用于水產品中甲醛、雙氧水和二氧化硫同時快速檢測的微流控芯片系統研制

周新麗，申炳陽，孔兵，高麗娟，馮羅蘭，王振華,3，葉嘉明,3*

1(上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海，200093) 2(浙江清華長三角研究院 分析測試中心，浙江 嘉興，314006) 3(國家食品安全風險評估中心 應用技術合作中心，浙江 嘉興，314006)

水產品營養豐富、味道鮮美，是人類食物的重要來源。近年來，隨著人們生活水平的提高，在注重水產品營養價值的同時，其安全性也越來越受到人們的關注[1]。目前我國水產品質量安全存在的問題主要是違規加入非法添加物，以及過量使用食品添加劑。

食品中非法添加物是指國家食品安全標準中規定添加范圍之外而添加到食品中的物質[2]，比如向水產品中加入甲醛、雙氧水等非法添加物，可以延長保質期，增加持水性和韌性，同時也增加了水產品的毒性，誤食可使人致癌，嚴重時致人死亡[3-4]。食品添加劑是為改善食品品質和色、香、味以及為防腐、保鮮和加工工藝的需要而加入食品中的人工合成或者天然物質，國家衛生健康委員會頒布的《GB 2760—2014食品添加劑使用標準》規定了食品添加劑的使用原則、允許使用的食品添加劑品種、使用范圍及最大使用量或殘留量[5]。在水產品中加入SO2食品添加劑，可以達到保鮮、延長貨架期的目的，但如果人體過量攝入SO2，會影響Ca、P吸收，導致免疫力低下，SO2還可與血液中的硫胺素結合，導致腦、肝、脾等器官發生病變[6-7]。

用于食品中添加物檢測的方法有兩大類，一類是精密儀器分析方法，主要包括高效液相色譜法、色譜-質譜聯用法、離子色譜法、毛細管電泳法等[8-12]；另一類是快速檢測方法，以分光光度法、比色法為代表。精密儀器分析方法具有較高的精度和靈敏度，但存在檢測成本高、步驟繁瑣、檢測時間長、需要專業人員操作等問題，難以滿足對添加物進行現場、快速、微量化、便攜化的檢測需要[13-14]?，F有的快速檢測方法主要是基于理化顯色反應，結合光度分析原理進行檢測，一般采用比色卡人眼判讀結果，可用于現場快速檢測，但準確度差，只能用于定性分析；而采用分光光度法雖能實現定量分析，但檢測步驟略繁瑣，并需要專業人員操作。更主要的是，上述2種快速檢測方法檢測指標單一，難以實現水產品中添加物的多指標同時測定。相比之下，近幾年發展起來的微流控芯片技術，不僅能夠極大降低試劑的消耗量，同時還具有分析速度快、檢測通量高、設備體積小、自動化程度高、非專業人員使用、成本低等優點，有望在食品安全快速檢測領域獲得廣泛的應用[15-19]。

本文將微流控技術用于水產品中甲醛、雙氧水和SO2的快速檢測，使用一次性的扇形高聚物微流控芯片，配合自行研制的便攜式微流控速測儀，旨在實現對水產品中添加物的全自動、高通量、低成本的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芯片材料：光學級聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate，PMMA)板材，0.5 mm、4.0 mm兩種厚度規格，購于蘇州揚清芯片科技有限公司。

試劑：甲醛、雙氧水、SO2標準品，均采購自國家標準物質中心；NaOH，購自無錫市佳妮化工有限公司；間苯三酚，購自麥克林公司；雙氧水、吊白塊快速檢測試劑盒，均購自杭州天邁生物科技有限公司。

間苯三酚堿溶液：稱取8.0 g NaOH，溶于25 mL蒸餾水中，待完全冷卻后，加入0.810 7 g間苯三酚充分溶解，最后轉移到50 mL容量瓶中定容，混勻備用。

