KCl部分替代NaCl對臘肉蛋白質氧化、降解及質構的影響

甘瀟，李洪軍,2，王兆明，周心雅，賀稚非,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400715)

NaCl是腌臘肉制品的必需配料。由于高鈉鹽的過度攝入有導致發生高血壓，中風和冠心病的風險[1]，因此國內外食品工作者一直致力于低鹽腌臘肉制品的研究工作[2-5]。低鹽肉制品的研究旨在保持傳統肉制品品質的基礎上最大化地降低NaCl的含量。KCl是減少腌臘肉制品中氯化鈉含量的最廣泛研究的鈉鹽替代品。大量研究報道指出，KCl的適度替代對腌臘肉制品的品質不會造成明顯的不利影響[6-8]。

在臘肉生產過程中，蛋白質氧化與降解是形成臘肉特征色澤、風味及質構品質的必要步驟。蛋白質氧化誘導的結構修飾可以改變蛋白質功能并因此影響肉制品的質量，尤其是在肉制品加工過程中，機械作用會破壞細胞的整體結構并打破其抗氧化防御體系，導致蛋白質氧化的高度敏感性[9]，蛋白質氧化對肉制品的持水力，凝膠特性[10]和質構特性[11]等都會有一定的影響。大量的研究報道指出脂質氧化是腌臘肉制品揮發性風味物質的重要來源[12-13]，但是，近年來越來越多的研究發現蛋白質降解對腌臘肉制品的風味形成起著重要的作用，降解過程中部分大分子的蛋白質分解為低分子物質，如肽、氨基酸、醛類等，這些物質或本身屬于風味物質，或者是風味物質的重要前體物質，風味前體物質通過進一步的Strecker降解反應或美拉德反應生成風味化合物[14-15]，不同途徑產生的風味化合物質共同構成了臘肉的特征風味物質。而關于低鈉鹽臘肉是否會對蛋白質氧化、蛋白質降解產生影響，進而影響臘肉品質特性的研究較少，其作用機理尚不清晰。本文是以鉀鹽不同比例替代鈉鹽的臘肉樣品為研究對象，考察低鈉鹽對臘肉制品蛋白質氧化、降解及臘肉制品質構的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和輔料

冷鮮豬后腿肉、食鹽、花椒粉、料酒、白糖等，購于重慶市北碚區永輝超市。

1.1.2 藥品試劑

KCl、異抗壞血酸鈉、NaNO2，均購于河南巧手食品添加劑有限公司；Ⅱ-普通山楂核煙熏香味料(食品級)，購于濟南華魯食品有限公司；電泳試劑盒，購自索萊寶生物科技有限公司；牛血清蛋白為生化試劑；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-2450紫外分光光度計，日本島津公司；CT-3質構儀，美國brookfield公司；L-8900 全自動氨基酸分析儀，日本日立高新技術公司；BSA323S 電子分析天平，賽多利斯科學儀器有限公司；酸度計，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；臺式高速離心機，德國Eppendorf公司；ZWY-2102C 恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；XHF-D內切式勻漿機，寧波新芝生物科技股份有限公司；Elix10 純水機美國密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 加工工藝及樣品準備

冷鮮豬二刀后腿肉分割為長(15±2) cm，寬(5±0.5) cm 的長方形塊狀，去除淤血、筋膜等。按照KCl質量分數替代NaCl比例的不同將分割的肉塊平均分成四處理組：對照組(0% KCl,100% NaCl)，A處理組(30% KCl,70% NaCl)，B處理組(50% KCl,50%NaCl)，C處理組(70% KCl,30% NaCl)，各處理組總鹽含量為肉重的4%，輔以料酒、花椒粉等香料采用液腌法(具體配方見表1)在溫度10 ℃的氣候箱腌制4 d，每天翻動1次。腌制后的肉塊用30 ℃ 左右的熱水進行清洗，除去雜物。晾干水分后，將肉浸漬到濃度為5%的Ⅱ-普通山楂核煙熏香味料溶液中液熏180 min。液熏后瀝干水分放入50 ℃烘箱烘烤48 h，烘烤中每天翻動1次肉塊使受熱均勻。烘烤結束后移出烘箱，10 ℃室內攤涼降溫后即為成品[16]。

