食品中揮發性硫化物的研究進展

程玉嬌，李貴節,2，翟雨淋，王珺，高芳進，劉光蘭，RUSSELL LEE ROUSEFF*

1(西南大學柑桔研究所，中國農業科學院柑桔研究所，重慶，400712) 2(重慶第二師范學院，重慶市功能性食品協同創新中心，重慶市功能性食品工程研究中心，重慶，400067) 3(重慶忠縣果業局，重慶，404300)

揮發性硫化物(volatile sulfur compounds,VSCs)是一類重要的芳香化學物質，對食品的特征風味或異味的產生具有重要的影響。目前已在多種食品中發現，如：蔬菜中含有異硫氰酸烯丙酯(allyl isothiocyanate，AITC)、2-仲丁基噻唑、二烯丙基三硫化物等[1-3]，水果中含有1-對孟烯-8-硫醇、3-巰基己酸戊酯、4-甲氧基-2-甲基-2-丁硫醇等[4-6]，肉制品及海鮮制品含有2-甲基-3-呋喃硫醇(2-methyl-3-furanthiol，MFT)、二甲基二硫(dimethyl disulfide，DMDS)、二甲基三硫(dimethyl trisulfide，DMTS)等[7-8]，咖啡中含有糠(基)硫醇(2-furfurylthiol，FFT)[9]，葡萄酒中含有4-巰基-4-甲基-2-戊酮(4-mercapto-4-methyl-2-pentanon，4MMP)、3-巰基己基乙酸酯(3-mercaptohexyl acetate，3MHA)等[10]。食品中VSCs閾值較低，并呈現不同的香氣特征，如：香草香、水果香、大蒜香、洋蔥香、硫磺以及臭雞蛋氣息；由于化學性質活潑、濃度低等特點，導致VSCs的分析檢測困難。研究發現VSCs即使在低濃度下也可以使食品產生特征風味或異味，影響食品質量和消費者可接受度。因此，全面認識、深入了解食品中硫化物結構、性質、生成路徑、提取方法和分析檢測技術及其感官特性，對食品風味的發展具有重要的意義。

1 結構與性質

目前，世界上已發現超過700多種含硫化合物，其中，食品中的VSCs主要包括：噻吩類化合物(約100種)、噻唑類化合物(約100種)、硫醇類化合物(約60種)、二硫醚類化合物(約100種)等[11](圖1)。

圖1 食品中VSCs的主要類型結構圖Fig.1 The main structure of VSCs in foods

食品中最常見的硫化物是DMDS，約在110種食品中出現；其他的硫化物也常出現在食品中，如二甲基硫醚(dimethyl sulfide，DMS)(約 90種)，苯并噻唑(約80種)，DMTS(約60種)，硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)(約50種)，噻唑(約30種)，乙?；邕?約30種)，2-甲基噻吩(約30種)。與硫醇類化合物相比，噻唑、噻吩、硫醚、二硫醚類化合物化學性質穩定，易于提??；而硫醇化合物的硫原子具有強極性，其酸性(PKa: 9～12)也強于相應的醇類(PKa: 15)；性質活潑，易氧化、易聚合、易與醛酮類反應等[10～12]。MUELLER等[13]發現在氧氣存在下，FFT易與羥基氫醌反應生成4-[2-呋喃甲基磺酰]羥基氫醌(4-[(2-furylmethyl)sulfanyl]hydroxyhydroquinone)和3,4-雙[2-呋喃甲基磺酰]羥基氫醌(3,4-Bis[(2-furylmethyl)sulfanyl]hydroxyhydroquinone)，繼而形成聚合物，導致失去咖啡風味。DREHER等[14]通過35 ℃貯藏橙汁8周，發現硫胺素發生降解，產生MFT，進而聚合生成雙(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚(bis(2-methyl-3-furanthiol)，MFT-MFT)，產生烤肉氣息，影響柑橘果汁風味。MURAT等[15]發現，白葡萄酒中的蛋氨酸易與乙二醛發生反應，生成3-甲硫基丙醛，繼而降解為甲硫醇(methanethiol，MTL)、DMDS，產生煮熟的白菜和洋蔥氣息。

