(PUT);d-尸胺cadaverine(CAD);e-組胺histamine(HIS);f-酪胺tyramine(TYR);g-亞精胺spermidine(SPD);h-精胺spermine(SPM)圖1 不同實驗組高鹽稀態醬油發酵過程中生物胺的變化Fig.1 Changes of biogenic amines during fermentation of high-salt and dilute soy sauce in different experimental groups注：K-空白對照組；J2，J3-實驗組。下同。

圖2 不同實驗組菌株高鹽稀態醬油發酵過程中pH值的變化Fig.2 Changes of pH levels of high salted diluted state fermentation soy sauces in different groups

醬油中的酸味主要來源于有機酸，當pH為4.6～4.8時，被認為適度的酸度能增加醬油風味，產生爽口的感覺。經過40 d發酵的醬油pH值為(4.5±0.3)。和傳統醬油pH(4.6～4.8)基本一致[16]。此外，影響pH變化的原因還有原料水解成含有羰基端的多肽，微生物細胞自溶，游離脂肪酸的積累等，如乳酸菌生長可利用葡萄糖和檸檬酸以及部分氨基酸產生乳酸及乙酸從而降低了pH值[17]。

3.3 對醬油發酵過程中TVB-N的影響

醬油發酵過程中TVB-N的變化如圖3所示。TVB-N是衡量水產品和水產制品腐敗變質程度的質量控制指標，主要包括腐敗微生物生成的氨、三甲胺等含氮揮發性鹽基氮化合物[18]。由圖可看出空白組和實驗組的的TVB-N在發酵的前20 d上升較快，在20～40 d增加變緩，在發酵后期基本維持穩定。這是因為醬油曲的細菌和酶使得蛋白質分解產生胺基氨類堿性含氮物質，也可能是因為在發酵前期，腐敗微生物未被有效抑制，導致了TVB-N含量快速升高[19]。

圖3 菌株對高鹽稀態醬油發酵過程中TVB-N的影響Fig.3 Effect of bacteria on TVB-N during fermentation of high salt and dilute soy sauce

3.4 對醬油發酵過程中氨基酸態氮的影響

醬油中氨基酸態氮含量的多少，是衡量醬油品質重要指標之一[20]。本文采用甲醛滴定法，檢測氨基酸態氮含量隨著發酵時間的變化，結果如圖4所示，在發酵前20 d，氨基酸態氮增長率較快，含量很快高于0.4 g/100 mL，之后趨于平緩，在第60天左右時達到峰值。J2和J3的氨基酸態氮含量明顯高于對照組，且2株降胺菌處理大致相同。氨基酸態氮在一定程度上反映了氨基酸的含量。在發酵前期，發酵液中的蛋白質降解成小分子的氨基酸，在發酵中后期，小分子的氨基酸發生復雜的生化反應，生成各種生香成分。此外，氨基酸態氮變化趨勢與總生物胺含量的變化趨勢也基本一致，且達到峰值的時間稍早于生物胺達到峰值的時間。當醬油發酵體系中含有大量前體氨基酸時，可以產生氨基酸脫羧酶的微生物就會在適宜條件下將氨基酸轉化為相應的生物胺。因此，發酵過程中氨基酸態氮含量變化與生物胺的含量具有一定相關性。

圖4 降胺菌對高鹽稀態醬油發酵過程中氨基酸態氮含量的影響Fig.4 Changes of AAN levels of high salted diluted state fermentation soy sauces in different strains groups

3.5 對高鹽稀態醬油發酵過程中游離氨基酸的影響

表1及表5所示的是發酵90 d內氨基酸含量的變化及營養成分分析。由表1可知隨著發酵時間的延長，不同種類氨基酸的含量都在逐漸增加，氨基酸總量在不同時期也有明顯的增加，氨基酸總量在發酵0 d時為14.46 mg/mL，在發酵10 d時為31 mg/mL，在40 d 時氨基酸總量為45 mg/mL，在90 d時為55 mg/mL。

醬油中必需氨基酸占總氨基酸的比值常用來評判醬油的營養價值[21]。該比例越接近40%，則該醬油的營養價值越高[22]。由表可知，發酵過程中的醬油營養價值在可接受范圍內，沒有因為加入生物胺降解菌而降低醬油的營養價值。