表1 臘肉腌制配方 單位：gTable 1 Formulations of cured meat

1.3.2 TPA質構分析

參考王兆明等[17]的方法略做修改，肉塊切成長、寬、高1 cm的正方體，應用CT-3質構分析儀(美國Brookfield公司)進行分析測試，利用Texture Loader軟件加以控制。測定方法選用TPA質構分析，測定參數如下，探頭：TA9，目標：40%，觸發點負載：5 g，測試速度：1.00 mm/s，返回速度1.00 mm/s，循環次數：2.0。

1.3.3 蛋白羰基含量檢測

參考SOGLIA等[18]的方法適當修改后測定羰基含量。取1 g絞碎臘肉樣品，加入10 mL冰浴KCl溶液(0.15 mol/L)，3 000 r/min條件下均質處理60 s。取2份100 μL的均質液，分別加入1 mL三氯乙酸溶液(200 g/L)。隨后在5 000×g條件下離心5 min，移除上清液，加入400 μL十二烷基磺酸鈉溶液(50 g/L)。將得到的2份混合樣品同時超聲處理60 min后，一份樣品用800 μL的HCl(2 mol/L，含質量濃度為2 g/L的2,4-二硝基苯肼(DNPH))處理，另一份樣品用800 μL的HCl(2 mol/L)處理后作為空白。放置30 min后，加入400 μL的三氯乙酸溶液(400 g/L)，在5 000×g條件下離心5 min。小心棄去上清液，在沉淀中加入1 mL體積比為1∶1的乙醇-乙酸乙酯混合液，并在10 000×g條件下離心處理5 min。重復上述操作3次后，在沉淀中加入1.5 mL的NaH2PO4(pH 6.5，20 mmol/L，含有6 mol/L的鹽酸胍)。待蛋白質溶解后在4 ℃條件下放置12 h，分別在280和370 nm處測定吸光度。

1.3.4 鹽溶性蛋白質的提取

參考VILLAVERDE等[19]的方法進行鹽溶性蛋白質的提取。稱取5 g絞碎臘肉樣于50 mL離心管中，加入25 mL 50 mmol/L，pH 7.0的磷酸鹽緩沖液，10 000×g均質1 min，然后于9 700×g，4 ℃離心15 min，棄上清，向沉淀中加入25 mL 50 mmol/L，含0.6 mol/L NaCl，pH 7.0的磷酸鹽緩沖液10 000 r/min均質1 min，然后于9 700×g，4 ℃離心15 min，上清液即為鹽溶性蛋白。

1.3.5 SDS-PAGE電泳分析

參考HUANG等[20]的方法稍作修改進行測試，提取的鹽溶性蛋白用雙縮脲法測定蛋白質含量。蛋白質量濃度調整至2 g/L。取0.8 mL蛋白質溶液加入0.2 mL含1% β-巰基乙醇的樣品緩沖液，隨后在沸水條件下加熱3 min。分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%均按照索萊寶生物科技有限公司電泳試劑盒配方進行制備。取10 μL樣品和5 μL標準蛋白上樣。凝膠用小型的Bio-Rad蛋白電泳儀做分離，濃縮膠時恒流15 mA，分離膠時恒流25 mA，當指示劑遷移至距離膠底部1 cm處時停止電泳。分離膠染色30 min后于脫色液中30 ℃恒溫震搖脫色12 h至背景顏色退凈。

1.3.6 游離氨基酸的檢測

參考LORENZO等[21]的方法修改進行游離氨基酸的檢測。絞碎肉樣30 g，60 ℃烘干粉碎，取1 g粉末樣品加入20 mL體積分數為75%的酒精，80 ℃水浴萃取1 h，上清收集于小燒杯，重復3次，并且在水浴上蒸發掉酒精，剩余液體移入分液漏斗，加入10 mL乙醚萃取脂肪，水層于水浴上蒸干，再用20 mmol/L鹽酸洗入50 mL容量瓶并定容，5 000×g，4 ℃離心15 min。上清液采用日本日立高新技術公司的L-9800全自動氨基酸分析儀進行游離氨基酸含量檢測，上機檢測之前通過0.22 μm的過濾器進行樣品的注射過濾。