2 主要生成路徑

2.1 源于植物或微生物的次級代謝

目前，β-裂解酶已在多種微生物體內和植物中發現，可以使半胱氨酸前驅物轉化為風味物質。4MMP，3MH，3-巰基-3-甲基-1-丁醇都是葡萄酒中的特色風味物質，是葡萄在發酵過程中，由半胱氨酸前驅物S-4-(4-甲基-2-戊酮)-L-半胱氨酸，S-3-(1-己醇)-L-半胱氨酸，S-4-(4-甲基-2-戊酮)-L-半胱氨酸亞砜，通過酵母中β裂解酶作用產生[10]。白菜在貯藏過程中，異味物質DMDS、DMTS、MTL含量會升高，這與半胱氨酸亞砜裂解酶作用有關[16]。蒜氨酸(S-allyl-L-(+)-cysteine sulfoxide，SACS)是大蒜所含有的非蛋白類的含硫氨基酸，同時也是一種生物活性物質。大蒜體內的蒜氨酸在蒜酶作用下可以轉化為大蒜素，此外，這種酶也可以將S-甲基-半胱氨酸亞砜、S-(E)-1-烯丙基-半胱氨酸亞砜和γ-谷酰(烯)基半胱氨酸轉化為相應的烷(烯)基硫代亞磺酸酯，這些硫代亞磺酸酯類物質性質活潑，不穩定，容易降解或發生重排形成多種揮發性硫化物，包括：硫醇、硫醚、二硫醚類化合物等[17]。

2.2 光照導致VSCs的產生

光化學反應主要是指物質吸收紫外(190～400 nm)或可見光(400～760 nm)，使電子處于激發態而發生的反應。食品中許多硫醇化合物都來自光降解反應，影響食品風味。GRANT-PREECE等[18]發現對光敏感的核黃素會促進蛋氨酸的降解，產生日光臭。MAUJEAN等[19]通過采用模擬太陽光照的燈對裝有香檳的玻璃瓶進行照射，發現在瓶中有H2S，MTL，DMDS物質生成。光照會引起啤酒中產生臭鼬氣息，主要是因為3-甲基-2-丁烯-1-硫醇物質產生引起的，因此，啤酒常放置于可以避光的瓶中保存。

2.3 熱反應導致VSCs的產生

半胱氨酸是許多揮發性硫化物的前體物質，在食品加工過程中，半胱氨酸與還原糖發生美拉德反應，產生FFT、2-巰基-3-戊酮、MFT，這一現象已經通過碳水化合物和半胱氨酸混合模擬試驗證實[20-21]。主要反應機理是，碳水化合物降解為二羰基化合物，與半胱氨酸發生反應，生成一系列揮發性硫化物，影響食品風味[22]。此外，蛋氨酸經過Strecker降解反應生成3-甲硫基丙醛，3-甲硫基丙醛易發生降解，生成MTL，再次被氧化成DMDS[23]。如葡萄酒中的二羰基化合物(乙二醛、丙酮醛、丁二酮、2,3-戊二酮)，可以與蛋氨酸反應，產生3-甲硫基丙醛、MTL和DMDS；同時也可以與半胱氨酸反應，產生噻唑、4-甲基噻唑、2-乙?；邕?、2-噻吩硫醇、2-呋喃甲硫醇等[23-24]。

硫胺素(又名VB1)在110～130 ℃下加熱1～6 h，易熱分解為具有燒烤、肉味的硫化物。pH、溫度和熱處理時間等因素影響硫胺素的降解路徑，最終導致不同產物的生成[25]；其中，硫胺素最主要的熱降解產物是2-甲基-3-巰基呋喃(MFT)，并易發生氧化，形成MFT-MFT，產生烤肉香氣[14]。除硫胺素的降解外，半胱氨酸和糖的美拉德反應或半胱氨酸與菊苣酮反應也可產生MFT[26]。據文獻報道，MFT和MFT-MFT化合物都是肉類物質的特征風味化合物，且都具有較低的閾值(在水中，MFT:0.007 μg/L[27],MFT-MFT: 8.9×10-11mmol/L[28])。除肉制品以外，在橙汁中也發現了MFT和MFT-MFT，導致橙汁異味的產生[29]。DREHER等[14]通過模擬硫胺素在橙汁貯藏過程中的變化發現，除了MFT和MFT-MFT外，H2S和DMS也是重要的降解產物。