表2是醬油中呈味氨基酸占總氨基酸百分比含量。發酵醬油的滋味也是評判醬油好壞的標準之一，不同發酵階段醬油中氨基酸種類及數量上的差別使它們滋味產生差別[23]。在檢測出的18種氨基酸中，鮮味氨基酸對醬油的品質影響最大，由表3可知，鮮味氨基酸在5～10 d增加較快，在40 d后增長變慢，最終含量穩定在11%左右。

表1 J2對發酵醬油中游離氨基酸組成的變化Table 1 Changes of free amino acid composition in fermentation soy sauces with J2 starter

注：Total為氨基酸總量、E為必需氨基酸、N為非必需氨基酸；*代表必需氨基酸。

表2 醬油中呈味氨基酸占總氨基酸百分比含量 單位：%Table 2 The percentage of the taste amino acid in soy sauce

另外，兩種發酵鮮味的對比中發現接種J2的醬油鮮味效果優于J3。和空白株對比發現，2株菌的添加對鮮味產生了一定程度的抑制。甜味類氨基酸含量隨著發酵時間的變化產生了20%左右的變化。芳香族類氨基酸在發酵過程中沒有出現明顯的變化。但是與空白組對照，兩株菌的芳香族類氨基酸所占比重減小，可見2株菌影響了醬油的芳香風味。從風味氨基酸的總量來看，未完全發酵完成的醬油中風味物質變化不大，至于對最終風味的影響，還需進一步研究和關注。

表3是醬油中必需氨基酸的含量與WHO/FAO標準模式的比較。表格計算了8種必需氨基酸在總氨基酸中的比例，并將數據與WHO/FAO規定的醬油中氨基酸的推薦值比對。通過分析可知：除了Tyr在比重偏低，其他的7種氨基酸均達到了推薦值，從營養價值，接種生物胺降解菌發揮了較好的作用。

表3 醬油中必需氨基酸的含量與WHO/FAO標準模式的比較 單位：%Table 3 The comparison between EAA in soy sauce and the WHO/FAO standard mode

3.6 對醬油發酵過程中總好氧微生物的影響

醬油發酵過程中總好氧微生物數的變化見表4，空白組與實驗組的微生物數都是在發酵初期數量有所上升，發酵中后期有所下降的趨勢。在保溫發酵的前20 d，菌落數顯著增長(P<0.01)，達到最大值9.25 lg CFU/mL，可能的原因是：在發酵的前5 d里，微生物的生長受到鹽濃度的限制，一些不耐鹽的細菌、酵母菌等死亡，使得初期微生物增長緩慢[24]。在發酵中期菌落總數快速上升，可能是因為一些耐鹽菌適應環境并迅速增長。在發酵的后期微生物數顯著下降(P<0.01)，可能是因為醬醪的pH、營養物質、滲透壓等抑制了微生物的生長繁殖。通過對比空白組與實驗組可知，2株降解菌在發酵醬醪中保持著一定存活力和生長能力，這為降胺菌發揮作用創造了條件[25]。

表4 醬油釀造過程中總好氧微生物總數的變化Table 4 The change of the total number of bacterial colonies in soy sauce brewing process

4 結論

從開始發酵到發酵結束pH的變化大小排序是K>J2>J3，其中，W.anomalus、M.farinosa的pH范圍基本符合醬油產品的pH范圍；發酵過程中食鹽的含量對微生物的生長具有較大的影響，但在實驗中NaCl濃度發酵前后沒有顯著差異(P<0.05)；通過游離氨基酸的分析我們可以知道發酵醬油品質的變化，從實驗中可得，生物胺降解菌的加入對醬油的風味并沒有產生較大影響。

2株降胺菌對醬油發酵過程中的生物胺均具有一定的抑制效果，W.anomalus菌株在組胺、酪胺、亞精胺的降解方面優于M.farinosa；對發酵過程的pH略有影響；對于NaCl濃度和氨基酸含量影響不大；氨基酸態氮和TVB-N的含量在醬油發酵過程中呈現上升的趨勢；發酵過程中微生物數的統計分析可得：2株菌在發酵醬醪中均保持著一定存活力和生長能力，這為該菌在工業生產中的擴大應用創造了條件。