1.3.7 TBA值檢測

參考WANG等[22]的方法適當修改，稱取研磨均勻的肉樣10 g，置100 mL具塞三角瓶內，加入50 mL 7.5%三氯乙酸(含1 g/L EDTA)水浴振搖30 min，雙層濾紙過濾，移取上清液5 mL置于25 mL比色管內，加入5 mL 20 mmol/L的TBA，加塞混勻，90 ℃水浴保溫40 min，取出冷卻1 h，移入小試管1 600×g離心5 min， 上清液傾入25 mL比色管，加入5 mL氯仿搖勻、靜置、分層，吸取上清分別在532 nm和600 nm波長比色，記錄吸光值，運用公式(1)進行TBA值計算：

(1)

其中A532和A600分別表示在532 nm和600 nm波長下的吸光度值。

1.4 數據分析

所有測試重復3次操作取得數據，運用SPSS19.0進行單因素方差(analysis of variance，ANOVA)分析、Pearson相關性分析，用Orign8.6作圖。

2 結果與分析

2.1 低鹽臘肉的質構分析

TPA質構分析是通過模擬人的口腔咀嚼原理，對測試樣品進行2次壓縮穿刺，然后通過計算機輸出測試曲線進行分析各指標特性[23]。硬度是指改變食品形狀所需的力，表示為測試時第一次穿沖樣品時的最大峰值；彈性反映在外力作用下變形及去力后的恢復程度，表示為第二次穿刺樣品時的測量高度與第一次測量高度的商；膠著性指將半固體食品嚼爛至可吞咽需做的功；咀嚼性表示硬度，內聚性和彈性的積，是指將固體食品嚼碎至可吞咽狀態需要做的功[24]。低鹽臘肉質構特性如圖1所示。由圖1可知，KCl替代比例達到70%臘肉組的硬度、膠著性和咀嚼性均顯著高于其他處理組(P< 0.05)，KCl替代50%、70%組彈性顯著高于對照組(P< 0.05)。

圖1 低鹽臘肉質構(硬度、彈性、膠著性、咀嚼性)分析Fig.1 Analysis of low salt bacon texture(hardness,elasticity,gumminess,chewiness)

本實驗中質構特性的變化可解釋為，隨著鉀鹽的高濃度替代(70%)，由于KCl分子質量大于NaCl，總離子強度減弱使得鹽溶性蛋白減少及持水力下降[25]，從而導致臘肉樣品含水量降低，硬度、膠著性和咀嚼性等質構特性增加。相似的研究結果也有報道，如COMFORT等[26]研究指出鹽溶性牛肉蛋白的凝膠強度在鉀存在下最強，其次是NaCl和CaCl2。HORITA等[25]研究發現KCl 50%替代的法蘭克福香腸硬度、內聚性和咀嚼性均顯著高于對照組，與本實驗的研究結果一致。

2.2 低鹽臘肉蛋白羰基含量分析

低鹽臘肉總蛋白羰基含量如圖2所示。由圖2可知，隨著KCl替代比例的增加，總蛋白羰基含量呈增加趨勢，50%和70% KCl替代臘肉樣總蛋白羰基含量顯著高于對照組(P< 0.05)。羰基化是蛋白質發生的不可逆非酶促修飾，涉及由氧化應激和其他機制誘導的羰基部分形成的[28]。蛋白羰基的形成途徑有：直接從賴氨酸，蘇氨酸，精氨酸和脯氨酸側鏈氧化形成[29]。