2.4 形成VSCs的其他途徑

氧可導致VSCs的生成，如牛奶中蛋氨酸易被單線態氧氧化為DMDS，導致牛奶異味的產生[30]。此外，FFT是咖啡的特征風味物質，氧氣促進了FFT和酚類物質的反應，形成醌類多聚體，導致其失去咖啡風味[9]。

醇的親核取代導致VSCs的生成，如炒咖啡豆時，咖啡豆中的3-甲基-2-丁烯醇與H2S發生取代反應，生成3-甲基-2-丁烯-1-硫醇[31]。

γ輻照導致VSCs的生成，如輻照過的橙汁會產生異味，這主要與γ輻照導致橙汁中DMS，DMDS生成有關[32]。

3 樣品處理和分析檢測技術

含硫化合物種類繁多、含量較低。由于食品中復雜的基質(如碳水化合物、脂類、蛋白質等)的影響，對VSCs的提取、濃縮和檢測造成了一定的影響，含硫化合物具有多樣性的結構，從極性的硫氰酸酯和硫醇化合物到中等極性的呋喃硫醇類化合物和噻唑類化合物，結構差異導致硫化物的揮發性和溶解性具有較大的差異。此外，含硫化合物化學性質活潑，易氧化、易二聚化、并易受到溫度、酶等因素的影響，因此，VSCs的分析手段應該具有高靈敏性、高選擇性，不會導致副產物的產生和成本適中等要求。

3.1 樣品處理技術

目前，從食品的復雜基質中提取、濃縮VSCs技術主要包括：蒸餾(distillation)、液液萃取(liquid-liquid extraction，LLE)、固相微萃取(solid phase micro extraction，SPME)和動態頂空-吹掃和捕集(dynamic headspace-purge and trap,HS-PT)等。

蒸餾技術是一種最常用的從食品中分離揮發性化合物的方法。具體包括普通蒸餾法、真空蒸餾法和同時蒸餾萃取法。蒸餾技術也被常用來提取VSCs，WERKHOFF等[4]采用真空蒸餾法提取西番蓮中揮發性化合物，采用氣-質聯用(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)檢測，紅外和核磁共振進行定性分析，共檢測到47種硫化物，其中35種首次在西番蓮中發現。

LLE也常用于樣品的萃取。因硫化物結構的多樣性、物化性質差異較大，導致LLE對硫化物的萃取效率不一致(10%～95%)，易引起定量不準。在LLE基礎上，一般可以采用多種手段進行優化：如加入多個與萃取物性質相似的內標或穩定同位素標記的物質、延長萃取時間或采用多種溶劑進行萃取，都可以降低LLE萃取效率的不均勻性所帶來的定量不準確性。

SPME是一種集采樣、萃取、濃縮、進樣技術為一體，具有萃取速度較快、無溶劑使用、價格相對低廉且安全的特點，廣泛應用于樣品頂空揮發物質的直接萃取。通常，萃取頭的類型，平衡/萃取的溫度或時間，頂空/樣品的體積，攪拌子的速度，頂空中的氣體成分(氮氣或空氣)，無機鹽離子濃度等參數都會影響SPME的萃取效率。HELEN等[33]采用SPME(85μm CAR/PDMS纖維頭)萃取切達奶酪中的硫化物，優化萃取條件，并結合GC-PFPD進行分離和檢測，發現H2S、MTL、二甲亞砜、二甲基砜、DMS、DMDS、DMTS共 7種硫化物。SPME還被用來測定黑松茸中1-甲硫基丙烷、1-甲硫基丙烯[34]，以及啤酒中4MMP，3MH，3MHA[10]。SPME的高溫解析，會導致副產物的產生，同時，纖維頭上的碳分子篩含有0.9 mg/g的鐵元素，鐵化合物可作為氧化和脫氫的催化劑，會促進副產物的產生。在SPME分析過程中，硫醇化合物能夠部分被氧化為二硫化合物，DMS被氧化為DMSO[35]。有研究表明[36]，采用頂空吹掃，將氮氣代替頂空瓶中的空氣，可以降低VSCs的氧化和1-對(孟)烯-8-硫醇、(±)-2,8-環硫-順式-對孟烷化合物的環化。