1.2 儀器與設備

YoungLaser-V12型二氧化碳激光芯片雕刻機，蘇州揚清芯片科技有限公司；DW系列超低溫保存箱(-86 ℃)，海爾生物醫療公司；Scientz-N型真空冷凍干燥機，寧波新芝生物技術股份有限公司；FA 1604電子天平，上海精科實業有限公司；Milli-Q超純水系統(18 MΩ)，美國Millipore公司；U-2900型紫外可見分光光度計，日立高新技術公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 檢測原理

根據分光光度原理，甲醛在堿性條件下與間苯三酚發生縮合反應生成橘紅色化合物，可以在便攜式微流控速測儀上測定470 nm處的吸光度來定量分析甲醛含量[20]。同理，根據雙氧水快速檢測試劑盒的操作說明書，雙氧水在酸性溶液中與鈦離子生成穩定的橙色絡合物，可在便攜式微流控速測儀上測定410 nm處的吸光度來定量分析雙氧水含量[21]；根據吊白塊快速檢測試劑盒的操作說明書，SO2溶于水后生成的亞硫酸根離子將二價銅離子還原為亞銅離子，亞銅離子和新銅試劑形成黃色配合物，可在速測儀上測定410 nm處的吸光度來定量分析SO2含量[22]。

1.3.2 芯片的設計與制作

如圖1-A所示，本實驗所設計的扇形微流控芯片由3層基片組成，扇形半徑48 mm，蓋板、通道層、底板分別為厚度0.5、4.0、0.5 mm的PMMA基片。扇形微流控芯片由芯片固定孔、進樣區、儲液區、檢測區、球閥、廢液區、通氣孔和進樣孔構成(圖1-B)，其中，進樣區、儲液區、檢測區、廢液區的體積分別為360、100、100、120 μL。

芯片的制作過程如下：首先，用SolidWorks軟件設計芯片各層的結構圖案；其次，通過二氧化碳激光芯片雕刻機直接在PMMA基片上加工結構圖案和微通道，同時切割獲得蓋板基片和底板基片；最后，將蓋板基片、通道層基片和底板基片鍵合，制得一次性扇形微流控芯片。

1-芯片固定孔；2-進樣區；3-儲液區；4a-甲醛檢測區；4b-雙氧水檢測區；4c-SO2檢測區；5-球閥；6-廢液區； 7-通氣孔；8-進樣孔圖1 扇形微流控芯片三維結構示意圖(A)和平面結構示意圖(B)Fig.1 Three-dimensional structure schematic diagram of fan-shaped microfluidic chip(A) and schematic diagram of plane structure(B)

1.3.3 試劑預存儲

鍵合芯片之前，采用真空冷凍干燥法將所需試劑預先固定在芯片檢測區中[23]，具體操作方法如下：在圖1-B所示芯片的檢測區4a、4b、4c中依次加入3 μL間苯三酚堿溶液、10 μL雙氧水快速檢測試劑盒中的試劑A、10 μL吊白塊快速檢測試劑盒中的試劑D，分別用于甲醛，雙氧水和SO2的快速檢測，在超低溫保存箱-80 ℃下預凍30 min，之后置于真空冷凍干燥機內冷凍干燥2 h，獲得預存儲檢測試劑的微流控芯片。

1.3.4 自行研制的便攜式微流控速測儀

便攜式微流控速測儀如圖2-A所示，其基本組成包括光電檢測模塊、旋轉系統(離心模塊)和數據處理等模塊(圖2-B)。其中，光電檢測模塊由LED光源、光通路和光電池感應器組成；旋轉系統包括電機和芯軸。應用時，旋轉系統帶動微流控芯片轉動，一定時間后轉動停止，LED光源將會與芯片上特定的檢測區對準，通過光電池感應器讀取信號，再經過數據處理模塊，得到檢測區的吸光度值。

注：1-微流控芯片；2-芯軸；3-電機；4-LED光源；5-光通路；6-光電池感應器圖2 便攜式微流控速測儀外觀(A)及系統組成示意圖(B)Fig.2 Appearance of portable microfluidic tachymeter(A) and schematic diagram of the system composition(B)