圖2 低鹽臘肉蛋白羰基含量Fig.2 Protein carbonyl content of low salt bacon

在還原糖存在的非酶糖化[30]；通過α-酰胺化途徑或通過谷氨?；鶄孺湹难趸瘜﹄墓羌苓M行氧化裂解形成[28]；與非蛋白質羰基化合物如4-羥基-2壬烯醛(HNE)或丙二醛(MDA)共價結合形成[31]。其中色氨酸、賴氨酸等敏感氨基酸側鏈的直接氧化是蛋白質羰基化的主要途徑，羰基是蛋白質氧化的主要產物[32]。目前關于蛋白羰基的檢測用得最普遍的是2,4-二硝基苯肼(DNPH)偶聯方法[33-34]，盡管在此方法的檢測中，脂質氧化產生的羰基不可避免的會對蛋白羰基結果造成一定的影響，但是就目前可查的文獻來看，還未能解決該方法存在的此弊端。另外西班牙研究團隊ESTEVEA等[35]認為特殊的半醛α-氨基己二酸半醛(AAS)和谷氨酰胺半醛(GGS)可以反映總羰基含量的60%，因此也被用來衡量蛋白氧化。本試驗中不同含鹽量的臘肉羰基含量的不同說明蛋白質氧化程度有所差異。由圖2可見，高濃度的KCl替代促進了臘肉蛋白質氧化的發生，目前為止，KCl促進蛋白氧化的作用機理尚不清晰，鑒于此，我們接下來的實驗將對KCl促進蛋白質氧化的發生機理進行深入的研究。

2.3 低鹽臘肉SDS-PAGE電泳分析

不同鹽濃度含量臘肉SDS-PAGE電泳圖譜如圖3所示。如圖可見，各處理組電泳條帶濃度和條帶密度都較少，說明各處理組都發生了不同程度的蛋白質降解。在臘肉加工過程中，尤其是腌制階段鹽離子的作用及高溫烘烤階段溫度的升高都促進了蛋白降解[36]。此外，對照組可見比較清晰的肌球蛋白重鏈電泳條帶和濃度較低的副肌球蛋白條帶及模糊的原肌球蛋白條帶，30% KCl替代組只有肌球蛋白重鏈電泳條帶清晰可見，而副肌球蛋白和原肌球蛋白條帶已消失不見。50%和70% KCl替代組肌球蛋白重鏈，副肌球蛋白和原肌球蛋白電泳條帶均完全消失。

M-marker; C-對照組;Ⅰ-30% KCl替代組;Ⅱ-50% KCl替代組;Ⅲ-70% KCl替代組;MHC-肌球蛋白重鏈;paramyosin-副肌球蛋白;actin-肌動蛋白;troponysin-肌鈣蛋白圖3 低鹽臘肉SDS-PAGE電泳分析圖Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis analysis of low salt bacon

說明50%和70% KCl替代組臘肉發生了比對照組更劇烈的蛋白質降解，說明鉀鹽的高濃度替代一定程度上促進了蛋白質的降解。蛋白質降解是肉的內源蛋白酶和微生物酶共同作用的結果，內源酶將大分子蛋白質降解為小分子的多肽后，微生物酶再將多肽降解為分子質量更小的小肽及氨基酸[37-38]。研究證明鉀離子能夠改變細胞膜的通透性，增加多肽往微生物細胞膜內的流量，從而增加微生物細胞對多肽的水解[39]，釋放更小的肽和游離氨基酸，最終達到促進蛋白質降解的作用。

2.4 低鹽臘肉游離氨基酸含量檢測

游離氨基酸經常作為風味活性化合物，其他風味成分的前體和蛋白水解活性的定量指標，用于衡量蛋白質降解程度及檢查加工肉制品品質[40]。不同鹽濃度臘肉總游離氨基酸含量如圖4所示。

圖4 低鹽臘肉總游離氨基酸含量Fig.4 Total free amino acid content of low salt bacon

由圖4可知，70% KCl替代組臘肉總游離氨基酸含量顯著高于其他各處理組(P<0.05)。說明70% KCl替代組臘肉發生了更顯著的降解反應。這與SDS-PAGE電泳分析的結果相吻合。ARMENTEROS等[41]研究發現分別用不同比例的KCl,MgCl2和CaCl2替代NaCl后的干腌肉制品總游離氨基酸含量顯著高于對照組，與本實驗研究結果一致。