HS-PT主要采用氦氣作為吹掃氣，將其通入樣品溶液中持續吹掃，樣品中揮發組分逸出，并通過捕集裝置進行濃縮。通常，升高吹掃溫度可以提高揮發性物質的逸出量，增強檢測信號值。然而，SPANIER等[37]研究發現，在吹掃期間，提高溫度會導致烹飪的牛肉中原有的物質發生分解產生副產物，影響分析結果?；钚蕴孔鳛橐环N捕集材料，可以高效地捕集硫化物，卻不易完全解析，導致回收率降低，影響硫化物的定量分析。因此，根據捕集材質和硫化物的類型，確定最大解析度和最小副產物生成的溫度至關重要。此外，可以采用硅烷化的毛細管低溫捕集器(冷阱)，利用液氮對揮發物質進行捕集冷凝，然后迅速升溫使冷凝物再次揮發，減少了副產物產生，缺點是毛細管低溫捕集器捕集能力有限。

3.2 分離檢測技術

氣相色譜通常以惰性氣體為流動相，利用樣品中的組分在色譜柱中分配系數不同而逐步實現組分分離的技術。通常與檢測器聯用，對硫化物進行分析檢測。常用檢測器包括：MS檢測器、火焰光度檢測器(flame photometric detector,FPD)、硫化學發光檢測器(sulfur chemiluminescence detector,SCD)、脈沖式火焰光度檢測器(pulsed flame photometry detector,PFPD)、原子發射光譜檢測器(atomic emission detector,AED)。

FPD是一種針對食品中低濃度硫化物，具有高選擇性和高靈敏性的檢測器。氫氣和空氣燃燒提供能量，激發硫化物使其以S2·的形式發射出波長為394 nm的特征光，因發射光是由雙分子硫引起的，所以激發光譜應與硫化物濃度的平方成正比。SUMITANI等[38]采用GC-FPD技術對溫州蜜桔果汁的風味進行測定，證實了DMS的前驅物是S-甲基甲硫氨基酸(S-methylmethionine sulfonium,MMS)，同時得出計算MMS的方法：Y(1/1.7)=0.036 36X+0.004 85，Y是DMS和內標物甲基乙基硫醚(methyl ethyl sulfide，MES))的峰面積比值，X為MMS濃度(μmol/L)。

SCD是將硫化物的化學反應和光反應相結合測定硫、氮化合物，不受基質中碳氫化合物的影響，具有較高的選擇性、靈敏性，對硫化合物等摩爾線性響應等特點。ALLEGRONE等[39]研究4種不同品種的檸檬果汁中揮發性成分的差異，采用SPME進行頂空萃取，結合GC/MS和GC-SCD/FID進行分離檢測，研究發現揮發性成分在這4種檸檬中多少的順序是Verdello Siracusano檸檬(50.28 mg/L)>Interdonato檸檬(8.39 mg/L)>Primo Fiore Capo d’Orlando檸檬(5.75 mg/L)>Femminello Siracusano檸檬(2.62 mg/L)，同時，發現檸檬果汁中含有6.5～10.1 μg/L的DMS。

PFPD是在FPD基礎上開發的硫、磷選擇性檢測器，與FPD測定硫化物相比較，檢測限(10×10-9)降低、選擇性增大、可靠性增強、操作成本更加經濟。PFPD脈沖火焰燃燒頻率3～4次/秒，碳氫化合物火焰燃燒釋放時間短暫0～2 ms，而S/P化合物燃燒釋放時間長達3～25 ms，利用時間差設置門路，提高了檢測元素的選擇性。MAHATTANATAWEE等[40]分別采用GC-O、GC-MS和GC-PFPD對3種蒸煮香米的風味物質和揮發性硫化物進行比較，在Jasmine、Basnati、Jasmati香米中分別發現26、23、22種風味化合物，其中都包括DMS、3-甲基-2-丁烯-1-硫醇、MFT、DMTS、3-甲硫基丙醛5種硫化物，對香米的風味產生重要的影響。

AED是近年來發展起來的多元素檢測器，主要是利用等離子體作為激發光源，激發被測組分，對其發射出的原子光譜進行測定，具有優越的檢測限、多元素同時測定的能力、最大線性響應值等優點，然而，等離子激發源和多波長檢測器的使用使AED成為最為昂貴的GC檢測器之一，常常運用在環境檢測上。

4 感官特征

特征風味化合物(characteristic flavor compounds，CFCs)是一類能夠代表食品自身獨特風味的化合物，有的在食品中濃度較低。其中，大部分VSCs不僅是公認的CFCs，也是引起食品異味產生的主要化合物，具有低含量和較低閾值的特點。