1.3.5 流體的操控

微流控芯片的基本特征是集成多種操作單元于整體可控的微小平臺上，進而實現微量液體在芯片內部的精密、可控轉移[24]。如圖3所示，用移液槍將待檢液加入進樣區(步驟1)；通過調節離心模塊的旋轉方向及轉速大小，精準地操控待檢液等量分成3份轉移至儲液區，多余的待檢液將被轉移至廢液區(步驟2)；最后，儲液區的待檢液離心至檢測區，進行顯色反應及檢測(步驟3)，從而完成樣品的檢測過程。

圖3 微流控芯片上的流體驅動過程Fig.3 Fluid-driven process on microfluidic chips

1.3.6 反應動力學

甲醛、雙氧水、SO2的實驗濃度分別選擇5、5、1 mg/L， 以添加物反應時間為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制3種添加物的反應動力學曲線，選擇動力學曲線上的合適時間為系統的檢測時間。

1.3.7 系統考察

1.3.7.1 標準曲線的建立

分別采用不同濃度的甲醛、雙氧水、SO2溶液進行實驗考察，以添加物濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，使用Origin 9.0軟件進行線性擬合分析，繪制3種添加物的標準曲線，并確定3種添加物的線性范圍，以12次空白實驗測得值的3倍標準偏差(standard deviation，SD)與其添加物標準曲線斜率的比值作為檢出限[25-27]。

1.3.7.2 加標回收實驗

為了考察方法的可靠性，進行加標回收實驗。取水產品的陰性樣品溶液，添加3種添加物——甲醛、雙氧水、SO2標準品濃度分別至5、10、20 mg/L，每個加標濃度做6個重復實驗，采用微流控芯片系統測定各樣品的濃度。計算3種添加物的6次測量濃度結果的均值和標準偏差，以回收率、相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)作為考察系統準確度和精密度的標準。

2 結果與分析

2.1 芯片結構設計及微流體操控

基于吸光度檢測原理，芯片檢測區的深度即光程長短對光學檢測結果有較大的影響，根據朗伯比爾定律，增大光程可以有效提高檢測靈敏度，另一方面，增大光程也提高了芯片材料成本和試劑消耗量[28]。綜合考慮檢測靈敏度、芯片材料成本以及試劑消耗量，選擇蓋板、通道層、底板分別為厚度0.5、4.0、0.5 mm的PMMA基片。根據多指標的檢測需要，在微流控芯片上設計了“進樣區—儲液區—檢測區”的串聯結構，其中檢測區底部固定檢測試劑，儲液區和檢測區之間以短通道連接，該通道起到“毛細管閥”的作用。為進一步避免試劑污染及各反應間的相互干擾，同時還在短通道中間加工球閥結構。

通過調節離心模塊的旋轉方向及轉速大小來操控微流體，如圖4-A所示，芯片上定量加樣360 μL時，待檢液充滿整個進樣區；當離心模塊處于低速(600～1 000 r/min，逆時針)運行狀態時，待檢液等量分成3份轉移至儲液區，但無法突破“毛細管閥”，而多余的待檢液將被轉移至廢液區(圖4-B)；當離心模塊處于高速(大于1 300 r/min，逆時針)運行狀態時，儲液區的待檢液將完全突破“毛線管閥”，進入并充滿檢測區(圖4-C)。

圖4 不同下狀態下的微流控芯片(A)加樣狀態(B)低速離心狀態(C)高速離心狀態Fig.4 Microfluidic chips under different states(A) sampling state(B) low velocity centrifugal state(C) high velocity centrifugal state

2.2 反應動力學考察

圖5顯示了微流控芯片中3種添加物的反應動力學曲線。甲醛(5 mg/L)的吸光度隨反應時間先增大后減小，吸光度在反應90 s時達到最大值，此時反應最為充分，90 s后吸光度值呈現下降趨勢；雙氧水(5 mg/L)的吸光度比較穩定，反應30 s后處于穩定狀態；SO2(1 mg/L)的吸光度在反應60 s時到達最大值，之后保持相對穩定狀態。綜合考慮3種添加物反應的動力學曲線，并盡可能保證整體檢測的準確度，確定合適的檢測時間為60～90 s。