2.5 低鹽臘肉TBARS分析

圖5展示的是不同鹽濃度臘肉的TBARS值。TBARS通常作為脂質氧化的指示劑，可通過檢查與TBA反應物質，如丙二醛和揮發性化合物的形成來評估次級脂質氧化產物。TBA測試通過分光光度法定量測定肉樣中的MDA含量以衡量樣品脂質氧化程度。

圖5 低鹽臘肉TBARS值Fig.5 TBARS value of low salt bacon

由圖5可知，不同鹽含量處理組TBARS值無顯著變化，說明本實驗條件下KCl的替代對脂質氧化沒有顯著影響。這與ANDRES等[42]的研究結果一致，他們的研究指出，3%～6%(質量分數)的鹽在干腌火腿中呈現出較小的促氧化作用，而本實驗臘肉的鹽含量在此范圍內，因此脂肪氧化反應沒有受鉀鹽替代的顯著影響。

2.6 低鹽臘肉蛋白質氧化、蛋白質降解與臘肉質構的相關性分析

表2為低鹽臘肉蛋白質氧化、蛋白質降解、脂肪氧化和質構特性等指標的相關性分析。由表2可知，蛋白羰基與彈性和咀嚼性之間具有極顯著的正相關性(R2=0.957,P< 0.000 1;R2=0.809,P=0.001)，與硬度和膠著性也存在顯著相關性，說明蛋白質氧化和肉樣質構之間存在一定的正相關性。其相關性可解釋為蛋白質氧化導致肌肉樣品中相鄰纖維之間的細胞外空間增大，蛋白持水力降低使得肉制品硬度增強[10]。另外ZHANG等[9]研究表明，蛋白質氧化能夠增加蛋白的凝膠形成能力，這可能與多肽之間和蛋白質之間的交聯形成有關，這些交聯可以降低凝膠網絡的流動性，穩定凝膠基質內的其他非共價鍵，從而提高肉品的膠著性，彈性及咀嚼性等質構特性。

表2 低鹽臘肉蛋白質氧化、蛋白質降解與質構之間的Pearson相關性Table 2 Pearson correlation between protein oxidation,protein degradation and texture of low-salt bacon

注：*表示P<0.05差異顯著；**表示P<0.01差異極顯著。

此外，由表2可知，游離氨基酸與硬度之間存在極顯著正相關性(R2=0.736,P=0.006)，而與彈性，膠著性和咀嚼性無顯著相關性，說明本實驗條件下的臘肉蛋白質降解與肉樣的硬度存在顯著的正相關性，說明本實驗條件下的低鹽臘肉未發生過度蛋白質降解導致的臘肉制品異常柔軟而影響肉制品品質[43-44]。蛋白質氧化和蛋白質降解是臘肉加工過程中的特征反應，其作用不僅體現在臘肉風味的形成，更對臘肉質構形成有重要的影響作用[45]。另外，由表2可知，TBARS與質構各指標存在負相關性(P>0.05)，這與報道的相關研究結果一致，脂肪氧化對肉制品質構形成作用不明顯，而更多的體現在對肉制品風味貢獻的作用[46]，脂肪氧化產生大量的揮發性化合物及風味前體物質[47]，這些風味前體物質進一步與氨基酸，美拉德反應中間產物或其他化合物反應形成臘肉制品的特征風味物質。

3 結論

隨著KCl替代NaCl濃度的增加，低鹽臘肉制品的蛋白質氧化，蛋白質降解及臘肉制品質構特性均發生著不同程度的改變。TAP分析發現鉀鹽低濃度替代對肉制品的質構沒有顯著影響，而70%鉀鹽替代會顯著提高肉樣的硬度，彈性，膠著性和咀嚼性。蛋白羰基，SDS-PAGE電泳和總游離氨基酸測試結果顯示，高濃度(70%)的鉀鹽替代會促進蛋白質氧化和蛋白質降解。另外，通過對蛋白質氧化、蛋白質降解、脂肪氧化和質構特性等指標的相關性分析發現蛋白質氧化，蛋白質降解對臘肉制品的質構形成有重要作用。