4.1 VSCs對風味的影響

通常，不同結構的硫化物將呈現不同的風味特征。此外，食品中某些硫化物存在手性異構體，它們的對映體風味通常各不相同。(R)-(+)-乙酸-3-巰基己酯化合物具有熱帶水果的風味，而其對映體(S型)卻具有獨特硫磺氣息和香草氣息，R型1-對孟烯-8-硫醇具有葡萄柚水果風味，而非對映體基本沒有氣味[41]。WEBER等[42]研究發現西番蓮水果中96%的乙酸-3-巰基己酯是S型。此外，VSCs在基質中的不同濃度將展現出不同的風味，在適宜的低濃度時一般呈現某種特征風味，但濃度過高就會產生硫磺味或令人反感的異味。如DMS在水中的閾值為 30 μg/L，但濃度范圍在30 ～100 μg/L的DMS，給予了lager啤酒獨特的口感和風味；當DMS濃度高于100 μg/L時，會產生一種蒸煮的甜玉米香或類似黑加侖的味道[43]。

4.2 感官特性

通常，采用香氣特性、閾值、香氣活性值(odor activity value，OAV) 反映風味物質的對樣品整體香氣的貢獻[11]。

食品中的揮發性化合物一般具有香氣特性，如蒸煮氣息、果香、油脂香、白菜香、洋蔥氣息等。食品中風味特性的確定可以采用培訓感官小組成員對食品直接進行感官分析的方法，其中，評價員培訓要遵循GB/T15549—1995和GB/T16291.1—2010。如PEREZ-CACHO等[44]培訓12位評價員(6男6女，年齡25～60歲)，針對罐裝和鮮榨不同處理的橙汁，分別對果汁中的橘香、花香、甜味、酸味、苦味等風味強度進行評分(1～5)，從而確定橙汁的風味特性。

風味物質也可以通過GC-O技術進行檢測和評判，方法包括：閾值稀釋法(Charm分析、芳香萃取物稀釋分析(aroma extract dilution analysis，AEDA))、直接強度法(時間強度法、峰后強度法)、頻率檢測法。其中AEDA法最為常用。針對食品中微量的硫化物含量，GC-O可以識別低閾值風味物質，為硫化物的識別和鑒定提供參考作用。由于硫化物的化學性質不穩定等因素，導致定量具有一定的困難性。穩定同位素稀釋法(stable isotope dilution assay,SIDA)是一種將穩定同位素標記的物質作為內標，可以有效的用于食品中硫化物的定量。將穩定同位素標記的物質作為內標，可以準確地定量榴蓮果肉中H2S(3 340 μg/kg)、MTL(26 700 μg/kg)、乙硫醇(45 400 μg/kg)和丙硫醇(3 079 μg/kg)[45]。

香氣閾值是指某種風味成分在特定介質中，使人體可以感受最低濃度。一般可以通過將風味物質溶解在溶劑中，如空氣、水、乙醇溶液、淀粉、乳液或除味的食品中，采用鼻前通路(orthonasal olfaction)和鼻后通路(retronasal olfaction)對風味成分進行測定。其中，食品中的硫化物閾值較低，對食品風味產生重要影響。

1963年由ROTHE和THOMAS定義了OAV，是香氣物質的濃度和閾值的比值[46]。OAV值一般反映物質對香氣的的貢獻值，通常OAV越大，對食品香氣的整體貢獻度就越大。GOMEZ-MIGUEZ等[47]在白酒中共發現5種硫化物，其中，MFT、FFT的OAV值分別為<0.1，4MMP、3MH、3MHA的OAV值分別為6.25、1.634、5.71。

5 結論

目前VSCs已在蔬菜、水果、海鮮、肉制品、葡萄酒、奶酪、奶粉、咖啡、薯條等食品中發現，對食品所具有的特征風味或令人厭惡的異味均具有重要的作用。深入了解VSCs與食品風味之間的關系，就必須運用VSCs自身所具有的化學性質、主要生成路徑、樣品處理技術、分析檢測技術、感官特性等技術，鑒定硫化物的種類，定量硫化物的含量，確定VSCs的結構與風味之間的關系，為VSCs在食品的風味特性、異味研究及深度開發利用方面提供參考。