圖5 微流控芯片中3種添加物的反應動力學曲線Fig.5 Reaction kinetics curves of three additives in microfluidic chips

2.3 系統考察

2.3.1 標準曲線的建立

圖6顯示了微流控芯片中3種添加物的標準曲線，甲醛、雙氧水、SO2的決定系數R2分別為0.998 7、0.999 4、0.999 1，擬合度較好，可用于添加物的定量檢測分析。

甲醛、雙氧水、SO2的檢出限分別為0.3、0.4、0.2 mg/L，與精密分光光度計的檢出限相差不大。

圖6 微流控芯片中3種添加物的標準曲線Fig.6 Standard curves of three kinds of additives in microfluidic chips

甲醛、雙氧水的線性范圍較寬，分別為0.5～50 mg/L、1～50 mg/L，SO2的線性范圍為0.5～30 mg/L，能夠滿足日常檢測需要。

2.3.2 加標回收實驗

表1列出了微流控芯片上的加標回收結果，所測得3種添加物的回收率在92.38%～107.98%，相對標準偏差均低于4%，表明微流控芯片系統的準確度和精密度較好，因此，便攜式微流控芯片系統可以用來進行水產品中添加物的快速、準確檢測。

表1 微流控芯片上的加標回收結果Table 1 Recoveries from spiked sample in microfluidic chips

2.3.3 方法對比

傳統快速檢測方法一般采用的是快速檢測試劑盒結合分光光度計，法測定本文提出的方法是微流控芯片結合便攜式微流控速測儀。由表2可以看出，對比傳統快速檢測方法，微流控芯片可直接將檢測試劑預存儲在芯片上，無需現場配制溶液，且加樣后自動完成整個檢測過程，操作簡便。一次性扇形微流控芯片可以同時檢測3種指標，檢測時間約為傳統快速檢測的1/4，極大地提高了檢測效率，縮短了檢測時間；樣本用量約為傳統快速檢測的1/4，試劑用量約為傳統快速檢測的1/8，但靈敏度與傳統的精密分光光度計相當。

表2 微流控技術與傳統快速檢測方法的對比Table 2 Comparison between microfluidics and traditional rapid detection methods

3 結論

本文提出了一種用于水產品中甲醛、雙氧水和SO2現場快速檢測的微流控芯片方法，使用一次性的扇形高聚物微流控芯片，配合自行研制的便攜式微流控速測儀，可實現對水產品中甲醛、雙氧水和SO2的全自動、高通量、低成本的快速檢測。微流控芯片具有以下顯著優勢：(1)自動化程度高，可直接將3種添加物檢測所需試劑預存儲于芯片內部，無需現場配制溶液，且加樣后自動完成整個檢測過程；(2)檢測效率高，每次可以同時檢測3種指標，檢測時間僅為5 min；(3)樣本及試劑消耗量少，靈敏度較好；(4)使用高聚物PMMA為芯片基材，成本低，易批量生產。此外，基于本文提出的離心式流體控制技術，還可在同一張圓盤形微流控芯片上平行集成多個扇形結構，有望實現一次性檢測多個樣本，提高檢測通量和效率。

在食品安全領域，微流控芯片不僅可用于食品中添加物的檢測，還可應用于農藥殘留[23-24]、獸藥殘留[28]、重金屬殘留[29]的監控和各種生物毒素[30-32]的分析。目前，國內的微流控芯片產品，主要是應用于農藥殘留、微生物致病菌的現場快速檢測，產業應用仍處于發展初期。隨著微流控芯片及配套儀器微型化、集成化、自動化的迅猛發展，可以預料，在不久的將來它將成為食品安全領域分析檢測主要的研究手段之一。